Untersuchung der Strukturdynamik arbeitender F1-ATPase und ATP-Synthase aus Micrococcus luteus in Einzelschußexperimenten mit Synchrotronstrahlung

ZusammenfassungDie ATP-Synthase koppelt im Energiestoffwechsel der Zellen den Protonentransport über die biologische Membran mit der Synthese des energiespeichernden Moleküls ATP aus ADP und Phosphat. ATP-Synthasen bestehen aus 2 Subkomplexen, wobei der katalytische F1-Teil von der membranständigen Domäne abgelöst werden kann und nur zur ATP-Hydrolyse fähig ist. Der hochkooperative Reaktionsmechanismus der dreizentrigen ATP-Synthasen ist weitgehend unklar.Im Rahmen dieser Arbeit wurde der ATP-Synthasekomplex und ihr wasserlösliches katalytisches F1-Fragment aus Micrococcus luteus in präparativem Maßstab mittels chromatographischer Trennmethoden isoliert. Die Überprüfung der Funktionalität beider Enzyme erfolgte mit enzymatischen Methoden. Durch zeitaufgelöste Röntgenkleinwinkelstreuung wurde die Strukturdynamik der arbeitenden ATP-Synthase und ihres F1-Fragmentes aus Micrococcus luteus im Laufe des ATP-Hydrolysezyklus untersucht. Diese Methode diente zum Nachweis weiträumiger Konformationsänderungen innerhalb der arbeitenden Enzyme unter nativen physiologischen Bedingungen. Die zeitaufgelösten Streuexperimente fanden an der ESRF (Europäische Synchrotronstrahlungsquelle) in Grenoble (F) statt. Dort wurden für beide Enzyme im Laufe des ATP-Hydrolysezykus molekulare Bewegungen nachgewiesen. Als Referenz zu den zeitaufgelösten Messungen dienten statische Messungen zur Strukturuntersuchung der Proteine am schwächeren DESY. Anhand dieser Strukturdaten wurden Molekülmodelle der F1-ATPase und ATP-Synthase aus Micrococcus luteus konstruiert. Das Molekülmodell der F1-ATPase war die Grundlage zur Modellierung einzelner Teilschritte des ATP-Hydrolysezyklus bei 20°C. Die experimentellen Daten wurden mit einer Kippbewegung der membranseitigen Domäne der katalytischen b-Untereinheiten der F1-ATPase während des ATP-Hydrolysezyklus interpretiert.

Charakterisierung der Vinorin-Synthase aus Rauvolfia serpentina durch Reinigung, Expression, Mutation und Kristallisation

ABSTRACTDie vorliegende Arbeit befasste sich mit der Reinigung,heterologen Expression, Charakterisierung, molekularenAnalyse, Mutation und Kristallisation des EnzymsVinorin-Synthase. Das Enzym spielt eine wichtige Rolle inder Ajmalin-Biosynthese, da es in einerAcetyl-CoA-abhängigen Reaktion die Umwandlung desSarpagan-Alkaloids 16-epi-Vellosimin zu Vinorin unterBildung des Ajmalan-Grundgerüstes katalysiert. Nach der Reinigung der Vinorin-Synthase ausHybrid-Zellkulturen von Rauvolfia serpentina/Rhazya strictamit den fünf chromatographischen TrennmethodenAnionenaustauschchromatographie an SOURCE 30Q, HydrophobeInteraktionen Chromatographie an SOURCE 15PHE,Chromatographie an MacroPrep Ceramic Hydroxyapatit,Anionenaustauschchromatographie an Mono Q undGrößenausschlußchromatographie an Superdex 75 konnte dieVinorin-Synthase aus 2 kg Zellkulturgewebe 991fachangereichert werden.Das nach der Reinigung angefertigte SDS-Gel ermöglichte eineklare Zuordnung der Protein-Bande als Vinorin-Synthase.Der Verdau der Enzymbande mit der Endoproteinase LysC unddie darauffolgende Sequenzierung der Spaltpeptide führte zuvier Peptidsequenzen. Der Datenbankvergleich (SwissProt)zeigte keinerlei Homologien zu Sequenzen bekannterPflanzenenzyme. Mit degenerierten Primern, abgeleitet voneinem der erhaltenen Peptidfragmente und einer konserviertenRegion bekannter Acetyltransferasen gelang es, ein erstescDNA-Fragment der Vinorin-Synthase zu amplifizieren. Mit derMethode der RACE-PCR wurde die Nukleoidsequenzvervollständigt, was zu einem cDNA-Vollängenklon mit einerGröße von 1263 bp führte, der für ein Protein mit 421Aminosäuren (46 kDa) codiert.Das Vinorin-Synthase-Gen wurde in den pQE2-Expressionsvektorligiert, der für einen N-terminalen 6-fachen His-tagcodiert. Anschließend wurde sie erstmals erfolgreich in E.coli im mg-Maßstab exprimiert und bis zur Homogenitätgereinigt. Durch die erfolgreiche Überexpression konnte dieVinorin-Synthase eingehend charakterisiert werden. DerKM-Wert für das Substrat Gardneral wurde mit 20 µM, bzw.41.2 µM bestimmt und Vmax betrug 1 pkat, bzw. 1.71 pkat.Nach erfolgreicher Abspaltung des His-tags wurden diekinetischen Parameter erneut bestimmt (KM- Wert 7.5 µM, bzw.27.52 µM, Vmax 0.7 pkat, bzw. 1.21 pkat). Das Co-Substratzeigt einen KM- Wert von 60.5 µM (Vmax 0.6 pkat). DieVinorin-Synthase besitzt ein Temperatur-Optimum von 35 °Cund ein pH-Optimum bei 7.8.Homologievergleiche mit anderen Enzymen zeigten, dass dieVinorin-Synthase zu einer noch kleinen Familie von bisher 10Acetyltransferasen gehört. Alle Enzyme der Familie haben einHxxxD und ein DFGWG-Motiv zu 100 % konserviert. Basierendauf diesen Homologievergleichen und Inhibitorstudien wurden11 in dieser Proteinfamilie konservierte Aminosäuren gegenAlanin ausgetauscht, um so die Aminosäuren einer in derLiteratur postulierten katalytischen Triade(Ser/Cys-His-Asp) zu identifizieren.Die Mutation aller vorhandenen konservierten Serine undCysteine resultierte in keiner Mutante, die zumvollständigen Aktivitätsverlust des Enzyms führte. Nur dieMutationen H160A und D164A resultierten in einemvollständigen Aktivitätsverlust des Enzyms. Dieses Ergebniswiderlegt die Theorie einer katalytischen Triade und zeigte,dass die Aminosäuren H160A und D164A exklusiv an derkatalytischen Reaktion beteiligt sind.Zur Überprüfung dieser Ergebnisse und zur vollständigenAufklärung des Reaktionsmechanismus wurde dieVinorin-Synthase kristallisiert. Die bis jetzt erhaltenenKristalle (Kristallgröße in µm x: 150, y: 200, z: 200)gehören der Raumgruppe P212121 (orthorhombisch primitiv) anund beugen bis 3.3 Å. Da es bis jetzt keine Kristallstruktureines zur Vinorin-Synthase homologen Proteins gibt, konntedie Struktur noch nicht vollständig aufgeklärt werden. ZurLösung des Phasenproblems wird mit der Methode der multiplenanomalen Dispersion (MAD) jetzt versucht, die ersteKristallstruktur in dieser Enzymfamilie aufzuklären.

Investigating the role of single point mutations in the human proteome: a computational study

In the post genomic era with the massive production of biological data the understanding of factors affecting protein stability is one of the most important and challenging tasks for highlighting the role of mutations in relation to human maladies. The problem is at the basis of what is referred to as molecular medicine with the underlying idea that pathologies can be detailed at a molecular level. To this purpose scientific efforts focus on characterising mutations that hamper protein functions and by these affect biological processes at the basis of cell physiology. New techniques have been developed with the aim of detailing single nucleotide polymorphisms (SNPs) at large in all the human chromosomes and by this information in specific databases are exponentially increasing. Eventually mutations that can be found at the DNA level, when occurring in transcribed regions may then lead to mutated proteins and this can be a serious medical problem, largely affecting the phenotype. Bioinformatics tools are urgently needed to cope with the flood of genomic data stored in database and in order to analyse the role of SNPs at the protein level. In principle several experimental and theoretical observations are suggesting that protein stability in the solvent-protein space is responsible of the correct protein functioning. Then mutations that are found disease related during DNA analysis are often assumed to perturb protein stability as well. However so far no extensive analysis at the proteome level has investigated whether this is the case. Also computationally methods have been developed to infer whether a mutation is disease related and independently whether it affects protein stability. Therefore whether the perturbation of protein stability is related to what it is routinely referred to as a disease is still a big question mark. In this work we have tried for the first time to explore the relation among mutations at the protein level and their relevance to diseases with a large-scale computational study of the data from different databases. To this aim in the first part of the thesis for each mutation type we have derived two probabilistic indices (for 141 out of 150 possible SNPs): the perturbing index (Pp), which indicates the probability that a given mutation effects protein stability considering all the “in vitro” thermodynamic data available and the disease index (Pd), which indicates the probability of a mutation to be disease related, given all the mutations that have been clinically associated so far. We find with a robust statistics that the two indexes correlate with the exception of all the mutations that are somatic cancer related. By this each mutation of the 150 can be coded by two values that allow a direct comparison with data base information. Furthermore we also implement computational methods that starting from the protein structure is suited to predict the effect of a mutation on protein stability and find that overpasses a set of other predictors performing the same task. The predictor is based on support vector machines and takes as input protein tertiary structures. We show that the predicted data well correlate with the data from the databases. All our efforts therefore add to the SNP annotation process and more importantly found the relationship among protein stability perturbation and the human variome leading to the diseasome.

Über die Funktion und Struktur der Tyrosinase aus Streptomyces antibioticus

Für die Aufklärung der chemisch anspruchsvollen Monophenolase-Reaktion von Tyrosinasen wurde ein System entwickelt, um das Zielprotein aus dem Bakterium Streptomyces antibioticus in großen Mengen und mit hoher Reinheit zu isolieren. Zudem konnte ein hypothetischer Reaktionsmechanismus für die Monophenolase- und die Diphenolase-Aktivität der Tyrosinase formuliert werden. Die beiden Reaktionen der S. antibioticus-Tyrosinase wurden kinetisch analysiert und auf diesem Weg die Aktivität des Enzyms mit jener der sehr gut charakterisierten Tyrosinase aus dem Pilz Agaricus bisporus verglichen. Hierbei wurden signifikante Unterschiede festgestellt, die auf die verschiedenartigen Proteinstrukturen zurückgeführt wurden. Auch konnte gezeigt werden, dass einige sekundäre Pflanzenstoffe, die vor allem in Wein zu finden sind und in ihrer chemischen Struktur den Tyrosinasesubstraten ähnlich sind, die Aktivität dieses Enzyms maßgeblich beeinflussen. Das O2-Transportprotein Hämocyanin aus der Vogelspinne Eurypelma californicum, das wie die Tyrosinase zu der Familie der Typ-3-Kupferproteine gehört, ist nach chemischer Aktivierung zur Phenoloxidase zur enzymatischen Quervernetzung von Proteinen fähig. Die Tatsache, dass diese Quervernetzung auch das Hämocyanin selbst betrifft, sowie der erfolgreiche Nachweis von Hämocyanin in der Kutikula des genannten Organismus, legen die Vermutung nahe, dass die physiologische Funktion von Hämocyanin im Rahmen der Sklerotisierung des Exoskeletts in einer aktiven und passiven Beteiligung an Gerbungsprozessen im Integument besteht.

Untersuchung der Struktur und Assemblierung des Lichtsammelkomplexes II höherer Pflanzen mittels elektronenparamagnetischer Resonanz (EPR)

Der Haupt-Lichtsammelkomplex (LHCII) des Photosyntheseapparates höherer Pflanzen gehört zu den häufigsten Membranproteinen der Erde. Seine Kristallstruktur ist bekannt. Das Apoprotein kann rekombinant in Escherichia coli überexprimiert und somit molekularbiologisch vielfältig verändert werden. In Detergenzlösung besitzt das denaturierte Protein die erstaunliche Fähigkeit, sich spontan zu funktionalen Protein-Pigment-Komplexen zu organisieren, welche strukturell nahezu identisch sind mit nativem LHCII. Der Faltungsprozess findet in vitro im Zeitbereich von Sekunden bis Minuten statt und ist abhängig von der Bindung der Cofaktoren Chlorophyll a und b sowie verschiedenen Carotinoiden.rn Diese Eigenschaften machen LHCII besonders geeignet für Strukturuntersuchungen mittels der elektronenparamagnetischen Resonanz (EPR)-Spektrokopie. Diese setzt eine punktspezifische Spinmarkierung des LHCII voraus, die in dieser Arbeit zunächst optimiert wurde. Einschließlich der Beiträge Anderer stand eine breite Auswahl von über 40 spinmarkierten Mutanten des LHCII bereit, einen N-terminalen „Cys walk“ eingeschlossen. Weder der hierfür notwendige Austausch einzelner Aminosäuren noch die Anknüpfung des Spinmarkers beeinträchtigten die Funktion des LHCII. Zudem konnte ein Protokoll zur Präparation heterogen spinmarkierter LHCII-Trimere entwickelt werden, also von Trimeren, die jeweils nur ein Monomer mit einer Spinmarkierung enthalten.rn Spinmarkierte Proben des Detergenz-solubilisierten LHCII wurden unter Verwendung verschiedener EPR-Techniken strukturell analysiert. Als besonders aussagekräftig erwies sich die Messung der Wasserzugänglichkeit einzelner Aminosäurepositionen anhand der Electron Spin Echo Envelope Modulation (ESEEM). In Kombination mit der etablierten Double Electron-Electron Resonance (DEER)-Technik zur Detektion von Abständen zwischen zwei Spinmarkern wurde der membranständige Kernbereich des LHCII in Lösung eingehend untersucht und strukturell der Kristallstruktur für sehr ähnlich befunden. Die Vermessung kristallographisch nicht erfasster Bereiche nahe dem N-Terminus offenbarte die schon früher detektierte Strukturdynamik der Domäne in Abhängigkeit des Oligomerisierungsgrades. Der neue, noch zu vervollständigende Datensatz aus Abstandsverteilungen und ESEEM-Wasserzugänglichkeiten monomerer wie trimerer Proben sollte in naher Zukunft die sehr genaue Modellierung der N-terminalen Domäne des LHCII ermöglichen.rn In einem weiteren Abschnitt der Arbeit wurde die Faltung des LHCII-Apoproteins bei der LHCII-Assemblierung in vitro untersucht. Vorausgegangene fluoreszenzspektroskopi-sche Arbeiten hatten gezeigt, dass die Bindung von Chlorophyll a und b in aufeinanderfolgenden Schritten im Zeitbereich von weniger als einer Minute bzw. mehreren Minuten erfolgten. Sowohl die Wasserzugänglichkeit einzelner Aminosäurepositionen als auch Spin-Spin-Abstände änderten sich in ähnlichen Zeitbereichen. Die Daten deuten darauf hin, dass die Ausbildung der mittleren Transmembran-Helix mit der schnelleren Chlorophyll-a-Bindung einhergeht, während sich die Superhelix aus den beiden anderen Transmembranhelices erst im langsameren Schritt, zusammen mit der Chlorophyll-b-Bindung, ausbildet.rn

Komparative Analyse der humanen Chromosomenregion 11p15.3 um die Gene LMO1,TUB und der orthologen Region in der Maus

Ziel der vorliegenden Arbeit war die vergleichende Sequenzierung und nachfolgende Analyse des syntänen chromosomalen Abschnitts auf dem kurzen Arm des humanen Chromosoms 11 in der Region 11p15.3 mit den Genen LMO1, TUB und dem orthologen Genomabschnitt der Maus auf Chromosom 7 F2. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Kartierung dieser beiden chromosomalen Bereiche ermöglichte die Komplettierung einer genomischen Karte auf insgesamt über eine Megabase, die im Kooperationssequenzierprojekt der Universitäts-Kinderklinik und dem Institut für Molekulargenetik in Mainz erstellt wurde. Mit Hilfe von 28 PAC- und Cosmid-Klonen konnten in dieser Arbeit 383 kb an genomischer DNA des Menschen und mit sechs BAC- und PAC-Klonen 412 kb an genomischer DNA der Maus dargestellt werden. Dies ermöglichte erstmals die exakte Festlegung der Reihenfolge der in diesem chromosomalen Abschnitt enthaltenen Gene und die genaue Kartierung von acht STS-Markern des Menschen, bzw. vier STS-Sonden der Maus. Es zeigte sich dabei, dass die chromosomale Orientierung telomer-/centromerwärts des orthologen Bereichs in der Maus im Vergleich zum Menschen in invertierter Ausrichtung vorliegt. Die Sequenzierung von drei humanen Klonen ermöglichte die Bestimmung von 319.119 bp an zusammenhängender genomischer DNA. Dadurch konnte die genaue Lokalisation und Strukturaufklärung der Gene LMO1, ein putatives Tumorsuppressorgen, das mit der Entstehung von Leukämien assoziiert ist, und TUB, ein Transkriptionsmodulator, der in die Fettstoffwechselregulation involviert ist, vorgenommen werden. Für das murine Genom wurden 412.827 bp an neuer DNA-Sequenz durch Sequenzierung von ebenfalls drei Klonen generiert. Der im Vergleich zum Menschen ca. 100 kb größere Genombereich beinhaltete zudem die neuen Gene Stk33 und Eif3. Es handelte sich dabei um zwei Gene, die erst im Rahmen dieser Arbeit entdeckt und charakterisiert wurden. Die parallele Bearbeitung beider Genombereiche ermöglichte eine umfassende komparative Analyse nach kodierenden, funktionellen und strukturgebenden Sequenzabschnitten in beiden Spezies. Es konnten dabei für beide Organismen die Exon-Intron-Strukturen der Gene LMO1/Lmo1 und TUB/Tub geklärt. Zudem konnten vier neue Exons und zwei neue speziesspezifischer Spleißvarianten für TUB/Tub beschrieben werden. Die Identifizierung dieser neuen Spleißvarianten offenbart neue Möglichkeiten für alternative Regulation und Funktion, oder für eine veränderte Proteinstruktur, die weitere Erklärungsansätze für die Entstehung der mit diesen Genen assoziierten Erkrankungen zulässt. In der sequenzierten, größeren Genomsequenz der Maus konnte in den flankierenden, nicht mit der sequenzierten Humansequenz überlappenden Bereich das neue Gen Eif3 in seiner Exon-Intron-Struktur und die beiden letzten Exons 11 und 12 des Gens Stk33 kartiert und charakterisiert werden. Die umfangreiche Sequenzanalyse beider sequenzierter Genombereiche ergab für den Abschnitt des Menschen insgesamt 229 potentielle Exonsequenzen und für den Bereich der Maus 527 mögliche Exonbereiche. Davon konnten beim Menschen explizit 21 Exons und bei der Maus 31 Exons als exprimierte Bereiche identifiziert und experimentell mittels RT-PCR, bzw. durch cDNA-Sequenzierung verifiziert werden. Diese Abschnitte beschrieben nicht nur die Exonbereiche der oben genannten vier Gene, sondern konnten auch neuen nicht weiter definierten EST-Sequenzen zugeordnet werden. Mittels des Interspeziesvergleiches war darüber hinaus auch die Analyse der nichtkodierenden Intergen-Bereiche möglich. So konnten beispielsweise im ersten Intron des LMO1/Lmo1 sieben Sequenzbereiche mit Konservierungen von ca. 90% bestimmt werden. Auch die Charakterisierung von Promotor- und putativ regulatorischen Sequenzabschnitten konnte mit Hilfe unterschiedlicher bioinformatischer Analyse-Tools durchgeführt werden. Die konservierten Sequenzbereiche der DNA zeigen im Durchschnitt eine Homologie von mehr als 65% auf. Auch die Betrachtung der Genomorganisation zeigte Gemeinsamkeiten, die sich meist nur in ihrer graduellen Ausprägung unterschieden. So weist ein knapp 80 kb großer Bereich proximal zum humanen TUB-Gen einen deutlich erhöhten AT-Gehalt auf, der ebenso im murinen Genom nur in verkürzter Version und schwächer ausgeprägt in Erscheinung tritt. Die zusätzliche Vergleichsanalyse mit einer weiteren Spezies, den orthologen Genomabschnitten von Fugu, zeigte, dass es sich bei den untersuchten Genen LMO1 und TUB um sehr konservierte und evolutiv alte Gene handelt, deren genomisches Organisationsmuster sich auch bei den paralogen Genfamilienmitglieder innerhalb derselben Spezies wiederfindet. Insgesamt konnte durch die Kartierung, Sequenzierung und Analyse eine umfassende Datenbasis für die betrachtete Genomregion und die beschriebenen Gene generiert werden, die für zukünftige Untersuchungen und Fragestellungen wertvolle Informationen bereithält.

Biofunktionalisierung oxidischer Titanoberflächen über eine spezifische Anbindung von biotinyliertem Fibronektin für die medizinische Anwendung

In der hier vorliegenden Dissertation wird die Entwicklung und Charakterisierung einer biomimetischen Beschichtung für Titanimplantatoberflächen, insbesondere Dentalimplantate, beschrieben. Ziel war es, die Adhäsion und Aktivität von Osteoblasten auf Titanoberflächen zu steigern und so eine Beschleunigung der Implantatintegration in das Knochengewebe zu erreichen. Hierfür wurde eine spezielle Art der biomimetischen Beschichtung entwickelt, bei der biotinyliertes Fibronektin (bFn) über Streptavidin auf eine biotinylierte TiOX-Modelloberfläche immobilisiert wurde. Die Biotinmodifizierung der TiOX-Oberfläche erfolgte hierbei über einen „Self-Assembly-Prozess“ durch sequenzielle Chemiesorption von N-(6-aminohexyl)aminopropyltrimethoxysilan sowie verschiedenen Sulfo-NHS-Biotin-Derivaten, welche den Aufbau einer Streptavidin-Monolage ermöglichten. Als ein wichtiges Resultat zeigte sich, dass die Streptavidin-Monolage effektiv die unspezifische Adsorption von Proteinen an die TiOX-Oberfläche unterbindet und hierdurch die Adhäsion von Osteoblasten auf dieser unterdrückt. Dies hat den Vorteil, dass auf eine antiadhäsive Basisbeschichtung, welche für eine spezifische Zellreaktion wichtig ist, verzichtet werden kann. Dieses osteoblastere Adhäsionsverhalten änderte sich signifikant nach Anbindung von bFn an die Streptavidin-Monolage, mit dem Ergebnis, einer drastischen Steigerung der Osteoblastenadhäsion. Weiterhin besaßen Osteoblasten auf diesen Oberflächen ein Proteinexpressionsmuster, das auf eine erhöhte Osteoinduktion schließen lässt. Es zeigte sich darüber hinaus eine verstärkte Zelladhäsion sowie eine Steigerung des osteoinduktiven Effekts auf Substraten, bei denen bFn über eine Streptavidin-Monolage immobilisiert wurde, gegenüber mit nativem Fibronektin (Fn) modifizierten TiOX-Oberflächen. Ein wesentlicher Schwerpunkt bestand daher in der Analyse der Zusammensetzung und Struktur der biomimetischen Beschichtung über „Surface Plasmon Spectroscopy“ und „Atomic Force Microscopy“. Diese ergab, dass bFn und natives Fn auf den jeweiligen Oberflächen eine unterschiedliche Konformation einnimmt. Im Gegensatz zu nativem Fn, das bei der Adsorption unter physiologischen Bedingungen auf TiOX-Oberflächen eine kompakte Konformation besitzt, nimmt bFn auf einer Streptavidin-Monolage eine entfaltete Konformation ein. Bei letzterer handelt es sich um dieselbe, welche Fn in vivo innerhalb der extrazellulären Matrix besitzt. Sie unterscheidet sich von der kompakten Fn-Konformation dahingehend, dass entlang der Fn-Achse weitere Proteinbindestellen zugänglich werden und hierdurch die Zellaffinität von Fn gesteigert wird. Die nachgewiesene Konformationsänderung kann somit als Grund für die gesteigerte Osteoblasten-Adhäsion und Aktivität auf Oberflächen mit bFn angenommen werden. Diese Kenntnisse konnten weiterhin für die Optimierung des biomimetischen Schichtsystems genutzt werden. So war es möglich, durch alternierendes Inkubieren der Biotin-aktivierten Oberfläche mit Streptavidin und bFn, ein Multilayersystem gezielt aufzubauen. Der Vorteil dieses Multilayersystems gegenüber einer einfachen Monolage aus bFn besteht in einer erhöhten Stabilität der biomimetischen Beschichtung, wodurch eine Anwendung in der Praxis erleichtert würde.

Unmittelbare, dauerhafte sowie evolutionäre Anpassung an Fremdstoffexpositionen

Eine der Hauptursachen für unerwünschte oder reduzierte Wirkungen von Medikamenten ist die Induktion von Enzymen und Transportern des Medikamentenstoffwechsels. Diese Induktion stellt ursprünglich eine physiologische Reaktion auf die Aufnahme von potentiell schädlichen Fremdstoffen aus der Umwelt dar und sichert so die Gesundheit und Fortpflanzungsfähigkeit von Lebewesen. Beim Menschen sowie anderen Säugetieren werden Fremdstoffe hauptsächlich von den nukleären Rezeptoren PXR und CAR in der Leber und im Dünndarm detektiert. Zu den Medikamenten, welche über PXR und CAR wirken, gehören unter anderem Antikonvulsiva, Statine, antiretrovirale Medikamente, Glucocorticoide sowie Antimykotika. Die durch Fremdstoffe aktivierten Transkriptionsfaktoren PXR und CAR steigern die Menge der Enzyme und Transporter des Fremdstoffmetabolismus. Hierzu zählen vor allem die Cytochrom P450-Enzyme (Cyp-Enzyme) mit breitem Substratspektrum oder der Transporter MDR1, welcher eine Vielzahl von Substraten über Membranen transportiert. Durch die Biotransformation werden die induzierenden, lipophilen Substanzen so modifiziert, dass sie leichter über den Urin oder die Galle ausgeschieden werden können. \r\nDie Dauer der Induktion sollte auf die Zeit der Fremdstoffexposition beschränkt sein, um Störungen des endogenen Stoffwechsels zu vermindern. In dieser Arbeit werden jedoch Hinweise auf dauerhafte und sogar generationsübergreifende Effekte von Medikamenten in Mäusen geliefert. Nachkommen von Müttern, welche bereits vor ihrer Verpaarung einmalig mit TCPOBOP, einem Liganden des murinen CAR, injiziert wurden, hatten eine ungefähr 100-fach gesteigerte Genexpression von Cyp2b10. Auch gab es Expressionsänderungen von Genen, deren Produkte eine Rolle im Lipidstoffwechsel sowie bei Immunkrankheiten spielen. Eine Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung der injizierten Elterngeneration ergab außerdem dauerhafte Expressionsveränderungen anderer Gene des Medikamentenstoffwechsels sowie von Genen mit Verbindung zum Energiemetabolismus. \r\nBerücksichtigt man die enge evolutionäre Verwandtschaft der nukleären Rezeptoren CAR und PXR, sind Langzeitveränderungen auch für PXR möglich und wurden im Verlauf dieser Arbeit ebenfalls untersucht. Eine Hochdurchsatz-Sequenzierung ergab für Mäuse, welche mit dem PXR-Aktivator PCN induziert wurden, dass selbst noch drei Monate nach der Exposition Gene verändert exprimiert waren, welche im Zusammenhang mit Lebernekrosen stehen. Bei Nachkommen von PCN-injizierten Müttern wurden Gene unterschiedlich exprimiert, welche eine Rolle bei der Energiehomöostase sowie im Glukosestoffwechsel spielen. Im Erwachsenenalter sind bei diesen Nachkommen darüber hinaus noch Gene unterschiedlich exprimiert, deren Produkte eine Funktion in der Immunantwort haben. \r\nDa Erwachsene aufgrund ihrer Lebensdauer sowie der absoluten Krankheitshäufigkeit wesentlich öfter Kontakt mit Fremdstoffen haben, war medizinisch von besonderem Interesse, ob anhaltende Genexpressionsänderungen auch bei Erwachsenen zu beobachten sind. So konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass auch einmalig exponierte Adulttiere Gene dauerhaft verändert exprimieren und die Veränderungen im Medikamentenstoffwechsel an die nächste Generation übertrugen. \r\n\r\nBisher sind klinische Studien zur Risikobewertung von Medikamenten (Pharmakovigilanz) nicht generationsübergreifend angelegt. Diese Arbeit gibt Anstöße dafür, dass dies in Zukunft für viel mehr Medikamente notwendig werden könnte. Neben Veränderungen im Medikamentenstoffwechsel ergeben sich Nebenwirkungen von PXR- und CAR-Liganden vor allem aus ihrer Beteiligung an endogenen Stoffwechselwegen. Nach Aktivierung von CAR, welcher viele metabolische Stoffwechselwege steuert, treten beispielsweise Störungen des Energiestoffwechsels auf. Ein tieferes Verständnis der Rezeptoraktivität von CAR samt einer gezielten Modulierung seiner Aktivität würde wichtige Beiträge zum Verständnis der Regulation des Fremdstoffmetabolismus sowie der Entstehung von Nebenwirkungen durch eine Behandlung mit CAR-Liganden leisten. Dauerhafte Veränderungen endogener Stoffwechselwege könnten dann möglicherweise über eine pharmakologische Modulierung der CAR-Aktivität reduziert werden. \r\nZu diesem Zweck wurden im Verlauf dieser Arbeit die CAR-Rezeptoren der Amphibien (Xenopus tropicalis, Xenopus laevis) und Reptilien (Anolis carolinensis) erstmals kloniert, als Proteine exprimiert und charakterisiert. Vergleiche zwischen Tierarten ermöglichen ein besseres Verständnis von humanen Proteinen. Funktionelle Analysen ergaben Ähnlichkeiten des Xenopus laevis-CAR mit dem PXR der Säugetiere: eine niedrige basale Aktivität sowie eine starke Induzierbarkeit durch Liganden. In weiteren funktionellen Analysen wurden die Determinanten der basalen Aktivität des Xenopus laevis-CAR untersucht. Die basale Aktivität war nicht abhängig von der subzellulären Lokalisation, sondern ergab sich aus der Proteinstruktur, welche nur beim CAR der Landvertebraten in einer aktiven Konformation fixiert ist. Ähnlich dem PXR der Säugetiere besitzt CAR der Amphibien eine Aktivierungsdomäne, welche erst durch Ligandenbindung in eine aktive Konformation gebracht wird. Mutationen einzelner Aminosäuren zum jeweils humanen Homolog erhöhten die basale Aktivität des Xenopus laevis-CAR auf die des humanen Rezeptors. Diese Mutanten mit erhöhter basalen Aktivität zeigten eine verstärkte Interaktion mit dem Kofaktor PGC-1a, einem Regulator des Energiestoffwechsels bei Säugetieren. Die hepatischen Zielgene des CAR der Amphibien überlappen zum Teil mit den humanen Zielgenen und spielen ebenfalls eine Rolle im Energiestoffwechsel.

Funktionelle Analyse von intrazellulären Signalwegen bei der Migration der embryonalen peripheren Gliazellen von Drosophila melanogaster

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Signalwege untersucht, die an der Migration der embryona-len peripheren Gliazellen (ePG) beteiligt sind. Der Fokus lag dabei auf Myoblast city (Mbc). Zunächst wurden dazu unterschiedliche mbc Mutanten analysiert, bei denen es zu starken glialen Migrationsdefekten kommt. Um die auftretenden Phänotypen quantitativ zu analysieren, wurde eine Methode entwickelt um die Position der Pionierglia ePG9 zu bestimmen. Dies ermöglicht es, auch sehr subtile gliale Migrationsphänotypen zu detektieren. Durch knock-down Experimente konnte gezeigt werden, dass Mbc eine zellautonome Rolle bei der glialen Migration spielt. Besonders interessant ist die Tatsache, dass während der Migration der ePG eine alternativ gespleißte Isoform benötigt wird, die bisher kaum untersucht wurde. Durch Strukturvorhersagen konnte gezeigt werden, dass sich der Bereich in dem sich die beiden Isoformen unterscheiden, in einer Region liegt, die sich zu HEAT-repeats faltet. Mbc-PB scheint somit über einen Bereich zu verfügen, der im Vergleich zu Mbc-PA, zusätzliche Interaktionen erlaubt. Zudem scheint es mehrere Phosphorylierungsstellen zu geben, die für die Inaktivierung von Mbc-PB notwendig sind. Die Kinase Wallenda konnte als Kandidat identifiziert werden, der für die Phosphorylierung von Mbc-PB verantwortlich ist. Weitere Experimente zeigten eine einen zellautonomen Einfluss von Mbc-PB auf ePG7, die indirekt die Migration der Pionierglia ePG9 beeinflusst.

Deletion of P399_E401 in NADPH cytochrome P450 oxidoreductase results in partial mixed oxidase deficiency

P450 oxidoreductase (POR) is the electron donor for all microsomal P450s including steroidogenic enzymes CYP17A1, CYP19A1 and CYP21A2. We found a novel POR mutation P399_E401del in two unrelated Turkish patients with 46,XX disorder of sexual development. Recombinant POR proteins were produced in yeast and tested for their ability to support steroid metabolizing P450 activities. In comparison to wild-type POR, the P399_E401del protein was found to decrease catalytic efficiency of 21-hydroxylation of progesterone by 68%, 17α-hydroxylation of progesterone by 76%, 17,20-lyase action on 17OH-pregnenolone by 69%, aromatization of androstenedione by 85% and cytochrome c reduction activity by 80%. Protein structure analysis of the three amino acid deletion P399_E401 revealed reduced stability and flexibility of the mutant. In conclusion, P399_E401del is a novel mutation in POR that provides valuable genotype-phenotype and structure-function correlation for mutations in a different region of POR compared to previous studies. Characterization of P399_E401del provides further insight into specificity of different P450s for interaction with POR as well as nature of metabolic disruptions caused by more pronounced effect on specific P450s like CYP17A1 and aromatase.

Engineering Tocopherol Selectivity in alpha-TTP: A Combined In Vitro/In Silico Study

"We present a combined in vitro/in silico study to determine the molecular origin of the selectivity of a-tocopherol transfer" "protein (a-TTP) towards a-tocopherol. Molecular dynamics simulations combined to free energy perturbation calculations predict a binding free energy for a-tocopherol to a-TTP 8.26+2.13 kcal mol{1 lower than that of c-tocopherol. Our calculations show that c-tocopherol binds to a-TTP in a significantly distorted geometry as compared to that of the natural ligand. Variations in the hydration of the binding pocket and in the protein structure are found as well. We propose a mutation, A156L, which significantly modifies the selectivity properties of a-TTP towards the two tocopherols. In particular, our simulations predict that A156L binds preferentially to c-tocopherol, with striking structural similarities to the wild-type- a-tocopherol complex. The affinity properties are confirmed by differential scanning fluorimetry as well as in vitro competitive binding assays. Our data indicate that residue A156 is at a critical position for determination of the selectivity of a-TTP. The engineering of TTP mutants with modulating binding properties can have potential impact at industrial level for easier purification of single tocopherols from vitamin E mixtures coming from natural oils or synthetic processes. Moreover," "the identification of a c-tocopherol selective TTP offers the possibility to challenge the hypotheses for the evolutionary development of a mechanism for a-tocopherol selection in omnivorous animals."

PHYLOGENETIC ANALYSES, GENE DOSAGE EFFECT AND SELECTION IN MEMBERS OF THE LATERAL BOUNDARY DOMAIN (LBD) GENES TRANSCRIPTION FACTOR FAMILY

Wood formation is an economically and environmentally important process and has played a significant role in the evolution of terrestrial plants. Despite its significance, the molecular underpinnings of the process are still poorly understood. We have previously shown that four Lateral Boundary Domain (LBD) transcription factors have important roles in the regulation of wood formation with two (LBD1 and LBD4) involved in secondary phloem and ray cell development and two (LBD15 and LBD18) in secondary xylem formation. Here, we used comparative phylogenetic analyses to test potential roles of the four LBD genes in the evolution of woodiness. We studied the copy number and variation in DNA and amino acid sequences of the four LBDs in a wide range of woody and herbaceous plant taxa with fully sequenced and annotated genomes. LBD1 showed the highest gene copy number across the studied species, and LBD1 gene copy number was strongly and significantly correlated with the level of ray seriation. The lianas, cucumber and grape, with multiseriate ray cells showed the highest gene copy number (12 and 11, respectively). Because lianas’ growth habit requires significant twisting and bending, the less lignified ray parenchyma cells likely facilitate stem flexibility and maintenance of xylem conductivity. We further demonstrate conservation of amino acids in the LBD18 protein sequences that are specific to woody taxa. Neutrality tests showed evidence for strong purifying selection on these gene regions across various orders, indicating adaptive convergent evolution of LBD18. Structural modeling demonstrates that the conserved amino acids have a significant impact on the tertiary protein structure and thus are likely of significant functional importance.

[Mumps epidemic in vaccinated children in West Switzerland]

Since 1991, 6 years after the recommendation of universal childhood vaccination against measles, mumps, and rubella (MMR triple vaccine), Switzerland is confronted with a large number of mumps cases affecting both vaccinated and unvaccinated children. Up to 80% of the children suffering from mumps between 1991 and 1995 had previously been vaccinated, the majority with the Rubini vaccine strain. On the basis of a case-control study including 102 patients and 92 controls from the same pediatric population, a study of the humoral immune-response following vaccination with the Rubini vaccine in 6 young adult volunteers, and two different genetic studies, we investigated the complex problem of large scale vaccine failure in Switzerland. We conclude that the recently reported large number of Swiss mumps cases was caused by at least four interacting factors: 1. A vaccine coverage of 90-95% at the age of 2 years is necessary to interrupt mumps wild virus circulation. The nationwide vaccine coverage in Switzerland of some 80% in 27-36 month-old children is too low. 2. Primary vaccine failures (absence of seroconversion or unprotective low levels of neutralizing antibodies), as well as secondary vaccine failures due to the rapid decline of antibodies to mumps virus in our volunteers and controls, seem to be frequent after vaccination with the Rubini strain. 3. Despite its reported Swiss origin, the Rubini strain does not belong to the mumps virus lineages recently circulating in this area but is closely related to American mumps virus strains. 4. Differences in protein structure between the vaccine strain and the circulating wild type strains, and in particular a different neutralization epitope in the hemagglutinin neuraminidase protein, may additionally contribute to the lack of protection in vaccinated individuals.

Simulation of Drosophila circadian oscillations, mutations, and light responses by a model with VRI, PDP-1, and CLK.

A model of Drosophila circadian rhythm generation was developed to represent feedback loops based on transcriptional regulation of per, Clk (dclock), Pdp-1, and vri (vrille). The model postulates that histone acetylation kinetics make transcriptional activation a nonlinear function of [CLK]. Such a nonlinearity is essential to simulate robust circadian oscillations of transcription in our model and in previous models. Simulations suggest that two positive feedback loops involving Clk are not essential for oscillations, because oscillations of [PER] were preserved when Clk, vri, or Pdp-1 expression was fixed. However, eliminating positive feedback by fixing vri expression altered the oscillation period. Eliminating the negative feedback loop in which PER represses per expression abolished oscillations. Simulations of per or Clk null mutations, of per overexpression, and of vri, Clk, or Pdp-1 heterozygous null mutations altered model behavior in ways similar to experimental data. The model simulated a photic phase-response curve resembling experimental curves, and oscillations entrained to simulated light-dark cycles. Temperature compensation of oscillation period could be simulated if temperature elevation slowed PER nuclear entry or PER phosphorylation. The model makes experimental predictions, some of which could be tested in transgenic Drosophila.

Single-stranded DNA-binding proteins regulate the abundance of LIM domain and LIM domain-binding proteins.

The LIM domain-binding protein Ldb1 is an essential cofactor of LIM-homeodomain (LIM-HD) and LIM-only (LMO) proteins in development. The stoichiometry of Ldb1, LIM-HD, and LMO proteins is tightly controlled in the cell and is likely a critical determinant of their biological actions. Single-stranded DNA-binding proteins (SSBPs) were recently shown to interact with Ldb1 and are also important in developmental programs. We establish here that two mammalian SSBPs, SSBP2 and SSBP3, contribute to an erythroid DNA-binding complex that contains the transcription factors Tal1 and GATA-1, the LIM domain protein Lmo2, and Ldb1 and binds a bipartite E-box-GATA DNA sequence motif. In addition, SSBP2 was found to augment transcription of the Protein 4.2 (P4.2) gene, a direct target of the E-box-GATA-binding complex, in an Ldb1-dependent manner and to increase endogenous Ldb1 and Lmo2 protein levels, E-box-GATA DNA-binding activity, and P4.2 and beta-globin expression in erythroid progenitors. Finally, SSBP2 was demonstrated to inhibit Ldb1 and Lmo2 interaction with the E3 ubiquitin ligase RLIM, prevent RLIM-mediated Ldb1 ubiquitination, and protect Ldb1 and Lmo2 from proteasomal degradation. These results define a novel biochemical function for SSBPs in regulating the abundance of LIM domain and LIM domain-binding proteins.