Untersuchung der Struktur und Assemblierung des Lichtsammelkomplexes II höherer Pflanzen mittels elektronenparamagnetischer Resonanz (EPR)

Der Haupt-Lichtsammelkomplex (LHCII) des Photosyntheseapparates höherer Pflanzen gehört zu den häufigsten Membranproteinen der Erde. Seine Kristallstruktur ist bekannt. Das Apoprotein kann rekombinant in Escherichia coli überexprimiert und somit molekularbiologisch vielfältig verändert werden. In Detergenzlösung besitzt das denaturierte Protein die erstaunliche Fähigkeit, sich spontan zu funktionalen Protein-Pigment-Komplexen zu organisieren, welche strukturell nahezu identisch sind mit nativem LHCII. Der Faltungsprozess findet in vitro im Zeitbereich von Sekunden bis Minuten statt und ist abhängig von der Bindung der Cofaktoren Chlorophyll a und b sowie verschiedenen Carotinoiden.rn Diese Eigenschaften machen LHCII besonders geeignet für Strukturuntersuchungen mittels der elektronenparamagnetischen Resonanz (EPR)-Spektrokopie. Diese setzt eine punktspezifische Spinmarkierung des LHCII voraus, die in dieser Arbeit zunächst optimiert wurde. Einschließlich der Beiträge Anderer stand eine breite Auswahl von über 40 spinmarkierten Mutanten des LHCII bereit, einen N-terminalen „Cys walk“ eingeschlossen. Weder der hierfür notwendige Austausch einzelner Aminosäuren noch die Anknüpfung des Spinmarkers beeinträchtigten die Funktion des LHCII. Zudem konnte ein Protokoll zur Präparation heterogen spinmarkierter LHCII-Trimere entwickelt werden, also von Trimeren, die jeweils nur ein Monomer mit einer Spinmarkierung enthalten.rn Spinmarkierte Proben des Detergenz-solubilisierten LHCII wurden unter Verwendung verschiedener EPR-Techniken strukturell analysiert. Als besonders aussagekräftig erwies sich die Messung der Wasserzugänglichkeit einzelner Aminosäurepositionen anhand der Electron Spin Echo Envelope Modulation (ESEEM). In Kombination mit der etablierten Double Electron-Electron Resonance (DEER)-Technik zur Detektion von Abständen zwischen zwei Spinmarkern wurde der membranständige Kernbereich des LHCII in Lösung eingehend untersucht und strukturell der Kristallstruktur für sehr ähnlich befunden. Die Vermessung kristallographisch nicht erfasster Bereiche nahe dem N-Terminus offenbarte die schon früher detektierte Strukturdynamik der Domäne in Abhängigkeit des Oligomerisierungsgrades. Der neue, noch zu vervollständigende Datensatz aus Abstandsverteilungen und ESEEM-Wasserzugänglichkeiten monomerer wie trimerer Proben sollte in naher Zukunft die sehr genaue Modellierung der N-terminalen Domäne des LHCII ermöglichen.rn In einem weiteren Abschnitt der Arbeit wurde die Faltung des LHCII-Apoproteins bei der LHCII-Assemblierung in vitro untersucht. Vorausgegangene fluoreszenzspektroskopi-sche Arbeiten hatten gezeigt, dass die Bindung von Chlorophyll a und b in aufeinanderfolgenden Schritten im Zeitbereich von weniger als einer Minute bzw. mehreren Minuten erfolgten. Sowohl die Wasserzugänglichkeit einzelner Aminosäurepositionen als auch Spin-Spin-Abstände änderten sich in ähnlichen Zeitbereichen. Die Daten deuten darauf hin, dass die Ausbildung der mittleren Transmembran-Helix mit der schnelleren Chlorophyll-a-Bindung einhergeht, während sich die Superhelix aus den beiden anderen Transmembranhelices erst im langsameren Schritt, zusammen mit der Chlorophyll-b-Bindung, ausbildet.rn

The major light-harvesting chlorophyll a/b complex (LHCII) of the photosynthetic apparatus in plants largely increases the efficiency of the photosynthesis process by collecting light energy and conducting it to a photosynthetic reaction center where light-driven charge separation takes place. The apoprotein of LHCII is one of the most abundant membrane proteins on Earth. An estimated 109 t are produced per year and assembled with the photosynthetic pigments chlorophyll a, chlorophyll b, and carotenoids. The crystal structure of the protein-pigment complex is known in detail. Additionally, the recombinant apoprotein can be overex-pressed in Escherichia coli and, therefore, it can be modified by biomolecular engineering. Denatured in dodecyl sulfate, the recombinant apoprotein spontaneously folds when it is mixed with its pigments in detergent solution, and assembles into structurally authentic LHCII in the course of several minutes.rnThese characteristics qualify LHCII for an analysis of protein structure, dynamics and function by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. In a first series of experiments, site directed spin-labeling (SDSL) of LHCII was optimised to meet the demands of EPR spectroscopy. Labeling positions were chosen such that labels were facing the peptide surface to avoid structural pertubations due to steric clashes. Reconstitution of spin-labeled versions of LHCII resulted in virtually identical protein-pigment complexes without loss of function. With the kind help of Diplom students, more than 40 different spin-labeled versions of LHCII were engineered, including a “Cys walk” within the N-terminal domain. Additionally, a protocol for the preparation of heterogeneous spin-labeled LHCII-trimers was designed that consist of one labeled and two unlabeled monomers.rnThe structure of spin-labeled LHCII in detergent solution was analysed in detail using a variety of EPR monitors. Especially electron spin echo envelope modulation (ESEEM) spectroscopy, a pulsed EPR-technique used to define precisely the water accessibility of individual residues, provided significant insight in structural details. In combination with double electron-electron resonance (DEER) spectroscopy, an established technique to measure distances between pairs of spin labels, the membrane spanning protein domains in the centre of LHCII were structurally analysed, exhibiting a conformation consistent with the one in crystals. Furthermore, EPR analysis of the LHCII N terminus, not yet entirely resolved by X-ray crystallography, verified the dynamic character of this domain in response to protein oligomerisation. The combined data set, consisting of numerous ESEEM and DEER data of monomeric and trimeric samples, confirmed the assumed two-state conformation model of the N-terminal domain and leads towards a more detailed modelling approach.rnAdditionally the thesis focuses on the folding of the LHCII apoprotein during LHCII assembly in vitro. Earlier time-resolved fluorescence measurements had shown that LHCII formation in vitro occurred in at least two apparent phases; a faster one in the range of some tens of seconds and a slower one taking several minutes, represented by the binding of chlorophyll a and b, respectively. EPR-analysis of the assembly process revealed that both the water accessibility of singly spin-labeled residues and the distances between spin pairs changed within similar time scales. These data indicate that the formation of the middle transmembrane helix takes place upon a fast chlorophyll a binding step. The assembly of the central superhelical structure then occurs in a second step, triggered by the slower binding of chlorophyll b.rn