Études structurales par résonance magnétique nucléaire du ribozyme VS de Neurospora

Le ribozyme VS de Neurospora catalyse des réactions de clivage et de ligation d’un lien phosphodiester spécifique essentielles à son cycle de réplication. Il est formé de six régions hélicales (I à VI), qui se divisent en deux domaines, soit le substrat (SLI) et le domaine catalytique (tiges II à VI). Ce dernier comprend deux jonctions à trois voies qui permettent de reconnaître le substrat en tige-boucle de façon spécifique. Ce mode de reconnaissance unique pourrait être exploité pour cibler des ARN repliés pour diverses applications. Bien que le ribozyme VS ait été caractérisé biochimiquement de façon exhaustive, aucune structure à haute résolution du ribozyme complet n’a encore été publiée, ce qui limite la compréhension des mécanismes inhérents à son fonctionnement. Précédemment, une approche de divide-and-conquer a été initiée afin d’étudier la structure des sous-domaines importants du ribozyme VS par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) mais doit être complétée. Dans le cadre de cette thèse, les structures de la boucle A730 et des jonctions III-IV-V et II-III-VI ont été déterminées par spectroscopie RMN hétéronucléaire. De plus, une approche de spectroscopie RMN a été développée pour la localisation des ions divalents, tandis que diverses approches de marquage isotopique ont été implémentées pour l’étude d’ARN de plus grandes tailles. Les structures RMN de la boucle A730 et des deux jonctions à trois voies révèlent que ces sous-domaines sont bien définis, qu’ils sont formés de plusieurs éléments structuraux récurrents (U-turn, S-turn, triplets de bases et empilement coaxial) et qu’ils contiennent plusieurs sites de liaison de métaux. En outre, un modèle du site actif du ribozyme VS a été construit sur la base des similarités identifiées entre les sites actifs des ribozymes VS et hairpin. Dans l’ensemble, ces études contribuent de façon significative à la compréhension de l’architecture globale du ribozyme VS. De plus, elles permettront de construire un modèle à haute résolution du ribozyme VS tout en favorisant de futures études d’ingénierie.

La tagatose-1,6-bisphosphate aldolase et la fructose-1,6-bisphosphate aldolase de classe I : mécanisme et stéréospécificité

La tagatose-1,6-biphosphate aldolase de Streptococcus pyogenes est une aldolase qui fait preuve d'un remarquable manque de spécificité vis à vis de ses substrats. En effet, elle catalyse le clivage réversible du tagatose-1,6-bisphosphate (TBP), mais également du fructose-1,6-bisphosphate (FBP), du sorbose-1,6-bisphosphate et du psicose-1,6-bisphosphate, quatre stéréoisomères, en dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et en glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). Aldolase de classe I, qui donc catalyse sa réaction en formant un intermédiaire covalent obligatoire, ou base de Schiff, avec son susbtrat, la TBP aldolase de S. pyogenes partage 14 % d’identité avec l’enzyme modèle de cette famille, la FBP aldolase de muscle de mammifère. Bien que le mécanime catalytique de la FBP aldolase des mammifères ait été examiné en détails et qu’il soit approprié d’en tirer des renseignements quant à celui de la TBP aldolase, le manque singulier de stéréospécificité de cette dernière tant dans le sens du clivage que celui de la condensation n’est toujours pas éclairci. Afin de mettre à jour les caractéristiques du mécanisme enzymatique, une étude structurale de la TBP aldolase de S. pyogenes, un pathogène humain extrêmement versatile, a été entreprise. Elle a permis la résolution des structures de l’enzyme native et mutée, en complexe avec des subtrats et des inhibiteurs compétitifs, à des résolutions comprises entre 1.8 Å et 2.5 Å. Le trempage des cristaux de TBP aldolase native et mutante dans une solution saturante de FBP ou TBP a en outre permis de piéger un authentique intermédiaire covalent lié à la Lys205, la lysine catalytique. La determination des profils pH de la TBP aldolase native et mutée, entreprise afin d'évaluer l’influence du pH sur la réaction de clivage du FBP et TBP et ìdentifier le(s) résidu(s) impliqué(s), en conjonction avec les données structurales apportées par la cristallographie, ont permis d’identifier sans équivoque Glu163 comme résidu responsable du clivage. En effet, le mode de liaison sensiblement différent des ligands utilisés selon la stéréochimie en leur C3 et C4 permet à Glu163, équivalent à Glu187 dans la FBP aldolase de classe I, d’abstraire le proton sur l’hydroxyle du C4 et ainsi d’amorcer le clivage du lien C3-C4. L’étude du mécanimse inverse, celui de la condensation, grâce par exemple à la structure de l’enzyme native en complexe avec ses substrats à trois carbones le DHAP et le G3P, a en outre permis d’identifier un isomérisme du substrat G3P comme possible cause de la synthèse des isomères en C4 par cette enzyme. Ce résultat, ainsi que la decouverte d’un possible isomérisme cis-trans autour du lien C2-C3 de la base de Schiff formée avec le DHAP, identifié précedemment, permet de cerner presque complètement les particularités du mécanisme de cette enzyme et d’expliquer comment elle est capable de synthétiser les quatres stéréoisomères 3(S/R), 4(S/R). De plus, la résolution de ces structures a permis de mettre en évidence trois régions très mobiles de la protéine, ce qui pourrait être relié au rôle postulé de son isozyme chez S. pyogenes dans la régulation de l’expression génétique et de la virulence de la bactérie. Enfin, la résolution de la structure du mutant Lys229→Met de la FBP aldolase de muscle en complexe avec la forme cyclique du FBP, de même que des études cristallographiques sur le mutant équivalent Lys205→Met de la TBP aldolase de S. pyogenes et des expériences de calorimétrie ont permis d’identifier deux résidus particuliers, Ala31 et Asp33 chez la FBP aldolase, comme possible cause de la discrimination de cette enzyme contre les substrats 3(R) et 4(S), et ce par encombrement stérique des substrats cycliques. La cristallographie par rayons X et la cinétique enzymatique ont ainsi permis d'avancer dans l'élucidation du mécanisme et des propriétés structurales de cette enzyme aux caractéristiques particulières.

Zeolite Encapsulated Complexes Of Fe,Co,Ni,Cu And Pd:Synthesis , Characterization And Catalysis-2003

This thesis deals with the synthesis, characterization and catalysis activity studies of some zeolite encapsulated complexes. Encapsulation inside the zeolite cages makes the catalysts more stable. Further, the framework prevents the complexes from dimerising. Catalysis by metal complexes encapsulated in the cavities of zeolites and other molecular sieves has many features of homogeneous, heterogenous and enzymatic catalysis. Serious attempts has been made to gain product selectivity in catalysis .The catalytic activity shown by the encapsulated complexes can be correlated to the structure of the active site inside the zeolite pore. It deals with the studies on the partial oxidation of benzyl alcohol to benzaldehyde. The oxidatio was carried out using hydrogen peroxide as oxidant in presence of PdYDMG and CuYSPP as catalysts. The product (benzaldehyde) was detected using TLC and confirmed using GC.The catalytic activity of the complexes was tested for oxidation under various conditions. The operating conditions like the amount of the catalyst, reaction time, oxidant to substrate ratio, reaction temprature, and solvents have been optimized. No further oxidation products were obtained on continuing the reaction for four hours beyond the optimum time. Maximum conversion was obtained at room temperature and the percentage conversion decreased with increase in temperature. Activity was found to be dependent on the solvent used. With increasing awareness about the dangers of environmental degradation, research in chemistry is getting increasing geared to the development of “green chemistry,” by designing environmentally friendly products and processes that bring down the generation and use of hazardous substances.

A Low-Energy Ion Scattering (LEIS) Study of the Influence of the Vanadium Concentration on the Activity of Vanadium-Niobium Oxide Catalysts for the Oxidative Dehydrogenation of Propane

A series of vanadium-niobium oxide catalysts in which the vanadia content varies between 0.3 and 18mol%was prepared by coprecipitation. These catalysts were characterized by X-ray diffraction (XRD), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), low-energy ion scattering (LEIS), and by catalytic testing in the oxidative dehydrogenation reaction of propane. The results of the surface analysis by XPS and LEIS are compared. It is concluded that the active site on the catalyst surface contains 2.0 ± 0.3 vanadium atoms on average. This can be understood byassuming the existenceof two or three different sites:isolated vanadium atoms, pairs of vanadium atoms, or ensembles of three vanadium atoms. At higher vanadium concentration more vanadium clusters with a higher activity are at the surface.LEIS revealed that as the vanadium concentration in the catalyst increases, vanadium replaces niobium at the surface. At vanadium concentrations above 8 mol%, new phases such as P-(Nb, V)20S which are less active because vanadium is present in isolated sites are formed, while the vanadium surface concentration shows a slight decrease

Vom Biofilm zur planktonischen Lebensform

Im ersten Teil dieser Dissertation stand die Analyse der Motilitätsentwicklung bei Vertretern der Gattung Methylobacterium im Vordergrund. Diese zu den pink pigmentierten fakultativ methylotrophen Mikroorganismen (PPFMs) gehörenden Prokaryoten sind in der Umwelt weit verbreitet. Besonders häufig besiedeln die Mikroben pflanzliche Oberflächen und können als so genannte Phytosymbionten in einer wechselseitigen Beziehung zu pflanzlichen Organismen stehen. In aquatischer Umgebung können Methylobakterien Flagellen aufweisen. Hierbei handelt es sich um spezielle Fortbewegungsorganellen, die den Mikroben eine aktive Beweglichkeit ermöglichen. Die Ausbildung polarer Einzelflagellen bei Methylobacterium-Zellen in planktonischer Lebensweise konnte unter Anwendung verschiedener mikroskopischer Techniken dokumentiert werden. Quantitative Beweglichkeitsstudien zeigten einen charakteristischen Entwicklungsverlauf, korreliert mit den Wachstumsphasen der Bakterienkulturen und machten deutlich, dass die Motilitätsrate durch Umweltfaktoren, wie z. B. die Nährstoffversorgung, beeinflusst werden kann. Es konnte gezeigt werden, dass die Pflanzen-assoziierten PPFMs in der Lage sind, zwischen einer sessilen und planktonischen Lebensweise zu wechseln und dass sowohl die zelluläre Beweglichkeit als auch die Biofilm-Bildung der Prokaryoten ein reversibles, reaktivierbares Verhalten darstellt. Weiterhin konnte belegt werden, dass die Motilität der epiphytischen Mikroben bezüglich der Besiedelung von Pflanzen, z. B. bei der Ausbreitung auf Keimblatt-Oberflächen von Sonnenblumen (Helianthus annuus), keine zentrale Rolle spielt und eine endophytische Lebensweise unwahrscheinlich ist. Ziel der Arbeit war weiterhin die Charakterisierung und Identifizierung eines aus der Phyllosphäre der Echten Feige (Ficus carica, Standort Griechenland) isolierten Bakterien-Stammes (Mtb. sp. Fc1). Die fakultativ methylotrophe Stoffwechseleigenschaft, sowie die auffällige rötliche Pigmentierung belegen, dass es sich um einen Vertreter der PPFMs handelt. Die Analyse morphologischer, physiologischer und biochemischer Eigenschaften bestätigte in Übereinstimmung mit molekularphylogenetischen Untersuchungen zur Klassifizierung und taxonomischen Einordnung, dass es sich um Pflanzen-assoziierte Mikroben der Gattung Methylobacterium handelt. Analysen der 16S rDNA sowie partieller Sequenzen der für Methylobakterien etablierten Marker-Gene mxaF und gyrB verdeutlichten die phylogenetische Stellung und die evolutionären Beziehungen des Ficus-Isolates. Obwohl enge Verwandtschaftsverhältnisse zu anderen Methylobacterium-Arten ermittelt werden konnten, war eine Identifizierung als valide beschriebene Spezies nicht möglich. Die Resultate legen den Schluss nahe, dass es sich um eine neue, unbeschriebene Spezies der epiphytisch lebenden Methylobakterien handelt.

Vesicle motion during sustained exocytosis in chromaffin cells

Chromaffin cells release catecholamines by exocytosis, a process that includes vesicle docking, priming and fusion. Although all these steps have been intensively studied, some aspects of their mechanisms, particularly those regarding vesicle transport to the active sites situated at the membrane, are still unclear. In this work, we show that it is possible to extract information on vesicle motion in Chromaffin cells from the combination of Langevin simulations and amperometric measurements. We developed a numerical model based on Langevin simulations of vesicle motion towards the cell membrane and on the statistical analysis of vesicle arrival times. We also performed amperometric experiments in bovine-adrenal Chromaffin cells under Ba2+ stimulation to capture neurotransmitter releases during sustained exocytosis. In the sustained phase, each amperometric peak can be related to a single release from a new vesicle arriving at the active site. The amperometric signal can then be mapped into a spike-series of release events. We normalized the spike-series resulting from the current peaks using a time-rescaling transformation, thus making signals coming from different cells comparable. We discuss why the obtained spike-series may contain information about the motion of all vesicles leading to release of catecholamines. We show that the release statistics in our experiments considerably deviate from Poisson processes. Moreover, the interspike-time probability is reasonably well described by two-parameter gamma distributions. In order to interpret this result we computed the vesicles’ arrival statistics from our Langevin simulations. As expected, assuming purely diffusive vesicle motion we obtain Poisson statistics. However, if we assume that all vesicles are guided toward the membrane by an attractive harmonic potential, simulations also lead to gamma distributions of the interspike-time probability, in remarkably good agreement with experiment. We also show that including the fusion-time statistics in our model does not produce any significant changes on the results. These findings indicate that the motion of the whole ensemble of vesicles towards the membrane is directed and reflected in the amperometric signals. Our results confirm the conclusions of previous imaging studies performed on single vesicles that vesicles’ motion underneath plasma membranes is not purely random, but biased towards the membrane.

Functional studies of the deubiquitinating enzymes USP19, USP4 and UCH-L1

El marcaje de proteínas con ubiquitina, conocido como ubiquitinación, cumple diferentes funciones que incluyen la regulación de varios procesos celulares, tales como: la degradación de proteínas por medio del proteosoma, la reparación del ADN, la señalización mediada por receptores de membrana, y la endocitosis, entre otras (1). Las moléculas de ubiquitina pueden ser removidas de sus sustratos gracias a la acción de un gran grupo de proteasas, llamadas enzimas deubiquitinizantes (DUBs) (2). Las DUBs son esenciales para la manutención de la homeostasis de la ubiquitina y para la regulación del estado de ubiquitinación de diferentes sustratos. El gran número y la diversidad de DUBs descritas refleja tanto su especificidad como su utilización para regular un amplio espectro de sustratos y vías celulares. Aunque muchas DUBs han sido estudiadas a profundidad, actualmente se desconocen los sustratos y las funciones biológicas de la mayoría de ellas. En este trabajo se investigaron las funciones de las DUBs: USP19, USP4 y UCH-L1. Utilizando varias técnicas de biología molecular y celular se encontró que: i) USP19 es regulada por las ubiquitin ligasas SIAH1 y SIAH2 ii) USP19 es importante para regular HIF-1α, un factor de transcripción clave en la respuesta celular a hipoxia, iii) USP4 interactúa con el proteosoma, iv) La quimera mCherry-UCH-L1 reproduce parcialmente los fenotipos que nuestro grupo ha descrito previamente al usar otros constructos de la misma enzima, y v) UCH-L1 promueve la internalización de la bacteria Yersinia pseudotuberculosis.

Bioinspired iron and manganese catalysts for the effective and selective oxidation of alkanes and alkenes

La gran eficiència, selectivitat i les condicions suaus exhibides per les reaccions que tenen lloc al centre actiu de les metal·looxigenases són la font d'inspiració per la present dissertació. Amb l'objectiu de dissenyar catalitzadors d'oxidació eficients hem fet ús de dues estratègies: la primera consisteix en el disseny de complexos amb baix pes molecular inspirats en aspectes estructurals de la primera esfera de coordinació del centre metàl·lic d'enzims de ferro i de manganès. Aquests complexos s'han estudiat com a catalitzadors en l'oxidació selectiva d'alcans i d'alquens fent servir oxidants "verds" com ara l'H2O2. La segona estratègia està basada en l'ús de la química supramolecular per tal de desenvolupar estructures moleculars auto-acoblades amb la forma i les propietats químiques desitjades. Concretament, la construcció de nanocontenidors amb un catalitzador d'oxidació incrustat a la seva estructura ens permetria dur a terme reaccions més selectives, tal com passa en les reaccions catalitzades per enzims.

O2 activation at bioinspired complexes: dinuclear copper systems and mononuclear non-heme iron compounds. Mechanisms and catalytic applications in oxidative transformations

L'activació d'oxigen que té lloc en els éssers vius constitueix una font d'inspiració pel desenvolupament d'alternatives als oxidants tradicionals, considerats altament tòxics i nocius. En aquesta treball s'utilitzen compostos sintètics com a models del centre actiu de proteïnes dinuclears de coure i mononuclears de ferro de tipus no-hemo que participen en l'activació d'oxigen en els éssers vius. Els sistemes dinuclears de coure mostren un centre de tipus coure(III) bis(oxo) que és capaç de dur a terme l'ortho-hidroxilació de fenols de manera similar a la reacció que catalitza la proteïna tirosinasa. Per altra banda, els sistemes de ferro desenvolupats en aquest treball actuen com a models de les dioxigenases de Rieske i poden dur a terme l'hidroxilació estereoespecífica d'alcans i l'epoxidació i cis-dihidroxilació d'olefines utilitzant peròxid d'hidrogen com a agent oxidant. Tot plegat demostra que el desenvolupament de sistemes model constitueix una bona estratègia per l'estudi dels sistemes naturals.

Cloud-radar observations of insects in the UK convective boundary layer

Radar has been applied to the study of insect migration for almost 40 years, but most entomological radars operate at X-band (9.4 GHz, 3.2 cm wavelength), and can only detect individuals of relatively large species, such as migratory grasshoppers and noctuid moths, over all of their flight altitudes. Many insects (including economically important species) are much smaller than this, but development of the requisite higher power and/or higher frequency radar systems to detect these species is often prohibitively expensive. In this paper, attention is focussed upon the uses of some recently-deployed meteorological sensing devices to investigate insect migratory flight behaviour, and especially its interactions with boundary layer processes. Records were examined from the vertically-pointing 35 GHz ‘Copernicus’ and 94 GHz ‘Galileo’ cloud radars at Chilbolton (Hampshire, England) for 12 cloudless and convective occasions in summer 2003, and one of these occasions (13 July) is presented in detail. Insects were frequently found at heights above aerosol particles, which represent passive tracers, indicating active insect movement. It was found that insect flight above the convective boundary layer occurs most often during the morning. The maximum radar reflectivity (an indicator of aerial insect biomass) was found to be positively correlated with maximum screen temperature.

Rational conversion of substrate and product specificity in a Salvia monoterpene synthase: structural insights into the evolution of terpene synthase function

Terpene synthases are responsible for the biosynthesis of the complex chemical defense arsenal of plants and microorganisms. How do these enzymes, which all appear to share a common terpene synthase fold, specify the many different products made almost entirely from one of only three substrates? Elucidation of the structure of 1,8-cineole synthase from Salvia fruticosa (Sf-CinS1) combined with analysis of functional and phylogenetic relationships of enzymes within Salvia species identified active-site residues responsible for product specificity. Thus, Sf-CinS1 was successfully converted to a sabinene synthase with a minimum number of rationally predicted substitutions, while identification of the Asn side chain essential for water activation introduced 1,8-cineole and alpha-terpineol activity to Salvia pomifera sabinene synthase. A major contribution to product specificity in Sf-CinS1 appears to come from a local deformation within one of the helices forming the active site. This deformation is observed in all other mono- or sesquiterpene structures available, pointing to a conserved mechanism. Moreover, a single amino acid substitution enlarged the active-site cavity enough to accommodate the larger farnesyl pyrophosphate substrate and led to the efficient synthesis of sesquiterpenes, while alternate single substitutions of this critical amino acid yielded five additional terpene synthases.

Evolution of functional diversity in the cupin superfamily

The cupin superfamily of proteins is among the most functionally diverse of any described to date. It was named on the basis of the conserved beta-barrel fold ('cupa' is the Latin term for a small barrel), and comprises both enzymatic and non-enzymatic members, which have either one or two cupin domains. Within the conserved tertiary structure, the variety of biochemical function is provided by minor variation of the residues in the active site and the identity of the bound metal ion. This review discusses the advantages of this particular scaffold and provides an evolutionary analysis of 18 different subclasses within the cupin superfamily.

Sequence analysis of the cupin gene family in Synechocystis PCC6803

The recently described cupin superfamily of proteins includes the germin and germinlike proteins, of which the cereal oxalate oxidase is the best characterized. This superfamily also includes seed storage proteins, in addition to several microbial enzymes and proteins with unknown function. All these proteins are characterized by the conservation of two central motifs, usually containing two or three histidine residues presumed to be involved with metal binding in the catalytic active site. The present study on the coding regions of Synechocystis PCC6803 identifies a previously unknown group of 12 related cupins, each containing the characteristic two-motif signature. This group comprises 11 single-domain proteins, ranging in length from 104 to 289 residues, and includes two phosphomannose isomerases and two epimerases involved in cell wall synthesis, a member of the pirin group of nuclear proteins, a possible transcriptional regulator, and a close relative-of a cytochrome c551 from Rhodococcus. Additionally, there is a duplicated, two-domain protein that has close similarity to an oxalate decarboxylase from the fungus Collybia velutipes and that is a putative progenitor of the storage proteins of land plants.

Crystal structure of a monomeric form of SARS-CoV endonuclease nsp15 suggests a role for hexamerization as an allosteric switch

Mature nonstructural protein-15 (nsp15) from the severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) contains a novel uridylate-specific Mn2+-dependent endoribonuclease (NendoU). Structure studies of the full-length form of the obligate hexameric enzyme from two CoVs, SARS-CoV and murine hepatitis virus, and its monomeric homologue, XendoU from Xenopus laevis, combined with mutagenesis studies have implicated several residues in enzymatic activity and the N-terminal domain as the major determinant of hexamerization. However, the tight link between hexamerization and enzyme activity in NendoUs has remained an enigma. Here, we report the structure of a trimmed, monomeric form of SARS-CoV nsp15 (residues 28 to 335) determined to a resolution of 2.9 A. The catalytic loop (residues 234 to 249) with its two reactive histidines (His 234 and His 249) is dramatically flipped by approximately 120 degrees into the active site cleft. Furthermore, the catalytic nucleophile Lys 289 points in a diametrically opposite direction, a consequence of an outward displacement of the supporting loop (residues 276 to 295). In the full-length hexameric forms, these two loops are packed against each other and are stabilized by intimate intersubunit interactions. Our results support the hypothesis that absence of an adjacent monomer due to deletion of the hexamerization domain is the most likely cause for disruption of the active site, offering a structural basis for why only the hexameric form of this enzyme is active.