Expressão em Escherichia coli de antigénios do Cell fusing agent virus (Flaviviridae: Flavivirus) como proteína de fusão

RESUMO: O Cell Fusing Agent Vírus (CFAV), considerado como o primeiro “flavivírus específicos de insectos” (ISF), parece estar exclusivamente adaptado aos seus hospedeiros, não replicando em células de vertebrados. Apesar de ter sido identificado há mais de três décadas (1975), a verdade é que muito pouco se conhece sobre a sua biologia. Dado o seu parentesco filogenético com alguns outros flavivírus encontrados naturalmente em mosquitos de diferentes géneros colhidos em diferentes regiões do globo, este vírus poderá ser usado como modelo para o estudo de ISF. No entanto, necessitam do desenvolvimento de ferramentas básicas, tais como clones moleculares ou baterias de soros contendo anticorpos que reconheçam uma ou mais proteínas codificadas pelo genoma viral, produzidas, por exemplo, a partir de antigénios virais produzidos de forma recombinante. Com este trabalho pretendeu-se a optimização de protocolos que permitiram a expressão e purificação parcial de quatro proteínas [duas proteínas estruturais (C e E) e duas não estruturais (NS3hel e NS5B)] do CFAV em E. coli, todas elas produzidas como proteínas de fusão com “caudas” (tags) de hexahistidina nos seus extremos carboxilo. Para a expansão do CFAV foram utilizadas células Aedes albopictus (C6/36). Após a realização da extracção do RNA viral e a obtenção de cDNA, procedeu-se amplificação, por RT-PCR, das regiões codificantes das proteínas C, E, NS3hel e NS5B, utilizando primers específicos. Os quatro fragmentos de DNA foram independentemente inseridos no vector pJTE1.2/blunt usando E. coli NovaBlue como hospedeira de clonagem e, posteriormente, inseridos em vectores de expressão pET-28b e pET-29b usando E. coli BL21(DE3)pLysS e Rosetta(DE3)pLysS como hospedeiras de expressão. Após da indução, expressão e purificação das proteínas recombinantes C, E, NS3hel e NS5B, foi confirmada a autenticidade destas proteínas produzidas através do método Western Blot com um anticorpo anti-histidina. --------- ABSTRACT: The Cell Fusing Agent virus (CFAV) considered as the first "insect- specific flavivirus" (ISF) and seems to be uniquely adapted to their hosts, not replicating in vertebrate cells. Although it has been known for more than three decades (1975), the truth is very little is known about its biology. Given its close phylogenetic relationship with other flavivirus naturally circulating in various genera of mosquitoes collected from different regions of the globe, this virus could be used as a model for the study of ISF. However, such studies require the development of experimental basic tools, such as molecular clones or serum batteries containing antibodies that recognize one or more proteins encoded by the viral genome, produced, for example, from viral antigens recombinant produced. In this work, we carried out the optimization of protocols that allowed the expression and partial purification of four proteins [two structural proteins (C and E) and two nonstructural proteins (NS3hel and NS5B)] CFAV in E. coli as fusion protein for c-terminal hexahistidine tags. For the expansion of the CFAV we used Aedes albopictus (C6/36) cells. After completion of the viral RNA extraction and cDNA obtained, amplification of the coding regions of the C, E, NS5B and NS3hel proteins was carried out by RT-PCR using specific primers. The four DNA fragments were independently inserted into the vector pJTE1.2/blunt using E. coli NovaBlue as cloning host and then inserted into expression vectors pET-28b and pET-29b using E. coli BL21(DE3)pLysS and Rosetta(DE3)pLysS as expression host. After induction, expression and purification of recombinant C, E, NS3hel and NS5B proteins Western Blot analyses with an anti-histidine antibody confirmed the authenticity of these proteins produced.

Energia e sustentabilidade a nível de bairro - caso de estudo do bairro do Charquinho

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia do Ambiente - Perfil de Ordenamento do Território e Impactes Ambientais

Doença Estreptocócica Invasiva Grave - Doença Emergente?

Introdução: A incidência da doença estreptocócica invasiva (DSI) tem vindo a aumentar na Europa e América do Norte desde o final dos anos 1980, provavelmente relacionada com a emergência de estirpes mais virulentas. Em oito meses foram internados no nosso hospital seis casos desta entidade rara. Objectivos: Descrever as características da doença estreptocócica invasiva grave. Métodos: Estudo descritivo, de Dezembro de 2007 a Julho de 2008. Analisaram-se parâmetros demográficos, factores de risco, clínica, terapêutica, complicações e evolução. Resultados: Identificaram-se seis casos com mediana de idade de 2,5 anos: síndrome de choque tóxico estreptocócico (STSS) (2), fasceíte necrotizante (2), bacteriémia (1) e infecção estreptocócica grave (1). Cinco casos ocorreram entre Dezembro e Fevereiro. Em quatro doentes registaram-se eventuais factores de risco (infecções virais e anti-inflamatórios não esteroides). Duas crianças necessitaram de cirurgia e três de tratamento em cuidados intensivos. Todas as estirpes eram susceptíveis à penicilina e clindamicina. Ocorreram complicações em 5/6 doentes: choque séptico (3), coagulação intravascular disseminada (2), insuficiência renal (2), abcesso de tecidos moles (2), sobreinfecção bacteriana (2), síndrome de dificuldade respiratória do adulto (1), osteomielite /artrite séptica (1) e pneumonia/derrame pleural (1). Não se registaram óbitos. Comentários: Seis casos de DSI num curto espaço de tempo podem indiciar a emergência de estirpes de Streptococcus grupo A (GAS) de maior virulência no nosso país, pelo que a realização de estudos moleculares será fundamental na identificação de clones invasivos. Apesar da susceptibilidade à penicilina, a DSI cursa com morbilidade elevada, pelo que, o importante parece ser procurar novas formas de tratar o doente e não o agente.

Produção de partículas semelhantes a retrovírus como candidatas a vacina para a Hepatite C

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Transmissão do Trypanosoma cruzi em três gerações de Cavia porcellus sem a participação de triatomíneos

Foi verificada a transmissão sucessiva do T. cruzi em três gerações da cobaia Cavia porcellus sem a participação de triatomíneos. Embora não fosse determinado qual das vias, se placentária, leite, excreções ou contágio direto pelo qual o protozoário foi transmitido para os descendentes, chama-se atenção para a importância da manutenção de reservatórios da Doença de Chagas, mesmo na ausência de vetores invertebrados.

A ação do Baygon (OMS-33) no combate ao Panstrongylus megistus

Durante o ano de 1972 a 1975 o Baygon (OMS-33) 2 - isopropoxifenil - N - metil - carbamato foi utilizado no combate ao P. megistus numa pequena área de 200 casas no Estado da Bahia endêmica para a doença de Chagas. Somente na dosagem de 1,6mg/m², em duas aplicações anuais, os resultados foram considerados satisfatórios, Devido ao elevado custo do produto, é considerado que ele não possa ser utilizado em campanhas profiláticas do governo, podendo entretanto ser utilizado por fazendeiros de recursos em suas próprias fazendas protegendo-se assim contra a proliferação dos vetores da Doença de Chagas.

Estudo seccional sobre esquistossomose mansônica no Município de Riachuelo, Estado de Sergipe

Os autores fizeram um estudo clínico e epidemioiógico, visando estudar a morbidade da esquistossomose mansônica, na cidade de fíiachuelo, Sergipe, área considerada de alta endemicidade. Foi selecionada de maneira sistemática uma amostra da população local, constituída por 850 pessoas. Destas pessoas, foram realizados 835 exames de fezes, pelos métodos de Lutz (Hoffman, Pons e Janner) e/ou Kato. Fez-se também 393 reações intradérmicas com antígeno de verme adulto. Da mesma maneira, realizou-se o exame clínico das pessoas da amostra, visando a determinar a gravidade da doença. Foram localizados os focos onde existiam caramujos transmissores da esquistossomose e deles coletados exemplares nos quais se verificou o índice de infecção. A prevalência global obtida através do exame de fezes foi igual a 50,54%. O estudo da prevalência através da coproscopia mostrou não haver diferença entre os sexos, porém entre as raças ocorreu predominância dos resultados obtidos entre os não brancos sobre os brancos. Quanto i idade, a prevalência foi baixa até os 5 anos de vida, subindo após os 11 anos a níveis elevados, caindo após os 50 anos. O estudo feito através da reação intradérmica permitiu tirar conclusões semelhantes ao feito por coproscopia, exceto na faixa etária que compreendia os maiores de 50 anos, onde quase todo o grupo apresentou reações positivas. Das 850 pessoas da amostra, 422 eram portadores de ovos de S. mansoni nas fezes. Destes, 410 foram examinados clinicamente, sendo 73,17% classificados como tipo I, 24,39% como tipo II e 2,43% como tipo III. Segundo esta classificação clínica não se demonstrou diferença estatisticamente significativa entre os sexos ou entre os grupos raciais, porém a maioria dos portadores de hepatoesplenomegalia (tipo III) tinha mais de 40 anos de idade. Do levantamento malacológico, determinou-se os focos de infecção de onde se coletou 1.208 exemplares de caramujos vetores da esquistossomose mansônica, estando 12 naturalmente infectados. A única espécie encontrada foi a B. glabrata.

Leishmaniose tegumentar americana na Ilha Grande, Rio de Janeiro: VI. observações sobre a freqüência horária e variação mensal dos transmissores

Para estudo da freqüência horária dos principais vetores da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), na Ilha Grande, durante os anos de 1976 a 1977, foram realizadas 4 capturas de 24 horas com isca animal (cão), ao ar livre, e 5 capturas de 24 horas em um único domicilio da área. Observou-se que a espécie Lutzomyia intermedia ocorreu durante todo o período noturno, com densidade constante no domicílio humano, enquanto a espécie Lutzomyia migonei apresentou maiores densidades no período da madrugada, nas capturas com isca animal (cão). Em 156 horas de estudo sobre variação mensal, durante o período de março de 1976 a fevereiro de 1977, a espécie L. intermedia ocorreu durante todo o ano, sendo abril, maio, outubro e dezembro os meses de maior densidade; a espécie L. migonei apresentou-se com baixa densidade, chegando a desaparecer no mês de setembro. As elevadas densidades das espécies L. intermedia e L. migonei indicam-nas como as prováveis vetoras de LTA na Ilha Grande.

Situação atual da doença de Chagas na Guiana Francesa

Localizada entre dois focos endêmicos da doença de Chagas, a Venezuela e o Brasil, a Guiana Francesa conheceu poucos casos dessa afecção de 1940 até 1956. Um inquérito sorológico, utilizando-se uma pesquisa ativa sobre pacientes cardiopáticos e uma pesquisa passiva, permitiu evidenciar a existência de dois casos autóctones. Apesar da presença de vetores domésticos, o risco da doença de Chagas na Guiana Francesa parece limitado à aparição episódica de escassos casos humanos.

Estudo do comportamento de cepas de Trypanosoma cruzi após passagem em diferentes espécies de triatomíneos

Foi estudada a influência da passagem em diferentes espécies de triatomíneos de cepas do T. cruzi biologicamente distintas, mantidas em camundongos. Cepas: Peruana (Tipo I), 12 SF (Tipo II), Colombiana (Tipo 111). Triatomíneos: Rhodnius prolixus, Panstrongylus megistus e Triatoma infestans. Ninfas do 4o estágio foram alimentadas em camundongos infectados com as respectivas cepas e obtidos os inóculos (icft formas metacíclinas) para infecção de camundongos de 8 a 10 g. Grupos experimentais para cada cepa: I - Controles inoculados com formas sanguícolas; 11,111 e TV - inoculados com metacíclicos de P. megistus, T. infestans ou R. prolixus, respectivamente. Os perfis de parasitemia foram mantidos para cada cepa, com piques mais elevados nas infecções com metacíclicos do P. megistus e do R. prolixus, para a cepa Peruana, do P. megistus para a 12 SF e do R. prolixus, para a Colombiana. O histotropismo e o padrão de lesões foram mantidos para os três tipos de cepas. O grau de virulência da cepa Peruana foi idêntico em todos os grupos e variou para as cepas 12 SF e Colombiana de acordo com a espécie de triatomíneo usada, com predominância deformas delgadas, nos inoculados com formas metacíclicos o que foi interpretado como uma fase adaptativa das formas metacíclicos ao hospedeiro vertebrado.

Desenvolvimento de linhas celulares produtoras de vectores retrovirais para terapia génica

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia

Desenvolvimento e implementação de diferentes estratégias de comunicação e divulgação científica – um projeto para a Escola de Ciências da Universidade do Minho

Relatório de Estágio apresentado para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Comunicação de Ciência

A Parceria para a Regeneração Urbana “Margens do Ave”

Trabalho de Projeto apresentado para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Práticas Culturais para Municípios

Estudo sobre triatomíneos e reservatórios silvestres de Trypanosoma cruzi no estado do Paraná, Sul do Brasil. Resultados preliminares

Em localidades da zona rural de cinco municípios da região noroeste do Paraná adultos e ninfas de Triatoma sordida foram capturados em 21 (41,2%) de 51 unidades domiciliares pesquisadas. Foram capturados 154 exemplares de T. sordida e 2 Panstrongylus megistus. De 135 exemplares examinados 58 (43,0%) apresentavam o Trypanosoma tipo cruzi. Constatou-se também a infecção em 57,1% (4/7) dos gambás (Didelphis sp) examinados. O peridomicílio apresentou-se mais infestado que o intradomicílio, sendo a casa de madeira abandonada a construção mais freqüente (34,7% do total investigado) e com maior taxa de infestação (53,9%). Os dados mostram um elevado índice de infestação da zona rural por espécies secundárias de triatomíneos com altas taxas de infecção por flagelados do tipo T. cruzi, em uma área endêmica para a doença de Chagas já em fase de vigilância epidemiológica.

Encontro de Panstrongylus megistus em ecótopo artificial: domiciliação ou mera visitação?

No combate à doença de Chagas no Brasil, foi utilizado como primeira medida o controle químico, erradicando o Triatoma infestans, o mais importante vetor, tal combate vem favorecendo o aparecimento de vetores secundários, como Triatoma sordida and Panstrongylus megistus, espécies que podem eventualmente ser encontradas no domicílio, como os triatomíneos provenientes de Bernardino de Campos e Sete Barras por nós examinados que foram encontrados no domicílio e positivos para o T. cruzi, sugerindo que, apesar da doença de Chagas estar controlada no Estado de São Paulo, existe a necessidade de aprimorar os conhecimentos sobre o comportamento destes vetores para que mudanças nas medidas de controle sejam introduzidas.