青花菜原生质体培养和根癌农杆菌介导的遗传转化

从4-5天龄青花菜(Brassica oleracea var．italica)下胚轴游离原生质体，经纯化后培养在简化的KMsP培养基上，原生质体分裂形成了细胞团;同时，对影响外源DNA导入子叶和下胚轴原生质体后瞬间表达强度的若干因素作了较详细的研究，这些因素包括转化介质中二价阳离子的种类和浓度、PEG溶液的浓度以及PEG溶液的pH值， 为进一步进行原生质体水平上的细胞遗传转化创造了条件。 以青花菜(Brassica oleracea var．italica)子叶和下胚轴为外植体材料，进行了根癌农杆菌介导的遗传转化研究。在建立了子叶和下胚轴外植体组织培养的高频率植株再生系统的基础上，用携带有双元载体质粒的根癌农杆菌(Asrobacterium,tumefaciens)A208sE感染青花菜子叶和下胚轴，对根癌农杆菌的感染过程以及影响抗性芽分化频率的诸多因素作了详细研究，再生了具有卡那霉素抗性的完整转化植株。Dot Blot分析表明NPTⅡ酶活性的存在;以pROA93经EcoRI /HindⅢ酶切产生的gus基因片段(约2.6Kb)为探针进行Southern Blot分子杂交，结果表明gus基因已整合到植物细胞基因组中，并且得到了表达。

普通烟草与毛曼陀罗族间体细胞杂交的研究

采用PEG／DMSO融合法，从普通烟草(Nicotiana tabacum L.cv.Xanthi nc)叶肉和毛曼陀罗(Datura innoxia Mill.)茎或叶愈伤组织原生质体融合获得I5株花盆中健康生长的族间体细胞杂种植株;其中11株是在没有选择压力的条件下获得，4株则是在有IOA和R6G选择系统存在下获得。同时获得一株试管开花且形态异常的植株和一株花盆中生长的嵌合植株。lOmM IOA和I5μ g／ml R6G均能分别有效地抑制烟草叶肉和毛曼陀罗愈伤组织原生质体的分裂;10% DMSO能显著提高原生质体融合率;PEG种类并不重要，但浓度则很重要;BAP较ZT，KT对植株分化有更好的诱导效果。杂种的形态、细胞、同工酶、Southern杂交，花粉育性分析结果如下：1、l5株杂种较双亲普遍株型矮小，生长缓慢，形态接近烟草但不很正常，根据形态特征可分为两种类型：(1)共有8株，其叶片大小、形状、颜色、开花习惯、花类型（单花）等均与毛曼陀罗接近，但子房败育;(2)共有7株，其株型、叶片形状、颜色、光滑度、花形状、类型（圆锥状花序）、颜色更接近烟草，但少数杂种开单花或先单花后圆锥状花序或先单花后两种花并存，且开花时间不一，部分子房败育。2、杂种染色体数目大都在60～90之间，个别者较少(48条)或较多(125条)，没有一株为双二倍体(2n=96)，并全部为混倍体。3、15株杂种植株均有双亲的细胞色素氧化酶同工酶特征谱带;大部分都有双亲的过氧化物酶同工酶特征谱带，少都仅具烟草的谱带。4、Hae Ⅲ／水稻rDNA的Southern杂交分析表明杂种1较双亲多一条谱带，杂种2较双亲也多一条弱带，其它杂种尚待定。5、花粉活力测定表明毛曼陀罗（种子再生而来）的为99%，烟草（原生质体再生而来）为80～90%，而杂种的为24～61%，育性普遍低于双亲。

玉米、谷子基因转化的研究

本工作用BT基因、PinⅡ基因和bar基因对青饲玉米、谷子进行了基因转化的研究，并且对转基因的受体、转基因的方法、转化后的筛选、检测及植株再生等问题进行了探讨。 玉米胚性细胞系，包括胚性愈伤组织和胚性细胞悬浮系，可作为基因转化的受体，它亦是原生质体培养的关键。玉米的基因型对胚性细胞系的获得有很大的影响。在相同的培养条件下，九个青饲玉米品系都得到了I型愈伤组织，但仅有两个品系(232和235)得到了胚性细胞系(L32和L35)。幼胚的长度及年龄也是影响诱导形成胚性愈伤组织的一个重要因素，最佳胚长是1-1.5mm，最佳胚龄是授粉后10-12天的幼胚。另外，适当提高蔗糖浓度对胚性细胞悬浮系的建立及保持均有好处。 从玉米原生质体培养获得了再生植株．在此基础上用电激法和PEG法将BT基因导入玉米原生体，发现在原生质体培养过程中，同对照相比，第一次细胞分裂及形成愈伤组织的时间往后推移． 诱导玉米I型愈伤组织没有基因型的限制，可以从大多数玉米品系中得到。并且玉米I型愈伤组织具有极强的分化能力．我们将玉米I型愈伤组织作为基因枪法转化的受体，获得了转基因工程植株。目前，尚未见这方面的报道． 基因枪法转化玉米胚性细胞系，得到抗性愈伤组织的效率约为1/40。用直径约3mm的玉米I型愈伤组织块作基因枪法转化受体，转化后经筛选平均每块可得到1-4个抗性愈伤组织系。用PEG和电激法转化玉米原生质体，转化后原生质体再生愈伤组织中，抗性愈伤组织的得率为9.3%和8.9%， 基因枪法适应完整的细胞和组织的转化，可较快得到抗性植株，在玉米基因转化研究中， 为了较快地得到转化植株，用基因枪法较电激法和PEG法更好，在玉米三种基因转化的受体中（原生质体、胚性细胞系和I型愈伤组织），以I型愈伤组织作受体最好，用它作受体可以避免原生质体培养的困难，克服获得胚性细胞系的基因型的限制。 胚性细胞系对抗菌素的耐受性随继代时间增长而增加．I型愈伤组织对抗菌素的耐受性 同愈伤组织块的大小呈正相关。 由于玉米愈伤组织对卡那霉素的本底抗性较高，所以需要用高浓度(800mg/L)的卡那霉 素进行筛选，过高的选择压力对芽的分化有抑制作用．用电激和PEG处理后的原生质体再生的愈伤组织，经卡那霉素筛选出的抗性愈伤组织未能得到再生植株。而对照则得到了再生植株。用PPT和Hyg筛选出的抗性愈伤组织得到了再生植株． 用PCR和Southern杂交对抗性愈伤组织和再生植株进行检测，证明外源基因已整合到 玉米基因组中。得到了携有BT基因、bar基因或PinⅡ基因的愈伤组织或工程植株。 用豫谷一号的幼穗诱导获得了胚性愈伤组织，基因枪转化后，经PPT筛选得到抗性愈伤组织。每个5cm的培养皿内装有谷子胚性愈伤组织约0.5g，经筛选后可得到5-10块抗性愈伤组织，此PPT抗性的愈伤组织用PCR和Southern杂交检测，证明bar基因已整合到了谷子的基因组中。从转化愈伤组织中已分化出了再生植株。

通过体细胞杂交由大黍向水稻转移无融合生殖基因的研究

本论文以无融合生殖的大黍(Panicum maximum Jacp.)作为无融合生殖基因的供体，试图通过体细胞杂交方法向水稻(Oryza sativa L．)导入无融合生殖基因。结果如下：采用PEG融合法，诱导水稻原生质体与大黍原生质体融合，经过融合体筛选、培养，成功地获得了再生水稻植株。在融合前，水稻原生质体经过2.5 mM碘乙酰胺(IOA)在室温(22～25℃)条件下处理15分钟，大黍原生质体经过60Kr软x射线照射或不做任何处理。经双亲处理选择系统获得移栽成活的25株再生植株;经水稻单亲处理选择系统获得移栽成活再生植株3株。这两类融合再生植株（经双亲处理选择系统获得的25株和经单亲处理选择系统的3株）在花器官形态、结构及生殖特性上与对照亲本水稻植株有显著的差异，出现多花药（一朵颖花具7至11枚，甚至13枚花药）、多胚珠（一个子房内2～3个胚珠）及多胚囊（一个胚珠中2个以上胚囊）等现象;雌、雄性育性显著降低或完全消失，仅有5株能够少量结实，I-KI溶液着色的花粉从0至68%不等;胚胎学检查表明不能结实的植株雌性均不育，即不能分化出正常的胚囊结构。进一步的检查正在进行中。

猕猴桃属两个种的原生质体培养与体细胞杂交

猕猴桃是重要的栽培果树，但目前栽培品种过于单一，不能满足生产和消费的需求。由于猕猴桃的雌雄异株特性、种间杂交亲合性差、遗传上高度杂合以及育种周期长等特点，常规杂交育种困难很大。现代生物技术，如原生质体培养和体细胞杂交等，为培育新品种提供了新途径。 毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)和软枣猕猴桃(A.arguta)是猕猴桃属中具有重要利用价值的两个种。毛花猕猴桃果实大小在猕猴桃属中次于中华猕猴桃(A.chinensis)和美味猕猴桃(A.deliciosa)列第三位，果实维生素C含量达1014 mg/l00 g FW。软枣猕猴桃极耐寒，在-40℃下可安全越冬，其果实表面光滑无毛。这两个种是品种改良的重要种质资源。 作为生物技术基础的组织培养与植株再生系统，在毛花猕猴桃上尚未见报道。软枣猕猴桃的组织培养仅有一例报道，且芽分化率和分化系数都很低。这两个种的原生质体培养及与美味猕猴桃的原生质体融合也未见报道。针对这种情况，本试验对毛花猕猴桃和软枣猕猴桃的组织培养、原生质体培养及其与美味猕猴桃品种“Hayward”的原生质体融合进行研究，结果建立了较理想的毛花猕猴桃和软枣猕猴桃组织培养系统;首次从毛花猕猴桃原生质体得到再生植株和从软枣猕猴桃原生质体培养再生愈伤组织;通过改进融合方法，建立了毛花猕猴桃+美味猕猴桃和软枣猕猴桃+美味猕猴桃的原生质体融合体系，并将异核体培养分裂得到细胞团。这些结果有利于今后毛花猕猴桃和软枣猕猴桃资源的开发利用。主要试验结果如下： 以毛花猕猴桃试管实生苗叶片和茎段为外植体，培养在附加一定浓度Zea或CPPU的MS培养基上，产生的愈伤组织不经转代就可分化芽。试管苗茎段在附加0.0025 mg/L CPPU和0.1 mg/LIAA的MS培养基上愈伤组织产生、芽分化和苗生长都较理想;试管苗叶片则以附加0.025 mg/L CPPU和0.l mg/LIAA或0.5 mg/L Zea和0.1 mg/LIAA的MS培养基较好。当苗生长至1.0 cm时经诱导生根形成完整植株。 在软枣猕猴桃组织培养中，外植体种类、诱导培养基的激素种类和诱导分化时细胞分裂素种类都有重要影响。无菌苗茎段容易愈伤组织化，但分化困难;叶片外植体产生愈伤组织较难，但分化容易。在含Zea的MS培养基上，两种外植体产生的愈伤组织不经转代即能分化芽。分化培养基中添加Zea能有效地诱导芽分化，其中以2.0 mg/L Zea芽的分化最好，而Kin和BAP在0.5- 2.0 mg/L浓度范围内愈伤组织不分化。 以毛花猕猴桃或软枣猕猴桃试管苗叶片为分离原生质体的材料。试管苗的培养条件对原生质体分离效果及其培养反应有显著影响。弱光培养条件对两个种试管苗的原生质体分离及其培养都有好处，试管苗培养基也有重要影响。毛花猕猴桃和软枣猕猴桃试管苗合适培养基分别为MS基本培养基（大量元素减半）和MS+0.00025 mg/L CPPU+ 0.1 mg/LIAA。在此条件下培养的两个种的试管苗叶片，经酶解后原生质体产量分别为0.7-1.8×l06和3.0-3.5×l06/1 g FW，其原生质体在合适培养基上能够分裂。 毛花猕猴桃原生质体培养在MS培养基（去除NH4N03）附加l.0mg/L2，4-D液体培养基中，约10天时发生第一次分裂，分裂能持续下去并在培养3个月时形成约2mm大小愈伤组织。直接将其转入固体培养基中使其增殖和分化。在附加Zea 0.5 mg/L+ O.l mg/L IAA的MS培养基上继代2次，愈伤组织开始分化芽。芽伸长后切下诱导生根，形成完整植株。软枣猕猴桃原生质体培养基中，MS培养基附加2，4-D配合Zea或Kin对启动分裂是必须的，其中以MS＋2，4-D 0.5 mg/L+ Zea 0.5 mg/L最好，在此培养基上原生质体第一次分裂发生在4-6天时，培养12-14天时见到第三次分裂，培养三周的分裂频率为23%。培养45天后形成许多小愈伤组织块。软枣猕猴桃原生质体再生的愈伤组织从液体培养基转入固体培养基后未见进一步分裂。 对18株毛花猕猴桃原生质体再生植株的体细胞染色体数目作了观察，其中12株为整倍体，二倍体和四倍体各六株;另外六株为混倍体，其染色体数目变化在59-203之间。还发现原生质体再生植株有丝分裂间期细胞存在多核现象，有多核细胞的共10株，细胞内多核数目以双核和三核较常见，最多的有七个核。原生质体供体植株为2n=2x=58，未发现多核细胞。原生质体再生植株体细胞多核现象未见报道。 利用毛花猕猴桃或软枣猕猴桃叶片原生质体分别与愈伤组织来源的美味猕猴桃原生质体进行融合，融合方法为高Ca++高pH值PEG法。对Kao等(1975)报道的融合步骤作了修改。影响融合效率的因素主要有PEG种类、融合作用时间和融合液中DMSO浓度。最佳的融合条件为40%PEG (Sigma，MW3350)+10%DMSO，作用40 min。毛花猕猴桃+美味猕猴桃和软枣猕猴桃+美味猕猴桃的融合频率分别可达14.5%和13.6%。异核体经培养可分裂并形成细胞团。

火炬松体细胞无性系建立及其形态发生调控的研究

火炬松（Pinus taeda L.）原产美国东南部，是世界南方松中最重要的绿化和造林用速生针叶树种，现广泛分布于全球亚热带和部分热带地区，在我国的栽植面积居世界第2位，仅次于美国。目前，火炬松离体快速繁殖、遗传转化和品种改良研究中最大的障碍是没有获得良好的植株再生体系。本研究以火炬松的成熟种子为试材，建立了可调控的体细胞胚胎发生和器官发生植株再生系统，并对再生过程中的形态学变化进行了细胞学观察和扫描电镜观察;建立了胚性细胞悬浮系，测定了其重要生长参数的变化动态，优化了悬浮条件下体细胞胚胎发生的培养条件及悬浮细胞原生质体直接体细胞胚胎发生的培养条件。 进行了HA、HB、HC、MA、MB、MC、LA和LB等8种不同基因型的成熟合子胚在BMS、DCR、GD、LM、LP、MNCI、MS、SH及自行设计的TE等9种不同基本培养基上的愈伤组织诱导试验，筛选获得了愈伤组织发生频率较高的基因型HB、MA和MC，及基本培养基DCR和TE。激素组合试验表明，2,4-D和BA最有利于愈伤组织发生。两因子5水平等重复的愈伤组织诱导试验及方差分析结果证实，8 mg•L~(-1)2,4-D和4 mg•L~(-1)BA是愈伤组织诱导的最佳激素组合。诱导产生的愈伤组织经2次继代后，可明显分为4种类型，它们是1）白色、半透明、有光泽的粘性愈伤组织（WTGM）;2）淡黄色、疏松、有光泽的颗粒状愈伤组织（YLGG）;3）淡绿色、疏松的颗粒状愈伤组织（GLG）;和4）浅白色、水浸状的粘性愈伤组织（WMM）。其中白色、半透明、有光泽的粘性愈伤组织有较强的体细胞胚胎发生能力，淡黄色、疏松、有光泽的颗粒状愈伤组织有较强的不定芽发生能力。这两种愈伤组织的最高诱导频率分别是28.1%和35.7%。 在附加2,4-D、IBA和BA的DCR体细胞胚诱导培养基上，白色、半透明、有光泽的粘性愈伤组织中的胚性细胞形成胚性胚柄细胞团和早期原胚。提高培养基中的渗透压后，早期原胚发育成后期原胚。在附加ABA、PEG和活性炭的DCR体细胞胚成熟培养基上，后期原胚发育成子叶胚。在无激素DCR培养基上，子叶胚萌发形成再生完整植株。体细胞胚转换成小植株的最高频率是18.4%。在直接体细胞胚诱导增养基和直接体细胞胚发育培养基的作用下，成熟合子胚的子叶和胚轴上直接形成体细胞胚。直接体细胞胚胎发生的最高频率是18%。 在附加NAA、IBA和BA的TE不定芽原基诱导培养基上，淡黄色、疏松、有光泽的颗粒状愈伤组织中的胚性细胞形成不定芽原基。在附加IBA和BA的TE不定芽分化培养基上，不定芽原基分化产生不定芽。用基因型HB、MA和MC的淡黄色、疏松、有光泽的颗粒状愈伤组织进行的试验表明，不定芽分化的最佳低温（4 ℃）处理时间是5～6周，最佳蔗糖浓度是25～30 g•L~(-1)。分化产生的不定芽在附加IBA、GA_3和活性炭的TE培养基上，幼茎伸长。附加IBA、BA和GA_3的TE培养基上，伸长的不定芽生根形成完整植株。伸长不定芽的最高生根频率是46%。成熟合子胚在直接不定芽原基诱导培养基及直接不定芽分化培养基的作用下，从子叶和胚轴的不同部位产生直接不定芽。直接不定芽发生的最高频率是58.2%。 由成熟合子胚诱导愈伤组织形成过程中的形态学观察表明：在附加2,4-D和BA的DCR愈伤组织诱导培养基上，HB、MA和MC3种基因型中，MA主要在下胚轴形成愈伤组织，MC主要在子叶和胚根形成愈伤组织，HB主要在胚根形成体积较小的愈伤组织。在附加NAA和BA的TE愈伤组织诱导培养基上，HB、MA和MC3种基因型中，MA在单个子叶的顶端形成生长较快的愈伤组织，MC的所有子叶都形成愈伤组织，HB在所有子叶的顶端形成愈伤组织。 石蜡切片观察表明：4类愈伤组织的细胞组成不同．第1类愈伤组织主要由核大、质浓、体积小的园形胚性细胞及核呈柱状或新月形的体积较大的非胚性细胞组成;第2类愈伤组织主要由核大、质浓、体积小的园形胚性细胞组成，第3类愈伤组织主要由体积较大的棒状、葫芦形、新月形、盾片状细胞组成、第4类愈伤组织主要由体积较大的薄壁细胞和细胞壁加厚、细胞间连结紧密、无细胞核的分化细胞组成，第1类愈伤组织上形成的早期原胚的特点是：胚性头部由排列紧密、体积小的园形细胞组成，轮廓十分清晰、呈半圆形，胚柄由排列疏松的长形细胞组成，细胞体积大、细胞中有大的液泡，早期原胚在发育过程中和母体组织保持一定的隔离状态。第2类愈伤组织上形成的不定芽的特点是t结构上为单极性，其维管束和母体组织保持密切联系。扫描电镜观察表明;直接体细胞胚基部和母体组织保持较少的联系，其子叶是直立生长的．直接不定芽基部和母体组织保持较多的联系，其幼叶是向心卷曲生长的。 在培养周期内，基因型HB、MA和MC胚性细胞悬浮培养物的几个生长参数的变化动态相似。鲜重增长高峰在12—15 d，干重增长高峰在15～18 d，细胞体积增长高峰和胚数增长高峰在18—21 d。在培养的18—21 d，培养液中的pH值、电导率和蔗糖浓度接近或降到最低点。在悬浮培养条件下，体细胞胚形成的最佳起始细胞密度是5～6×103个／ml。继代培养时间延长，体细胞胚胎发生能力下降。热激处理促进基因型HB和MA体细胞胚的形成，抑制基因型MC体细胞胚的形成。在悬浮培养物中，观察到了裂生多胚。 对数生长期的火炬松胚性悬浮细胞，在以甘露醇作为渗透压稳定剂的酶混合液Cel-lulase“Onozuka”RS l%+Cellulase“Onozuka”R-10 2.5%+Pectolyase Y-23 0.2%的作用下，原生质体的产量和活力均最高。原生质体在DCR和KM8P两种培养基上形成了体细胞胚（包括胚性胚柄细胞团、早期原胚和后期原胚）．体细胞胚形成的最佳起始原生质体密度是7×l04个/ml，最佳ABA浓度是4 mg．L-I．

白杄体细胞胚胎发生及其植株再生的研究

本文以白杄的合子胚为材料，建立了体细胞胚胎发生及其植株再生系统．通过对影响体细胞胚胎发生的主要因素的系统研究，实现了体细胞胚的高频率发生。运用扫描电镜、整体染色封片及石蜡切片等方法全面观察了体细胞胚胎发生过程中的形态学、细胞学及组织化学变化。建立了胚性细胞悬浮系，测定了几个重要生长参数的变化动态，优化了体细胞胚的液体培养条件。采用垂直平板聚丙烯酰胺电泳方法分析了体细胞胚胎发生过程中三种同工酶的变化。通过压片法观察了长期继代过程中胚性愈伤组织细胞及其再生植株根尖细胞染色体数目的变化。具体结果如下： 合子胚在4-6 ℃低温条件下保存1~3个月后，接种于LP+2mg/L2.4-D+lmg/L 6-BA的培养基上，黑暗条件下培养1个月后，产生浅黄色、褐色和白色半透明三种愈伤组织，其中白色半透明愈伤组织是胚性愈伤组织。黑暗中胚性愈伤组织在MS+lmg/L 2，4-D+lmg/L KT的继代培养基上可保持旺盛的增殖能力和分化潜力。当胚性愈伤组织转到MS+5mg/L ABA+50g/L PEG+5mg/L AgN03的分化培养基上，1个月后可产生大量正常的子叶期成熟体细胞胚。成熟体细胞胚在相对湿度为75%的条件下干化20天后，转到含0.5%活性炭的无激素1/2MS基本培养基上，约40天后长出1.5—2.5cm的根，约60天后长出真叶。光，ABA、蔗糖、AgN03 PEG浓度是影响体细胞胚胎发生的主要因素。 在相同的培养条件下，以新产生的子叶期体细胞胚为外植体，也可诱导体细胞胚胎发生。 胚性愈伤组织起源于合子胚子叶和下胚轴的表皮及表皮下的一些细胞。胚性愈伤组织中的一些单个胚性细胞经过第一次分裂产生两个细胞，即胚细胞和胚柄细胞，它们继续进行分裂几次以后形成胚性胚柄团结构。胚性胚柄团在分化培养基上可发育为成熟的子叶期胚。体细胞胚的成熟过程大致可分四个时期：胚性胚柄团、球形胚至鱼雷形胚、子叶前期胚和子叶期成熟胚。通过PAS反应研究后发现，在体细胞胚发育过程中，淀粉粒在胚性胚柄团时期开始积累，至心形胚时期达到积累高峰，子叶胚时期仅在器官原基及其附近细胞肉有淀粉粒分布。结果表明，淀粉是体细胞胚胎发生的一种重要能量来源。 在初始细胞密度为3.O%（鲜重）、摇床转速为150r/min的条件下，用与固体培养基成分相似的液体培养基对胚性愈伤组织进行悬浮培养，胚性愈伤组织的生长率大大提高。在悬浮培养过程中，培养物的鲜重、干重、紧实细胞体积及胚性胚柄团数目依次在6～10天内达到高峰。培养液的pH值和电导率分别在6—8天达到最低点。 胚性和非胚性愈伤组织的三种同工酶酶谱都明显不同;胚性愈伤组织的过氧化物酶和酸性磷酸酯酶活性较高，而非胚性愈伤组织的酯酶活性较高。体细胞胚发育过程中，三种同工酶酶谱都呈规律性变化;j活性都有逐渐增强的趋势，但酸性磷酸酯酶活性到了最后时期又突然下降。 胚性愈伤组织经过长期继代后，生长率和分化能力没有明显变化，但有些细胞内染色体数目发生了无规律的变化( 2n=7—24，2n>28)，而再生植株根尖细胞染色体数目比较稳定( 2n=28).

几种固氮菌突变种固氮酶的特性及晶体生长

一，缺失nifZ的棕色固氮菌突变种钼铁蛋白的晶体生长的研究进展 在一定的结晶条件下，缺失nifZ的棕色固氮菌突变种钼铁蛋白将从溶液中结晶出深棕色的短斜四棱柱晶体。PEG 8000、MgCl2、NaCl、Tris的浓度及缓冲液的pH对该蛋白的结晶及晶体生长影响的系统研究表明，它们的浓度和pH较低时，不出晶体;当pH高于8.0，随着前三种化合物浓度的逐渐提高，便在一周内出现大量小品体;再提高浓度后，便延长结晶时问但出质好、数少而个大的晶体;然后晶体随浓度的提高而又变小、变多、甚至晶质变差，直至不再出晶体。影响晶体生长的各因子的最适浓度随其它条件的改变而有所不同。当缓冲液的pH为8.2而PEG 8000，MgCl’、NaCI、蛋白质和Tris的浓度分别为1.86%、300 mmol/L、400 mmoUL、4.64g/L、53 mmo/L时，首次发现在一滴悬滴结晶液中只有一颗较大的优质晶体（最大两边线度均为0.16mm）。 二，从分别含Mn和Cr的培养基中生长的固氮菌突变种UW3中纯化的固氮酶的特性和结晶 缺失nifH基因的棕色固氮菌突变种UW3，在有钼环境中不能固氮生长，但能在无钼而含MnS01或Na2Cr01的无氮培养基中固氮生长。分别经超声破碎、加热除去部分杂蛋白、离子交换柱层析和Sephacryl S-200或S-300柱层析的分离纯化，分别得到二种固氮酶组分l蛋白。金属元素测定表明，这两种蛋白除含铁元素外还分别含有锰和铬元素。它们的吸收光谱、CD和AR谱互不完全相同，并都与OP-MoFe蛋白存在较大差异。含Mn固氮酶也能还原C2H2、质子和N2，对它们的还原的比活性都分别约为MoFe蛋白活性的50%。初步结果表明，这一突变种在这两种培养条件下都可能已表达了不同于已发现的三种固氮酶的新固氮酶组分l蛋白-MoFe、VFe和FeFe蛋白，分别为含Mn或Cr的固氮酶组分1蛋白，分别被称为uw3，-MnFe蛋白和UW3-CrFe蛋白。通过对PEG 8000、MgCI2、NaCI和缓冲液的种类和浓度等结晶条件的大量优化组合实验，首次获得uw3-MnFe蛋白和UW3-CrFe蛋白的的晶体。最大晶体为21.4×14.3×2.1μm。

含铬或锰的新型固氮酶的纯化, 特性和结晶—棕色固氮菌突变种UW3中CrFe蛋白和MnFe蛋白的研究

以含MnSO4或Na2CrO4的无钼无氨的修改Burk’s培养基， 培养不能合成含钼固氮酶体系的棕色固氮菌 (Azotobacter vinelandii Lipmann) 突变种UW3， 发现在一定浓度范围内， MnSO4或Na2CrO4的加入有助于促进其生长。 菌体生长和C2H2还原活性曲线测定结果表明， 这种促进作用很可能是通过Mn或Cr取代Mo， 参与组装固氮酶中心原子簇， 从而影响固氮活性而实现的。 利用阴离子交换 (DEAE-52和Q-Sepharose FF) 和凝胶过滤 (Sephacryl S-200) 柱层析从两种菌体中纯化得到固氮酶组分Ⅰ蛋白 (分别命名为MnFe蛋白和CrFe蛋白)， 并对其进行了特性研究。 厌氧天然聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 和SDS-PAGE结果显示， 两种蛋白均为两种亚基组成的四聚体。 亚基可以与OP MoFe蛋白抗体发生免疫反应， 分子量分别略小于野生种OP MoFe蛋白的α和β亚基。 CrFe蛋白的C2H2还原活性， Ar下放氢活性和固氮活性分别相当于OP MoFe蛋白的36%， 38%和43%， 而MnFe蛋白活性相当于OP MoFe蛋白的50%左右， 并且两种蛋白与OP MoFe蛋白具有相似的固氮电子利用率。 对两种蛋白金属含量的测定证实其中分别含有Mn和Cr， 但仍存在少量Mo污染。 与OP MoFe蛋白相比，这两种蛋白圆二色谱的摩尔椭圆率 ([θ]) 除在450nm较接近外，在可见光区的其它波长处均显著降低。 与DT还原OP MoFe蛋白相似， CrFe蛋白和MnFe蛋白具有g≈4。3、3。7和2。0的特征EPR信号， 但各处信号强度比例不同。 在对污染Mo可能引起的信号进行校正后，CrFe蛋白的三个信号强度分别相当于DT还原OP MoFe蛋白的20%， 0%和10%， 而MnFe蛋白则分别相当于112%， 49%和65%。 上述结果表明， CrFe蛋白和MnFe蛋白与OP MoFe蛋白金属原子簇的主要差异很可能在于FeMco (M=Cr， Mn或Mo)的M种类， 而P-cluster结构和组成均未见大的差异。 利用气相扩散悬滴法对MnFe蛋白和CrFe蛋白结晶条件进行了筛选和初步优化， 确定了以Tris/Hepes， NaCl， MgCl2和PEG 8000为主要变量的沉淀剂体系， 寻找各组分对于晶体生长的最适浓度。 以此为基础探讨了应用气相扩散坐滴法和液-液扩散法对两种蛋白结晶条件的优化。 在一定条件下， 两种蛋白分别通过液-液扩散法获得了优质大单晶。 对从CrFe蛋白和MnFe蛋白制备物中培养出的蛋白质晶体的SDS-PAGE鉴定显示， 晶体由与OP MoFe蛋白相似的两种亚基组成。 通过 “神舟三号” 飞船搭载实验探讨了空间微重力对于厌氧蛋白质结晶的影响， 结果表明， 微重力有助于避免孪晶形成， 并具有长期培养后获得适于进行X-射线衍射分析的优质大单晶的潜在前景。 结合空间科学使固氮酶结构与功能研究得以发展， 这项工作是有意义并且可行的。

缺失nifZ的棕色固氮菌突变株DJ194的钼铁蛋白研究—纯化、结晶及金属簇的组成与分布

从棕色固氮菌DJ194菌株得到的固氮酶粗提液经DEAE－52、Sephacryl S－200及Q－Sepharose等柱厌氧层析，分离纯化得到nifZ基因缺失的固氮酶MoFe蛋白（ΔnifZ Av1）制备物。通过天然电泳和SDS变性电泳发现早期纯化所得的ΔnifZ Av1制备物中残存相当比例的三个主要污染蛋白：属于热激蛋白60家族（Hsp 60 family）成员的分子伴侣GroEL、糖酵解过程的一个多功能酶——6-磷酸葡萄糖异构酶（6-Phosphate Glucose Isomerase，PGI）及棕色固氮菌细菌铁蛋白（Bacterioferritin，Bfr）。初步鉴定表明，它们分别为由约55kD亚基组成的14聚合体，62kD亚基组成的10聚体和20kD亚基组成的24聚体。首次发现PGI有如此高的聚合体。虽然GroEL和PGI在天然电泳中的迁移率小于ΔnifZ Av1蛋白，但它们的亚基在SDS变性电泳中与ΔnifZ Av1亚基具有相似的迁移率，互相重叠，从而使变性电泳比天然电泳显出更高的ΔnifZ Av1纯度;而细菌铁蛋白虽然不会在变性电泳中污染ΔnifZ Av1，但往往会在ΔnifZ Av1制备物的结晶中优先或较多地结晶出来,从而给它的晶体生长和解析研究带来干扰（Zhao等，2004）。 通过Sephacryl S－200柱洗脱峰收集精度的调整及Q－Sepharose柱的NaCl浓度梯度洗脱，得到了纯度大于90%的ΔnifZ Av1制备物。它的厌氧天然电泳及其免疫印渍（Western blotting），以及SDS-变性凝胶电泳显出，ΔnifZ Av1的电泳迁移率、分子量和亚基组成等均与野生种钼铁蛋白（OP Av1）相似，表明nifZ基因缺失并未改变ΔnifZ Av1的α2β2四聚体构成。ΔnifZ Av1的Mo含量、EPR信号（g≈4.3, 3.65和2.01）和520-660 nm附近的圆二色摩尔消光系数（Δε）也都与OP Av1较相似，从而表明ΔnifZ Av1含有与OP Av1数量相当的具有3/2自旋态的还原FeMoco。然而，ΔnifZ Av1的Fe含量和对底物（C2H2、H+和N2）的还原活性都较低, 分别约为OP Av1的74%和46-50%;而反映P-cluster状况的450nm附近的Δε也明显低于OP Av1。此外，与OP Av1相同的ΔnifZ Av1在g≈2.01的EPR信号却与推测含由双[4Fe-4S]簇组成的P-cluster前体的His-tagged ΔnifZ Av1（Hu等，2004）的信号明显不同。这就表明，ΔnifZ Av1与OP Av1的差别不在于FeMoco的结构、含量和氧还状态，也不在于P-cluster的结构和氧还状态，而仅在于ΔnifZ Av1中P-cluster数目的减少（约一半）。据此推测出与国外提出的His-tagged ΔnifZ Av1模型不同的ΔnifZ Av1(DJ194)的如下结构模型。一个αβ亚基对含有一个FeMoco和一个P-cluster，而另一个αβ亚基对只含FeMoco，其P-cluster区域则是空的。由于nifZ基因的缺失只造成了钼铁蛋白中两个P-cluster中的一个不能组装，因此推测P-cluster的组装可能不是受单一基因产物的影响。根据Lee等（1998）对nifZ产物（NifZ）和nifW产物（NifW）可以形成[NifWx-NifZy]多聚体，并可能是通过同一途径来影响固氮酶的合成的研究，提出NifZ的如下的可能作用机理。[NifWx-NifZy]多聚体影响与P-cluster合成相关的金属簇(如[4Fe-4S])的进入和P-cluster的最终合成，而其中的一个αβ对上的P-cluster的形成可能较多的受到NifZ的影响;nifZ的某些突变或缺失虽然不影响[NifWx-NifZy]多聚体的形成，但对于更依赖于NifZ的那个αβ对上的P-cluster的合成可能会产生不同的影响。 对这一高纯度的ΔnifZ Av1制备物结晶的研究表明，使用Tris缓冲系统的25%PEG 6K/MgCl2晶体培养液可以在较短的晶体培养时间内得到较大的晶体;在一定条件下，pH为7.5和8.3的培养液对出晶数和晶体大小的影响不明显;PEG 6K的浓度与MgCl2的浓度对出晶大小的影响有一定的相关性，即较低的PEG浓度在较低的MgCl2浓度下和较高的PEG浓度搭配较高的MgCl2浓度较易长出较大的晶体。虽然ΔnifZ Av1制备物的纯度达到90%以上，并且在染铁实验中表明其基本不含细菌铁蛋白，但我们在对得到的晶体进行电泳鉴定中仍然发现了一种与以前报导的砖红色晶体不同的深棕红色的细菌铁蛋白晶体，之所以颜色不同可能和所含的铁元素的氧化状态有关。不过在所鉴定的5支结晶管中只在一个管内发现了与固氮酶晶体同时存在的这种细菌铁蛋白晶体，说明通过蛋白纯度的提高减少细菌铁蛋白的含量以及晶体培养条件的优化，细菌铁蛋白晶体形成的几率就可大大降低。

拟南芥生育酚环化酶基因（VTE1）在烟草中的表达及功能研究

维生素E（V.E.）在动物细胞内具有抗氧化等重要作用，但在植物体内的功能却鲜为人知。本研究以烟草为材料，利用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法在烟草中过量表达拟南芥来源的VTE1。通过外源VTE1基因的过量表达提高内源V.E.的含量, 进而研究转VTE1基因植株对胁迫的耐受性反应，以探讨植物体内V.E.含量与植物胁迫耐受性的关系，为植物抗逆机理的研究和利用奠定基础。 本实验利用CaMV35s启动子与拟南芥来源的生育酚环化酶基因（VTE1）构建的嵌合表达载体，以根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草W38。实验结果表明: 1. 具有卡那霉素抗性的再生植株经PCR检测，得到了与阳性对照一致的495bp的目标片段;经RT-PCR检测，其中90%有外源基因表达。 2. 转基因植株的V.E.含量比对照植株高2倍左右，个别株系高达10.16倍。 3. VTE1基因的表达受环境胁迫的影响，不同程度的冷冻、热激、PEG处理均可影响VTE1基因的表达。经过冷冻处理60分钟、热处理20小时、以及PEG处理6小时，该基因表达量均有提高。冷冻处理条件下该基因的表达量是未处理的3倍，热处理条件下是未处理的2倍左右，PEG处理是未处理的3.5倍。在冷冻、热激、PEG胁迫处理过程中，转化苗的V.E.含量变化与外源VTE1基因的表达相对应，表明转化苗的V.E.合成主要由外源VTE1基因的终产物VTE1催化;在冷冻、热激、PEG胁迫处理过程中，V.E.含量与APX、CAT、SOD等抗氧化酶活性之间存在一定程度的正相关性，表明V.E.与这些抗氧化酶共同组成了植物体内的抗氧化网络，保护植株免受氧化损伤;V.E.的变化与MDA之间存在一定程度的负相关性，减轻植物的过氧化损伤; 4. V.E.可提高植物的抗旱性，我们检测了11个转化烟草株系的叶片相对含水量（RWC），在大多数转化烟草植株中，干旱胁迫24小时的RWC都比野生型高，高出0.16-45%（p<0.001）。表明转基因烟草比野生型更抗旱; 5. 在耐盐性实验中转基因植株对盐的抗性明显高于野生型烟草;同时，在不同盐浓度（150、250mM）胁迫下转基因植株V.E.含量比未转化植株增加了1.3-1.8倍。 这些研究结果表明，在植物体内转入V.E.代谢途径中的单个外源基因，可有效提高内源V.E.合成，提高植株对环境胁迫的抗性。

甘蓝型油菜中脯氨酸积累的分子调控机制

　　渗透胁迫下植物中游离脯氨酸的积累被普遍认为对植物有保护作用。本文对甘蓝型油菜（Brassica napus）中的脯氨酸积累及其调控机理进行了研究。正常生长条件下幼苗叶中脯氨酸含量最高，根中脯氨酸含量最低，盐胁迫后不同部位脯氨酸积累程度相近。盐浓度200 mM起，幼苗开始有明显脯氨酸积累,并随着浓度的增加而增加。PEG处理后脯氨酸积累要明显高于ABA和盐胁迫处理后脯氨酸积累。在成株中，生殖器官中脯氨酸含量明显高于营养器官中脯氨酸含量。 　　我们克隆了编码Δ1-二氢吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）,鸟氨酸转氨酶(OAT)和脯氨酸脱氢酶(PDH)的四个基因的cDNA。通过Southern杂交检测P5CS基因在甘蓝型油菜及其亲本白菜型油菜和甘蓝中的拷贝数，发现杂交条带在4倍体油菜中并没有显著的多于其两个2倍体亲本，推测有可能是在物种进化的过程中发生了基因丢失。 　　利用实时定量PCR的方法检测了渗透胁迫下甘蓝型油菜中BnP5CS，BnOAT和BnPDH等基因的表达水平。在ABA处理，盐处理和干旱处理时，BnP5CS1和BnP5CS2的表达在脯氨酸积累开始前就开始有明显上调，但是BnP5CS1的上调水平要比BnP5CS2高许多。BnOAT在ABA处理后表达水平没有太大的变化，在盐胁迫后甚至有一点下调，在干旱处理后却表现为一定程度的上调。另一方面，BnPDH的表达在ABA处理，盐胁迫和干旱胁迫后都受到了抑制。在成株不同器官相关基因表达的研究中发现，BnOAT在叶中表达量最高，BnP5CS和BnPDH在花蕾和花中的表达水平都比其他器官中要高。 　　我们的结果说明，渗透胁迫下甘蓝型油菜中的脯氨酸积累是脯氨酸合成途径的诱导和脯氨酸降解途径的抑制共同作用的结果。在轻度的渗透胁迫下，谷氨酸合成途径占主导地位，而在较为严重的渗透胁迫后期，谷氨酸合成途径和鸟氨酸合成途径共同起作用。甘蓝型油菜生殖器官花和花蕾中脯氨酸的代谢非常旺盛，说明脯氨酸可能在花发育中起着一定的作用。

Culture of Moina micrura on various organic waste products

Moina micrura, a cladoceran species, is considered to be one of the best live food organisms for rearing the young larval stages of fish and prawn. Considering the importance of this species in hatchery operations the present study was undertaken to record its fecundity and life span and to culture it using different locally available organic waste products. In indoor culture, a maximum production of 2600 ind/1 and a minimum of 1050 ind/1 were obtained when treated with gram + maize oilcake and "till" oilcake respectively. In outdoor culture, a highest production of 6000 ind/1 was achieved with "Alsi" and "till" oilcakes and a lowest density of 1050 ind/1 with coconut oilcake and raw cattle dung was obtained with an inoculation rate of 5 ind/1.

典型草原优势植物养分回收特性对养分和水分梯度变化的响应

养分回收是植物衰老时，养分从衰老组织向活的组织体转移的一种过程。该过程延长了养分在植物体内的滞留时间，提高了植物保持养分的能力，因此是植物适应养分贫瘠生境的策略之一。全球气候变化，包括降水格局改变和氮（N）沉降增加，改变了生态系统正常的生物地球化学循环，因此可能会对植物的养分回收特性产生影响。研究不同N、磷（P）、水梯度上，植物物种养分回收特性的响应格局，对于预测N沉降增加和降水格局改变对物种养分利用策略的潜在影响，具有一定的理论与实践意义。本研究以中国科学院植物研究所多伦恢复生态学实验站长期施N肥实验（0，1，2，4，8，16，32，64 g N m-2 yr-1等8个水平）为研究平台研究了克氏针茅（Stipa krylovii）群落中优势植物养分回收随N素添加梯度的变化，同时结合三个盆栽控制实验（施N肥实验：0，0.5，1，2，4，8，16，32，64，128 g N m-2等10个水平;施P肥实验：梯度同施N肥实验;控水实验：3600，4000，4500，5143，6000，7200，9000，12000，18000，36000 mL pot-1等10个水平），主要探讨了羊草（Leymus chinensis）养分回收效率（从衰老组织中回收转移的养分百分数，RE）和养分回收度（以枯叶中养分浓度衡量，RP）以及其它叶片养分特性(绿叶养分浓度和比叶面积SLA)对环境因子改变的响应格局。同时，我们还调查了枯叶C:N比和C:P比等参数，研究环境因子改变对凋落物分解的影响。 1）连续4年施N肥显著降低了五个物种叶片N素回收度（NRP），对P素回收度（PRP）的影响在各物种间差异较大，但低N提高了多数物种的PRP;物种间，冷蒿（Artemisia frigida）RP（枯叶N和P浓度分别为14.3±2.0 mg g-1和0.68±0.09 mg g-1）最低，砂韭（Allium bidentatum）（N：5.2±0.2 mg g-1，P：0.12±0.01 mg g-1）最高。沿施N梯度，N素回收效率（NRE）的变化趋势在物种间差异较小但在方法间（叶干重水平，叶面积水平和单株水平）差异较大，而P素回收效率（PRE）的变化在物种间和方法间差别都较大。叶干重水平和叶面积水平上，NRE在四个物种中表现出显著降低的趋势，PRE只在糙隐子草（Cleistogenes squarrosa）和星毛委陵菜（Potentilla acaulis）中显著降低，其它三个物种变化不显著。单株水平上，所有物种NRE（除了克氏针茅）和PRE均与施N量梯度无显著性关系。物种间，砂韭的RE最高（＞80.0%），冷蒿和星毛委陵菜最低（＜60.0%）。方法间，叶片水平上的RE均高于单株水平上。沿施N肥梯度，两个禾本科物种SLA无显著变化规律，而其它三个物种SLA表现出先增加后变化不大的趋势。物种间，最高和最低的SLA分别表现在冷蒿和克氏针茅。沿施N肥梯度，五个物种C:N比呈先显著降低后缓慢降低的趋势。物种间，最大和最小的C:N比分别出现在砂韭和冷蒿。 2）盆栽施N肥实验中，一定范围内，施N肥显著提高了羊草地上地下生物量、SLA和绿叶N浓度，显著降低了C:N比、NRP、NRE和PRE，但对绿叶P浓度、叶片PRP和C:P比无明显影响。平均枯叶N浓度和枯叶P浓度分别为16.2 mg g-1和1.01 mg g-1，平均NRE和PRE分别为46.1﹪和58.1﹪。10月时，地下生物量和养分积累均高于地上部分。 3）盆栽施P肥实验中，一定范围内，施P肥显著地提高了羊草地上地下生物量、SLA、绿叶N浓度和绿叶P浓度，显著降低了C:N比、C:P比、NRP、PRP和PRE，但对NRE无显著影响。平均枯叶N浓度和枯叶P浓度分别为9.9 mg g-1和7.43 mg g-1，平均NRE和PRE分别为58.2﹪，平均PRE为56.1﹪。10月时地下部分生物量和N库积累均高于地上部分，而P库在两个部分间差别不大。 4）盆栽控水实验中，一定范围内，供水量增加显著增加了羊草地上地下生物量、SLA、NRP、PRP、PRE、C:N比和C:P比，显著降低了绿叶N浓度，但对绿叶P浓度和NRE无显著性影响。平均枯叶N浓度和枯叶P浓度分别为10.4 mg g-1和0.32 mg g-1，平均NRE和PRE分别为54.4﹪和76.8﹪。10月时，地下部分生物量和养分积累均高于地上部分。 以上结果表明，N、P和水分因子的改变影响了植物生物量和养分分配、叶片养分特性、养分回收能力以及枯叶分解质量等，且不同梯度影响程度也不同。因此，未来全球变化包括N沉降增加和降水格局改变可能影响植物养分利用策略和凋落物分解特性，进而可能对植被-土壤系统养分循环产生影响。

横断山特有植物区系的物种多样性与生物地理学研究

前人对横断山区特有植物的宏生态学研究已有一定的资料积累，对横断山区在全球生物多样性保护中的关键地位和特有现象已有基本共识：（1）横断山区是全球生物多样性关键地区和生物多样性优先重点保护的热点地区之一；（2）横断山区不仅是中国的三大特有植物分布中心之一，而且是新特有中心和物种分化中心，特有现象的生态成因大于历史成因。横断山区种子植物种类丰富，且具有较高的特有现象，其中既有古特有成分也有新特有成分但更多的是新特有成分。但目前，关于横断山区特有现象与生态特征、特有种分布与物种丰富度、特有种丰富度与海拔梯度以及植被的关系等仍缺乏深入的研究。针对上述问题，本论文初步研究了横断山区（1）特有种的生活型、种子散布方式、传粉方式和繁育系统等生态特征，各生态特征之间的相关关系，以及它们的进化地位；（2）特有种的水平分布格局及环境成因；和（3）特有种和生态特征沿海拔梯度的变化规律。主要结论如下： 1．横断山区含特有植物2396个分类群（包括种、亚种和变种），隶属于372属90科。特有类群在372个属中的分布非常不均匀，约一半的特有类群（50.2%）集中分布在较少的属中（占总属数的6%），含特有类群的属大小差异很大，重要的大属是：马先蒿属、乌头属、杜鹃花属、翠雀属、紫堇属、虎耳草属、报春花属、小檗属、黄芪属、凤毛菊属、蚤缀属、橐吾属、龙胆属、景天属、柳属、苔草属、香茶菜属、凤仙花属、紫菀属、鼠尾草属和蝇子草属等，这些属多以横断山为分布和分化中心，为新特有成分。另外，地面芽植物和隐芽植物等占有绝对优势，而矮高位芽植物、高位芽植物、地面芽植物等占有较低的比例，反映了该特有区系的高山、亚高山植物区系特点，但又不乏与热带植物区系的渊源。与世界其它高山地区相比，该特有区系中的地面芽植物、隐芽植物和一年生植物有较高的比例。 2．草本、风力散布种子、昆虫传粉和两性花等为该特有植物区系的优势生态特征。除传粉方式和生活型间无明显的相互作用外，其它生态特征间都存在明显的正相关关系。定量化研究结果表明该特有区系特有种的传粉方式进化可塑性很小，处于保守（或原始）的进化地位。相反，种子散布方式和繁育系统的进化可塑性较大，处于衍生（或进化）的进化地位，是不同种系在历史发育过程中不同阶段的产物。生活型的进化地位在种间有较大的分异，具较小或较大可塑性的各占有一定的比例，因此生活型中既保留处于保守（或原始）的进化地位也有处于衍生（或进化）的进化地位，两种进化状态的生活型在该特有区系中并存，该特征不但是种系在进化早期决定的，同时也是不同种系在进化过程中获得的。 3． 特有种的分布不均匀，较高比例的特有种局限分布在较少的几个地区，北纬28-29°线是特有种丰富度重要的南北分界线。聚类分析结果表明其分布可以划分为3个物种聚集群：（1）北纬28-29°以北、北纬34°以南的藏东川西北物种聚集群；（2）北纬28-29°以南、北纬26°以北的藏东南—滇西北—川西南物种聚集群；和（3）北纬26°以南、北纬25°以北的滇西北物种聚集群。其中，藏东南—滇西北—川西南物种聚集群特有种丰富度最高，是横断山区特有种分布的核心区；滇西北物种聚集群特有种丰富度最低，藏东川西北物种聚集群特有种丰富度居中。藏东南—滇西北—川西南物种聚集群之所以特有种类丰富很有可能与该小区具有高的物种丰富度和落叶阔叶林、常绿/落叶针叶林的分布有密切的联系。在区域尺度上，横断山区总物种的分布中心与特有中心存在分异。尽管两者都处于北纬28-29°以南、北纬26°以北的藏东南—滇西北—川西南小区，但特有中心具有较小的分布范围，而总物种的丰富度中心分布范围较大。因此，我们推测特有分布中心不但与落叶阔叶林和常绿/落叶针叶林有密切的联系，而且也与物种丰富度有关。特有种与植被类型尤其是与常绿阔叶林和落叶阔叶林的关系研究对揭示特有现象的发生、性质和特点有一定的意义，有关研究尚需进一步开展。此外，海拔高差、区系物种丰富度、地理位置和单元面积为特有种丰富度地理分布的总体变异提供了74.7%的解释。 4．研究地区的南缘和东南缘有高比例的木本特有植物，而草本特有植物的比例相对最低，反映出该横断山区南缘的特有植物与热带植物区系的渊源关系，其成分多为一些古老的特有成分；而高比例和较高比例的草本特有植物在研究地区普遍存在，包括研究区域南、北的大部分地区，显然草本特有植物是横断山的优势特有成分。这种以草本特有植物为特征的高山、亚高山特有植物区系有别于我国其它两大特有植物分布中心。该特有中心的成因的最终解释还需要从物种形成（speciation）、灭绝（extinction）和扩散（biogeographic dispersal）——这三个直接影响一个地区物种数量变化的过程来考虑。 5．特有种丰富度沿海拔梯度呈“单峰” 变化曲线，在中海拔段达到峰值。与中国特有种、世界广布种相比，特有种的峰值最高，最适海拔分布范围最窄。特有率随海拔上升而逐渐增高，但在海拔5000-5500 m左右突然上升，在海拔6000 m左右达到最高值。说明（1）物种分布区和丰富度存在着正相关，即特有种具有小的分布区，而广布种的分布区较大；（2）特有率的线性变化规律反映了物种丰富度和特有现象之间的关系，即物种丰富度最大峰值以上海拔段物种数量减少，但特有率增加，说明了该特有区系的高海拔性质。 6．特有种沿海拔梯度表现出大小明显不同的物种聚集群，可能与横断山区的山地垂直气候及相应的植被类型有关。在2600-4600 m海拔段特有种数量最多，这可能与该海拔段分布着落叶阔叶林和常绿/落叶针叶林有密切的联系。特有植物沿海拔梯度可分为四个不同海拔段的物种聚集群：（1）200-1000 m；（2）1000-2600 m； （3）2600-4600 m；和（4）4600-6400 m。在对应海拔段依次分布着干热河谷稀树灌草丛、常绿阔叶林、落叶阔叶林和常绿/落叶针叶林、高山流石滩稀疏植丛。其中，分布在2600-4600 m海拔段的物种丰富度最高，1000-2600 m海拔段的物种丰富度次之，200-1000 m、4600-6400 m两个海拔段物种丰富度较低。 7．特有区系中占优势的生态特征包括草本、风力散布种子、虫媒传粉、两性花和克隆性等对海拔梯度的适应也呈“单峰” 变化曲线，但该主要特征与次要的生态特征（木本、动物散布种子、风媒传粉、单性花和非克隆性）相比，均具有较高的海拔峰值和较窄的最适分布范围，反映了主要生态特征对中、高海拔的适应特点。主要的生态特征与次要的生态特征并存构成了横断山区特有区系的基本生态特征。