Identification of Drosophila heart-specific Cis-Regulatory Modules under Hox control

Cardiac morphogenesis is a complex process governed by evolutionarily conserved transcription factors and signaling molecules. The Drosophila cardiac tube is linear, made of 52 pairs of cardiomyocytes (CMs), which express specific transcription factor genes that have human homologues implicated in Congenital Heart Diseases (CHDs) (NKX2-5, GATA4 and TBX5). The Drosophila cardiac tube is linear and composed of a rostral portion named aorta and a caudal one called heart, distinguished by morphological and functional differences controlled by Hox genes, key regulators of axial patterning. Overexpression and inactivation of the Hox gene abdominal-A (abd-A), which is expressed exclusively in the heart, revealed that abd-A controls heart identity. The aim of our work is to isolate the heart-specific cisregulatory sequences of abd-A direct target genes, the realizator genes granting heart identity. In each segment of the heart, four pairs of cardiomyocytes (CMs) express tinman (tin), homologous to NKX2-5, and acquire strong contractile and automatic rhythmic activities. By tyramide amplified FISH, we found that seven genes, encoding ion channels, pumps or transporters, are specifically expressed in the Tin-CMs of the heart. We initially used online available tools to identify their heart-specific cisregutatory modules by looking for Conserved Non-coding Sequences containing clusters of binding sites for various cardiac transcription factors, including Hox proteins. Based on these data we generated several reporter gene constructs and transgenic embryos, but none of them showed reporter gene expression in the heart. In order to identify additional abd-A target genes, we performed microarray experiments comparing the transcriptomes of aorta versus heart and identified 144 genes overexpressed in the heart. In order to find the heart-specific cis-regulatory regions of these target genes we developed a new bioinformatic approach where prediction is based on pattern matching and ordered statistics. We first retrieved Conserved Noncoding Sequences from the alignment between the D.melanogaster and D.pseudobscura genomes. We scored for combinations of conserved occurrences of ABD-A, ABD-B, TIN, PNR, dMEF2, MADS box, T-box and E-box sites and we ranked these results based on two independent strategies. On one hand we ranked the putative cis-regulatory sequences according to best scored ABD-A biding sites, on the other hand we scored according to conservation of binding sites. We integrated and ranked again the two lists obtained independently to produce a final rank. We generated nGFP reporter construct flies for in vivo validation. We identified three 1kblong heart-specific enhancers. By in vivo and in vitro experiments we are determining whether they are direct abd-A targets, demonstrating the role of a Hox gene in the realization of heart identity. The identified abd-A direct target genes may be targets also of the NKX2-5, GATA4 and/or TBX5 homologues tin, pannier and Doc genes, respectively. The identification of sequences coregulated by a Hox protein and the homologues of transcription factors causing CHDs, will provide a mean to test whether these factors function as Hox cofactors granting cardiac specificity to Hox proteins, increasing our knowledge on the molecular mechanisms underlying CHDs. Finally, it may be investigated whether these Hox targets are involved in CHDs.

Parapoxvirus: basi genomiche della patogenesi

Parapoxvirus (PPV) are member of a genus in the family poxviridae which currently encompasses four species: the prototype orf virus (OV), bovine papular stomatitis virus (BPSV), pseudocowpox virus (PCPV) and parapoxvirus of New Zealand red deer (PVNZ). PPVs cause widespread, but localized diseases of small and large ruminants and they can also be transmitted to man. Knowledge of the molecular biology of PPV is still limited as compared to orthopoxviruses, especially vaccinia virus (VACV). The PPV genome displays a high G+C content and relatively small size for poxvirus. Coventional electron microscopy displays PPV virions with ovoid shape and slightly smaller in size than the brickshaped orthopoxviruses. The most striking feature, which readily enables identification of PPV, is a tubule-like structure that surrounds the particle in a spiral fashion. PPV genome organization and content is very similar to that of other poxviruses, the central region contain 88 genes which are present in all poxviruse, in contrast the terminal regions are variable and contain a set of genes unique to the genus PPV. Genes in the near-terminal regions of the genome are frequently not essential for growth in cultured cells encoding factors with important roles in virushost interactions including modulating host immune responses and determining host range. Recently it was suggested that the open reading frames (ORFs) 109 and 110 of the OV genome have a major role in determining species specificity during natural infection in sheep and goats. This hypothesis is based on the analysis of a few number of sequences of different sheep and goats viral isolates. PPV replicate into the cytoplasm of infected cells and produce three structurally different infectious particles: the intracellular mature virions (IMV), intracellular enveloped virions (IEV) and the extracellular enveloped virions (EEV). The vaccinia A33R and A34R hotologue proteins encoded by the ORFS 109 and 110 are expressed in the envelope of the IEV and EEV. The F1L immunodominant protein of orf virus is the major component of the surface tubule structure of the IMV and can post-translationaly insert into membranes via Cterminal, hydrofobic anchor sequence like its orthologue VACV H3L protein. Moreover the F1L protein binds to glycosaminoglycans on the cell surface and has an important role in IMV adsorption to mammalian cells. In this study we investigated the morphogenesis of the PPV through the construction of a mutant virus deleted of the F1L protein. A study of the deleted virus life cycle was conducted in different type of cells and its morphology was observed with electron microscopy. It was demonstared that F1L protein have important role in morphogenesis and infectivity. Moreover it is essential to determine the spiral fashion of the tubule like structure of the virion surface. Some pathogenetic aspects of the PPV infection were studied, in particular the protein implicated in the host range were analysed in detail. An experimental infection with OV and PCPV was conducted in goats and sheep. After infection, the severity of the lesions were comparable in both the animal species. The OV did not result in severe disease neither in sheep nor in goats, suggesting that host factors, rather than virus strain characteristics, may play an important role in the pathogenesis of the Parapoxvirus infections. The PCPV failed to produce any lesion in both sheep and goats, ruling out the possibility of any recombination between PCPV and OV during natural infection in these animal species. The phylogenetic analysis of the ORFs 109 and 110 from several goats and sheep viral isolates showed a clustering based on the antigenic content of the protein that was independent from species and geographic origin.

In vivo- und In vitro-DNA-Verpackung in virusähnliche Partikel des Humanen Papillomvirus Typ 33

Die Rolle der DNA-Bindungsdomäne der Kapsidproteine L1 und L2 humaner Papillomviren (HPV) wird bezüglich der in vitro DNA-Verpackung kontrovers diskutiert und ist für die in vivo DNA-Verpackung noch ungeklärt. Ich konnte zeigen, dass die L1 Proteine der HPV Typen 16, 18 und 33 DNA binden, nicht aber das HPV33 L2 Protein. Die DNA-Bindungsdomäne habe ich auf die letzten sieben Aminosäuren des Carboxyterminus eingegrenzt. In Funktionsanalysen zeigte ich, dass die DNA-Bindungsdomäne des L1 Proteins für den Einschluss von Markerplasmid DNA in Kapside in einem in vivo Ansatz essentiell ist, nicht aber für eine in vitro DNA-Verpackung. Das L2 Protein, das in Kapside eingebaut wurde, denen die L1 DNA-Bindungsdomäne fehlte, konnte die DNA-Verpackung nicht aufrechterhalten.Zusätzlich habe ich die Infektiösität in vitro und in vivo hergestellter DNA-haltiger Kapside (Pseudovirionen) verglichen. Dabei konnte ich zeigen, dass in vivo gewonnene Pseudovirionen, die DNA in Form von Chromatin enthalten, bis zu fünffach infektiöser sind als Pseudovirionen, die in vitro hergestellt wurden und histonfreie DNA enthalten. Biochemische und strukturelle Unterschiede konnten zwischen den zwei Arten von Pseudovirionen nicht festgestellt werden. Chromatin scheint demzufolge die Infektiösität der Pseudovirionen zu verstärken.

Vergleichende Untersuchungen zur Wurzelbildung

Die Entwicklungsgänge der untersuchten Wurzeln unterscheiden sich beträchtlich. Eine Unterteilung in Teilprozesse hat sich bewährt. Die Entwicklung beginnt mit der Umstimmung, meist erkennbar an der Rematisierung des primordiogenen Areals. Während der anschließenden primären Morphogenese, der Substratbildung, können Teilungsmuster auftreten, die häufig als Anzeichen der beginnenden Differenzierung gewertet werden, tatsächlich aber nur die Formbildung widerspiegeln. Die Differenzierung als primäre Histogenese beginnt erst, wenn das Primordium eine bestimmte Größe erreicht hat.Die Radikula entwickelt sich ohne Remeristematisierung und ohne erkennbare primäre Morphogenese. Erstes Anzeichen ist die Ausbildung besonderer Zellmuster. Sie entsteht durch die Überprägung vorhandenen Substrats.Bei den Grenzwurzeln, die im Gegensatz zu den anderen sekundären Wurzeln einen festen Platz im Bauplan einnehmen, kann die Rematisierung fehlen.Die Größe des remeristematisierten Areals richtet sich meist nach dem zur Verfügung stehenden Substrat. Mitunter kann ein so großes Gewebeareal remeristematisiert werden, daß die Histogenese ohne dazwischengeschaltetes Volumenwachstum erfolgt. Die Zellteilungen haben dann einzig die Funktion, ein kleinzelliges Meristem zu schaffen. Die Entwicklung der Radikula zeigt viele Gemeinsamkeiten mit der sekundärer Wurzeln: Die Radikula ist also keine Sonderbildung, aber eine Wurzel mit Sonderstatus: Sie hebt sich durch ihre extrem frühe Anlegung, ihre axiale Orientierung und die starke Förderung ganz deutlich von den sekundären Wurzeln ab.

Domänen des Kapsidproteins L2 humanpathogener Papillomviren für die Interaktion mit viralen und zellulären Bindungspartnern

Die Kapsidproteine L1 und L2 von humanen Papillomviren (HPV) werden im Cytoplasma infizierter Keratinocyten synthetisiert und gelangen unabhängig voneinander in den Kern (Florin et al. 2002b). L2 lokalisiert in speziellen Kerndomänen, sog. ND10, und induziert die Reorganisation dieser Kernstrukturen: L2-abhängig akkumuliert der transkriptionelle Modulator Daxx verstärkt in ND10 und außerdem kommt es zum Ausschluss des transkriptionellen Aktivators Sp100 aus diesen Domänen (Florin et al. 2002a). Im Anschluss an diese Umorganisation im Kern induziert L2 die Lokalisation des Kapsidproteins L1 in ND10 (Florin et al. 2002b). Da auch die Replikation und Transkription von Papillomviren in oder in unmittelbarer Nähe von ND10 stattfinden, werden ND10 als Orte der Papillomvirus-Morphogenese diskutiert (Swindle et al. 1999). Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass L1 und L2 im Cytoplasma der Zellen mit Chaperonen interagieren, und dass der Kerntransport von L2 von der L2/Hsc70-Assoziation abhängig ist. Hsc70, das mit dem C-Terminus von L2 assoziiert ist, wird in virusähnliche Partikel (VLPs) eingebaut. Erst durch die Verpackung von DNA in die Kapside kommt es zum Ausschluss von Hsc70 aus dem Papillomvirus-Kapsid. Ergebnisse dieser Arbeit lassen zudem vermuten, dass L2 über seinen C-Terminus mit Mikrotubuli interagieren kann, falls diese Aminosäure-Region in L2 nicht durch das Chaperon maskiert wird. Mit Hilfe dieser Erkenntnisse wurde eine Modellvorstellung für die Rolle von L2 während der Infektion und der Morphogenese von HPV entwickelt. Die ND10-Lokalisationsdomäne (NDLD) in L2 konnte wie bei keinem Protein zuvor auf eine sehr kurze Sequenz von 22 Aminosäuren eingeengt werden. Welcher Mechanismus für die ND10-Lokalisation verantwortlich ist, muss dagegen noch geklärt werden. Alle L2-Mutanten, die ND10-Lokalisation zeigen, induzieren auch die Reorganisation dieser Domänen. Dies spricht dafür, dass L2 direkt in ND10 die Veränderungen hervorruft und wahrscheinlich keine zusätzlichen Domänen in L2 daran beteiligt sind. Es konnten zwei L1-Interaktionsdomänen in L2 kartiert werden. Diese beiden Regionen in L2 konnten nicht genauer lokalisiert werden und umfassen möglicherweise mehrere L1-Interaktionsdomänen. Der Einbau von L2 in die Kapside kann nur im Kern infizierter Zellen stattfinden. Hierfür ist die Lokalisation der Kapsidproteine in ND10 nicht notwendig. Weiterführende Versuche müssen jedoch noch klären, inwieweit ND10 trotzdem unerlässlich für eine produktive Morphogenese sind. Zudem wurde klar, dass die ersten 150 Aminosäuren im L2-Protein für das L1/L2-Verhältnis in Kapsiden verantwortlich sind. In Virionen beträgt dieses Verhältnis 30:1, d. h. zwölf L2-Moleküle werden in die Partikel aus 360 L1-Molekülen eingebaut. Bei der Verwendung der Deletionsmutante L2-150/467 beträgt dieses Verhältnis 5:1. Weitere Analysen, welche Regionen von L1 und L2 miteinander interagieren und wodurch die Beschränkung des L1/L2-Verhältnisses in Papillomviren zustande kommt, können genauere Einblicke in den Aufbau der Kapside und speziell die Lage von L2 im Kapsid liefern.

Analyse der konditionell-induzierten Überexpression von Smad7 in epithelialen Geweben der adulten Maus

Smad7 ist eine inhibitorische Komponente der TGF-β- bzw. Activin-Signalweiterleitung und erfüllt eine wichtige Aufgabe bei deren Regulation. So führt eine konstitutive Überexpression von Smad7 in epithelialen Geweben zum Auftreten verschiedener Phänotypen, wie embryonaler bzw. perinataler Letalität, Hyperproliferation der Epidermis und Thymusatrophie. Auch die Entwicklung der T-Zellen im Thymus und epithelialer Anhangsgebilde wie z.B. von Haaren und Zähnen wird dadurch beeinträchtigt. In dieser Arbeit sollte nun in der adulten Maus der Effekt einer Überexpression von Smad7 in epithelialen Geweben untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde ein, auf dem Cre/loxP-Prinzip beruhendes Transgensystem verwendet (K5-Smad7-tg und K14-creERT2), welches eine konditionell-induzierte Überexpression von Smad7 in epithelialen Zellen der adulten Maus erlaubte. Die so gezüchteten doppeltransgenen Tiere wiesen keine signifikanten Veränderungen gegenüber ihren wildtyp bzw. einfachtransgenen Geschwistertieren auf. Die Überexpression von Smad7 in epithelialen Geweben der adulten Maus zu einem Auftreten verschiedenster veränderter Phänotypen der Haut und deren Anhänge, sowie der Schneidezähne. Bei diesen Tieren konnte auch ein signifikanter Körpergewichtsverlust und eine Erhöhung der Mortalitätsrate beobachtet werden, welche sich im Verlauf nach erfolgter Rekombination einstellte. Weitere Analysen zeigten signifikante Veränderungen in der Haut und im Thymus. So konnte in der Haut eine Erhöhung der Proliferationsrate epidermaler Zellen, eine reduzierte Expression von Smad3 und im Thymus Veränderungen in der Gesamtzahl der lebenden T-Zellen und deren Differenzierung beobachtete werden. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die Hemmung der Signalweiterleitung der TGF-β-Superfamilie, speziell von TGF-β und Activin, zu verschiedenen morphogenetischen Defekten der Haut und deren Anhänge, der Zähne und der T-Zellentwicklung im Thymus führt.

Expressions- und Funktionsanalysen von "Tetraspan Vesicle Membrane Proteins" in Caenorhabditis elegans

Tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs) sind ubiquitäre Komponenten von Transportvesikeln. Bei den Säugetieren unterscheidet man drei Familien, die Physine, Gyrine und SCAMPs (secretory carrier-associated membrane proteins). Ihre Funktion ist weitgehend unbekannt, es wird jedoch vermutet, dass sie eine Rolle bei der Vesikelbildung und der Vesikelrezirkulierung spielen. In Caenorhabditis elegans existiert von jeder Familie jeweils nur ein einziges Polypeptid: für die Physine Synaptophysin (SPH-1), für die Gyrine Synaptogyrin (SNG-1) und für die SCAMPs SCAMP (SCM-1). Ziel der Arbeit war es die Verteilung der C. elegans TVPs zu untersuchen und ihre Funktion unter besonderer Berücksichtigung der vesikelvermittelten synaptischen Kopplung zu bestimmen. Wenn die C. elegans TVPs in humanen Epithelzellen synthetisiert werden, lokalisieren sie in zytoplasmatischen Vesikeln. In Kotransfektionsexperimenten wurde gezeigt, dass sie größtenteils in den gleichen Strukturen enthalten sind. In C. elegans synthetisierte TVP-Reporterkonstrukte können in unterschiedlichen Geweben nachgewiesen werden. Dabei ist SNG-1 fast ausschließlich in Neuronen zu finden. SPH-1 und SCM-1 hingegen weisen komplexe und teilweise überlappende Verteilungsmuster auf. Während für SPH-1 eine starke Fluoreszenz im Pharynx, auf der apikalen Seite der Darmzellen oberhalb des sog. terminal webs und in adluminalen Regionen von exkretorischen Geweben gefunden wurde, war SCM-1 stark in der Muskulatur und den Coelomozyten vertreten. Die Expression von SCM-1 in Pharynx und Darm war deutlich schwächer. Die C. elegans TVPs werden früh in der Entwicklung ab der Gastrulation (SPH-1 und SCM-1) bzw. ab der Neurulation im sog. Komma-Stadium (SNG-1) produziert. Um die Funktion der TVPs in C. elegans zu untersuchen, wurden TVP-Mutanten analysiert. Durch Kombination aller drei TVP-Gen-Mutanten wurden TVP-Dreifachmutanten generiert. Diese wiesen keinen offensichtlichen Defekt im Bewegungsmuster auf, entwickelten sich normal und bildeten ein normales Nervensystem aus. Auch auf unterschiedliche chemische und physikalische Reize in sensorischen Tests reagierten die TVP-Dreifachmutanten in gleicher Weise wie Wildtyptiere. Ebenso zeigen die TVP-Dreifachmutanten elektrophysiologisch unter normalen Bedingungen keine anormalen Reaktionsmuster. In ultrastrukturellen Untersuchungen wurde lediglich eine signifikant erhöhte Anzahl Clathrin-ummantelter Vesikel in cholinergen Synapsen gefunden. Erst unter Stressbedingungen, hervorgerufen durch den GABA-Antagonisten Pentylentetrazol (PTZ), wiesen sowohl die TVP-Dreifach- als auch die TVP-Einzelmutanten eine deutlich erhöhte Krampfbereitschaft auf. Zusammengenommen zeigen die Analysen, dass TVPs zwar für grundlegende neuronale Prozesse nicht notwendig sind, dass sie aber auf der anderen Seite vermutlich an alternativen redundanten Wegen der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt sind.

Zellulärer Transport von Myelinproteinen

Während der Myelinbildung im zentralen Nervensystem (ZNS) umwinden Oligodendrozyten mit Ausläufern ihrer Plasmamembran mehrfach das Axon. Myelin ermöglicht die saltatorische Erregungsweiterleitung entlang der Axone und ist zudem für die Aufrechterhaltung der axonalen Integrität erforderlich (Edgar and Garbern, 2004). Ein Oligodendrozyt myelinisiert bis zu 40 Axonsegmente gleichzeitig, wodurch er in seiner aktivsten Myelinisierungsphase 5 bis 50 x 103 µm2 Membranfläche pro Tag produziert (Pfeiffer et al., 1993). Die vollständig ausgebildete Myelinscheide besteht aus Subdomänen mit charakteristischen Protein- und Lipidzusammensetzungen. Die Entwicklung und der Erhalt der komplexen Myelinmembran erfordert die kontinuierliche Kommunikation zwischen Neuronen und Glia-Zellen, die Koordination der Protein- und Lipidsynthese sowie angepasste intrazelluläre Sortier- und Transportwege der Myelinkomponenten. Über die molekularen Mechanismen, die zur Ausbildung des Myelins und seiner Domänen führen, ist bisher nicht sehr viel bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Endo- und Exozytosemechanismen von Myelinproteinen analysiert. Dabei wurden drei Proteine untersucht, die in unterschiedlichen Subdomänen der Myelinmembran des ZNS lokalisiert sind. Das Hauptmyelinprotein Proteolipid Protein (PLP), das Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG) und das Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG). Die Exozytose des Hauptmyelinproteins PLP erfolgt möglicherweise durch sekretorische Lysosomen (Trajkovic et al., 2006) und ist Ca2+-abhängig. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass PLP, MAG und MOG unterschiedlichen endosomalen Transportwegen und Sortierprozessen unterliegen. PLP wird über einen Clathrin-unabhängigen, MAG und MOG hingegen über einen Clathrin-abhängigen Mechanismus endozytiert. Zudem gelangen die Proteine zu unterschiedlichen endosomalen Zielkompartimenten und recyceln zu verschiedenen oligodendroglialen Membrandomänen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die endosomale Sortierung und das Recycling der Myelinproteine, die für die Bildung der Subdomänen erforderliche Umgestaltung der oligodendroglialen Plasmamembran unterstützen.

Entschlüsselung des Carotinoid-Metabolismus im marinen Schwamm Suberites domuncula

Die Enzyme des Carotinoidstoffwechsels spalten Provitamin A-Carotinoide in wichtige Retinoide (z.B. Vitamin A, Retinsäure), die Organismen während der Entwicklung und in visuellen Systemen benötigen. Die vorliegende Arbeit präsentiert erstmalig eine Carotinoxygenase (BCO) aus Schwämmen (S. domuncula), die einzigartig im Tierreich ist und nur einen orthologen Vertreter in Pflanzen (Crocus sativus) wieder findet. Das Enzym ist eine 7,8(7’,8’)-Carotinoxygenase, die C40-Carotinoide zu einem C10-Apocarotinoid und 8’-Apocarotinal spaltet. Mittels HPLC wurden sowohl die Primärspaltprodukte von β-Carotin, Lykopin und Zeaxanthin als auch das für alle identische innere Kettenstück (Crocetin) bei Doppelspaltung nachgewiesen. Der Nachweis der BCO-Transkripte (unter anderem in-situ) belegt eine Beteiligung des Enzyms während Entwicklungsprozessen und offenbart sowohl eine streng räumlich-zeitliche als auch eine über Rückkopplungsprozesse gesteuerte Regulierung des Enzyms. Ein weiteres hier identifiziertes Gen ähnelt einer bakteriellen Apocarotinoidoxygenase (ACO), welche das 8’-Apocarotinal der BCO erneut spaltet und so Retinal generiert. Letzteres dient als Chromophor zahlreicher visueller Systeme und kann über Enzyme des Retinoidstoffwechsels entweder gespeichert, oder in das wichtige Morphogen Retinsäure umgesetzt werden. Hier werden zwei potentielle Enzyme vorgestellt, die an dieser Interkonversion Retinal/Retinol (Speicher) beteiligt sein könnten als auch eines, das evtl. Retinal zu Retinsäure umsetzt. Die hier vorgestellten Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass Retinsäure kein autapomorphes Morphogen der Chordaten darstellt.

Funktionsanalyse von Gamma2-Adaptin: ein zellulärer Adaptor der Hepatitis-B-Virus-Morphogenese

Im Replikationszyklus umhüllter Viren entstehen neue Viruspartikel durch die Knospung an Membranen der Wirtszelle. An diesem Prozess sind verschiedene zelluläre Faktoren und Mechanismen beteiligt, speziell die ESCRT-Proteinkomplexe, welche die Vesikelbildung an den MVBs steuern. Auch bei HBV ist davon auszugehen, dass Komponenten der Wirtszelle an der Umhüllung und Freisetzung der Virionen beteiligt sind, allerdings sind diese noch weitgehend unbekannt. Ziel dieser Arbeit war es daher, die zellulären Faktoren genauer zu charakterisieren und ihre Funktion bei der Virusumhüllung aufzuklären. Den Ausgangspunkt für die hier durchgeführten Untersuchungen bildeten vorangegangene Arbeiten, in denen die spezifische Interaktion des L-Hüllproteins von HBV mit g2-Adaptin nachgewiesen werden konnte. Diese ist für die Morphogenese von HBV essentiell, allerdings ist die zelluläre ebenso wie die virusspezifische Funktion von g2-Adaptin bislang unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher untersucht werden, wo und wie g2-Adaptin in der Zelle funktionell ist, um daraus Rückschlüsse auf die Vorgänge bei der Morphogenese von HBV ziehen zu können. Die Grundlage für die Charakterisierung von g2-Adaptin bildete seine Ähnlichkeit zu zellulären Clathrin-Adaptorproteinen. So konnte hier gezeigt werden, dass auch g2-Adaptin ein Clathrin-Bindungsmotiv besitzt, welches eine Interaktion mit Clathrin ermöglicht. Außerdem konnte ein Ubiquitin-Interaktions-Motiv (UIM) identifiziert werden, das die Bindung an ubiquitinierte Proteine vermittelt. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass g2-Adaptin zu einer Gruppe monomerer Adaptorproteine zählen könnte, welche als Ubiquitin-Rezeptoren in der Zelle funktionell sind. Die folgenden Analysen zeigten eine weitere Gemeinsamkeit, da auch g2-Adaptin selbst durch Ubiquitin modifiziert wird, wobei die Ubiquitinierung von einem intakten UIM abhängt. Dieser als Coupled Monoubiquitination bezeichnete Prozess wird hierbei durch die Ubiquitin-Ligase Nedd4 vermittelt, die direkt mit g2-Adaptin interagiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die C2-Domäne von Nedd4 ebenfalls mit Ubiquitin modifiziert ist, wodurch der Kontakt zum UIM von g2-Adaptin erfolgt. Die meisten der bislang bekannten Ubiquitin-bindenden Adaptorproteine, spielen bei der Vesikelentstehung an verschiedenen zellulären Membranen eine Rolle, wo sie an der Sortierung der vorwiegend ubiquitinierten Membranproteine beteiligt sind und zelluläre Komponenten rekrutieren, welche die Vesikelabschnürung vermitteln. Die Adaptorproteine sind dabei meist mit der jeweiligen Membran assoziiert, was auch für g2-Adaptin nachgewiesen werden konnte. Diese Membranbindung wird durch den N-terminalen Proteinbereich von g2-Adaptin vermittelt und erfolgt unabhängig von den Ubiquitin-bindenden Eigenschaften und von Nedd4. Allerdings scheint die Ubiquitin-Modifikation von g2-Adaptin ausschließlich in membrangebundener Form zu erfolgen. An welchen Membranen g2-Adaptin lokalisiert ist, wurde in Immunfluoreszenzstudien untersucht, wobei eine enge Assoziation von g2-Adaptin mit späten Endosomen bzw. MVBs zu beobachten war. Bei weiteren Analysen konnte auch ein funktioneller Einfluss auf die Vesikelentstehung an den MVBs nachgewiesen werden, da durch die Depletion von g2-Adaptin stark vergrößerte, defekte MVBs induziert wurden. Dies deutet darauf hin, dass g2-Adaptin als Ubiquitin-Rezeptor an diesen Prozessen beteiligt sein könnte. Ebenso wie andere Adaptorproteine könnte es hier an die Cargo-Proteine binden, diese durch den Kontakt zu Clathrin lokal konzentrieren und die Vesikelabschnürung durch die Rekrutierung der MVB-Maschinerie vermitteln. Möglicherweise stellt g2-Adaptin hierbei den bislang nicht identifizierten Adaptor dar, der die Verbindung zwischen Nedd4 und der MVB-Kaskade herstellt. Eine ähnliche Funktion für g2-Adaptin ist auch bei der Morphogenese von HBV denkbar. Aufgrund der durchgeführten Lokalisationsstudien ist anzunehmen, dass die Umhüllung der HBV-Partikel direkt an den MVBs erfolgt. Vermutlich bindet g2-Adaptin hier an das L-Hüllprotein, wobei es durch die Rekrutierung von Clathrin zu einer lokalen Anreicherung der Hüllproteine kommt. g2-Adaptin interagiert zudem in UIM-abhängiger Weise mit dem Nukleokapsid, wobei der Kontakt direkt erfolgen könnte oder durch die Ubiquitin-Ligase Nedd4 vermittelt wird, welche über eine Late-Domäne ebenfalls mit dem Nukleokapsid verbunden ist. Anscheinend gelangt das Nukleokapsid durch den Einfluss von g2-Adaptin und Nedd4 zum Ort der Virusmorphogenese, wo die eigentliche Umhüllung und die Abschnürung der Viruspartikel erfolgen. Vermutlich sind auch hier Komponenten der MVB-Maschinerie beteiligt, die womöglich durch g2-Adaptin rekrutiert werden.

Charakterisierung redundanter Kerntransportsignale des minoren Kapsidproteins L2 humaner Papillomviren

Das minore Kapsidprotein L2 humaner Papillomviren wird im Laufe des HPV-Lebenszyklus zweimal in den Zellkern importiert und akkumuliert dort an den Nukleären Domänen 10 (ND10). Der erste Kernimport erfolgt in der frühen Phase der Infektion zusammen mit der Virus-DNA. Für den Zusammenbau von Virionen wird neu synthetisiertes L2-Protein ein weiteres Mal in den Kern transportiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Domäne von L2 identifiziert werden, die für den Kernimport von HPV16 L2 absolut notwendig ist. Dabei gelang es diesen Bereich auf 25 Aminosäuren einzuengen. Sowohl während der frühen Phase der Infektion als auch während der Morphogenese scheint die zentrale, basische Aminosäureregion 291-315 (mNLS) hauptverantwortlich für die Interaktion mit Kernimportrezeptoren zu sein. Möglicherweise leisten dabei flankierende Sequenzen einen Beitrag zur Stabilisierung der notwendigen Konformation. Des Weiteren gelang die Identifizierung der Aminosäuren, die für die Funktionalität des mNLS essentiell sind. Hierbei handelt es sich um ein zentrales Arginin-Motiv, bestehend aus vier dicht beieinander liegenden Argininen, dessen Mutation den Kernimport von L2 während Infektion und Morphogenese verhindert. Untersuchungen mit HPV16 und HPV18 L2-Proteinen verdeutlichten, dass es möglicherweise ein universelles Motiv zu sein scheint und in verschiedenen HPV-Typen konserviert ist. Flankiert wird dieses Arginin-Motiv von konservierten Serinen und Threoninen. Wie die Analyse von Punktmutationen zeigte, sind diese Aminosäuren für den Kernimport von L2 ohne Bedeutung. Interessanterweise verhinderte aber die Mutation TS295/6A die Kolokalisation von L2 mit ND10 im Zellkern. L2wt rekrutiert den transkriptionellen Regulator Daxx. Auch diese Funktion ging bei der Mutante TS295/6A verloren. Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht nur die ND10-Lokalisationsdomäne (AS 390-420) in L2 sondern auch weitere Aminosäuren oder Domänen für die Assoziation mit ND10 und die Rekrutierung von Daxx verantwortlich sein könnten. Auf der Suche nach zellulären Faktoren, die eine Rolle im mNLS-vermittelten Kernimport spielen, wurde zunächst die Bedeutung von Hsc70 untersucht. Während der Morphogenese maskiert Hsc70 den C-Terminus von L2 und verhindert damit unerwünschte Interaktionen mit Mikrotubuli im Zytoplasma. Es existieren aber weitere noch unbekannte Hsc70-Bindedomänen in L2, die möglicherweise den Kernimport ebenfalls beeinflussen können. Wie die Untersuchungen deutlich machten, ist der zentrale, basische Bereich von L2 aber nicht mit Hsc70 assoziiert und der mNLS-vermittelte Kernimport findet unabhängig von Hsc70 statt. In einem siRNA-Screen wurde anschließend die Rolle von Karyopherinen während der Infektion untersucht. Sowohl Kapß2-siRNA als auch Kapß3-siRNA waren in der Lage unabhängig voneinander die Infektion von HPV16-Pseudovirionen zu reduzieren. Für beide Karyopherine konnte in der Vergangenheit in vitro die Interaktion mit HPV16 L2 nachgewiesen werden. Das L2-Protein ist das einzige virale Protein, das während der Infektion die Virus-DNA in den Kern begleitet (Day et al., 2004). Demzufolge ist es auch das einzige virale Protein, das mit Importinen während der Infektion interagiert. Möglicherweise sind also beide Karyopherine in der Lage sein L2 während der Infektion in den Kern zu importieren. Abschließend wurden Präzipitationsversuche durchgeführt, die zur Identifizierung möglicher Bindungspartner des mNLS führen sollten. In diesen Versuchen konnte eine erhöhte Bindungsaffiniät zu den beiden Importinen Kapß1 und Kapß2 festgestellt werden. Möglicherweise ist das L2-Protein mit seiner mNLS in der Lage mehrere Importrezeptoren zu binden und für den Kernimport zu nutzen. Eines dieser Importine ist Kapß2. Dieser Importrezeptor scheint sowohl bei der Infektion als auch während der Morphogenese den Kernimport von L2 durch die Bindung an das mNLS zu vermitteln.

Nukleation pflanzlicher Mikrotubuli: Expression relevanter Gene

Die wichtigsten Bestandteile des Cytoskeletts in pflanzlichen Zellen sind die Actinfilamente und die Mikrotubuli. Die Mikrotubuli spielen in der Organisation und der Morphogenese von pflanzlichen Zellen eine wichtige Rolle. Sie sind zusammen mit den Cellulosefibrillen an der Formgebung der Pflanzenzelle beteiligt. Sie bilden das Präprophaseband, das die Zellteilungsebene bestimmt und die Mitosespindel, die für die Trennung der Chromosomen sorgt, sowie den Phragmoplasten, der die Zellwand zwischen den Tochterzellen bildet. Weiterhin geben die Mikrotubuli durch Interaktion mit den Cellulose-Synthase-Komplexen die Richtung der Zellexpansion vor (GRANGER und CYR, 2001; LLOYD und CHAN, 2002; BASKIN, 2002). Die Mikrotubuli sind auch an der Stabilisierung der Zellform und an Transportprozessen beteiligt. Als Bestandteil der Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOCs) wurde das γ-Tubulin identifiziert, das sehr wahrscheinlich an der Nukleation der Mikrotubuli beteiligt ist, indem es die Assemblierung der αβ-Tubulindimere zu Mikrotubuli einleitet. In tierischen Zellen ist durch intensive Forschung inzwischen relativ viel über die Funktion von γ-Tubulin, vor allem im Verlauf der Zellteilung bekannt, wie z. B. die Lokalisation in Centrosomen mit ihren paarweise angeordneten Centriolen, die die MTOCs darstellen. In pflanzlichen Zellen sind bisher nur wenige Funktionen des Proteins hinreichend geklärt. Die höheren Pflanzen besitzen keine Centriolen und keine Centrosomen. Über die Zellteilung hinaus gibt es kaum Anhaltspunkte über das Vorhandensein oder eventuelle Aufgaben von γ-Tubulin in expandierenden und voll expandierten Zellkulturen und Pflanzengeweben. In dieser Arbeit wurde die Expression über PCR und die Messung des Proteingehalts von cytoskelett-relevanten Proteinen in den Entwicklungsstadien der Zellsuspensionskultur (BY-2) und von Blattstadien der Tabakpflanze (SR1) von Nicotiana tabacum gemessen. Primäres Ziel war es eine Aussage zu erhalten, in welchem Ausmaß γ-Tubulin in expandierenden und voll expandierten Zellen noch exprimiert wird und ob bzw. wie eine Regulation (transkriptionell oder posttranskriptionell) des γ-Tubulins in der Pflanze stattfindet. Für den Nachweis des γ-Tubulins auf der Proteinebene wurde ein pflanzenspezifischer γ-Tubulin Antikörper zu entwickelt. Bei diesem Antikörper handelte es sich um einen polyklonalen Antikörper, der spezifisch gegen eine Sequenz in pflanzlichem γ-Tubulin gerichtet ist. Dabei zeigte der in der Arbeit entwickelte Antikörper gegen die pflanzliche JOSHI-Domäne spezifische Signale. Der erfolgte Nachweis von γ-Tubulin auf der Proteinebene und der Transkripte zeigte bis in die ältesten untersuchten Stadien der Zellsuspensionskultur (BY-2) und in Geweben der Blattstadien der Tabakpflanze (SR1) deutliche Signale für γ-Tubulin. Es war somit nicht nur in meristematisch aktiven Zellen und Geweben von Nicotiana tabacum, sondern auch in nichtmitotischen Zellen und Geweben vorhanden. Hierbei war über die Phasen der Zellteilung und der Zellformgebung hinweg auf beiden Ebenen eine parallele Entwicklung mit relativ konstanten starken Signalen zu beobachten. Nach dem Einstellen der Teilungsaktivität fiel der Gehalt an mRNA deutlich ab. Dabei nahm die Konzentration des Proteins im Vergleich zur mRNA zeitlich verzögert ab. Diese Ergebnisse bei der Zellsuspensionskultur (BY-2) und Tabakpflanze (SR1) gehen mit der möglichen Nukleationstätigkeit des Proteins konform. Es waren geringere aber doch deutlichen Signale bei Absterbenden Zellen der Zellkultur, bzw. bei expandierenden und voll expandierten und seneszenten Blättern der Tabakpflanze (SR1) nachzuweisen. Dies lässt die Folgerung zu, dass die nachgewiesene mRNA von γ-Tubulin nicht posttranskriptionell reguliert wird, sondern dass das γ-Tubulin auch eine wichtige Rolle außerhalb der Zellteilung in den postmitotischen Stadien, z. B. als organisierender Faktor bei der Umgestaltung oder Stabilisierung des Mikrotubuli-Cytoskeletts, spielt. Der γ-Tubulin-Gehalt in den Geweben der SR1-Pflanze zeigte über die Zellkultur hinaus, dass die Expression von α-Tubulin nach Einstellen der Teilungsaktivität kontinuierlich abnimmt. Dieses Ergebnis legt die Vermutung nahe, dass γ-Tubulin in älteren Blattgeweben zusätzliche Aufgaben übernehmen könnte, die nicht auf eine gleichzeitige Expression von α-Tubulin angewiesen sind. So kann beispielsweise eine Beteiligung von γ-Tubulin an der Stabilisierung der Mikrotubuli, und damit einhergehend eine Abnahme der dynamischen Instabilität dieser Filamente, eine denkbare Funktion des Proteins in expandierendem und voll expandiertem Gewebe sein. Die Aufgaben von γ-Tubulin in sehr altem Gewebe mit deutlichen Anzeichen der Seneszenz können allerdings nach dem derzeitigen Stand der Forschung nicht eindeutig beantwortet werden und bedürfen weitergehenden Untersuchungen, da dadurch ein die Komplexität und die Dynamik des pflanzlichen Cytoskeletts geklärt werden kann.

Charakterisierung zellulärer Interaktionspartner des großen Hüllproteins des Hepatitis-B-Virus

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand das große L-Hüllprotein (L) des Hepatitis B - Virus. L bildet eine ungewöhnliche duale Topologie in der ER-Membran aus, welche auch im reifen Viruspartikel erhalten bleibt. In einem partiellen, posttranslationalen Reifungsprozess wird die sogenannte PräS-Region von der zytosolischen Seite der Membran aus in das ER-Lumen transloziert. Aufgrund seiner dualen Topologie und der damit verbundenen Multifunktionalität übernimmt L eine Schlüsselfunktion im viralen Lebenszyklus. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag deshalb darin, neue zelluläre Interaktionspartner des L-Hüllproteins zu identifizieren. Ihre Analyse sollte helfen, das Zusammenspiel des Virus mit der Wirtszelle besser zu verstehen. Hierfür wurde das Split - Ubiquitin Hefe - Zwei - Hybrid System eingesetzt, das die Interaktionsanalyse von Membranproteinen und Membran-assoziierten Proteinen ermöglicht. Zwei der neu identifizierten Interaktionspartner, der v-SNARE Bet1 und Sec24A, die Cargo-bindende Untereinheit des CoPII-vermittelten vesikulären Transports, wurden weitergehend im humanen Zellkultursystem untersucht. Sowohl für Bet1 als auch für Sec24A konnte die Interaktion mit dem L-Hüllprotein bestätigt und der Bindungsbereich eingegrenzt werden. Die Depletion des endogenen Bet1 reduzierte die Freisetzung L-haltiger, nicht aber S-haltiger subviraler Partikel (SVP) deutlich. Im Gegensatz zu Bet1 interagierte Sec24A auch mit dem mittleren M- und kleinen S-Hüllprotein von HBV. Die Inhibition des CoPII-vermittelten vesikulären Transportweges durch kombinierte Depletion der vier Sec24 Isoformen blockierte die Freisetzung sowohl L- als auch S-haltiger SVP. Dies bedeutet, dass die HBV - Hüllproteine das ER CoPII-vermittelt verlassen, wobei sie aktiv Kontakt zur Cargo-bindenden Untereinheit Sec24A aufnehmen. Der effiziente Export der Hüllproteine aus dem ER ist für die Virusmorphogenese und somit für den HBV - Lebenszyklus essentiell. rnEin weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit basierte auf der Interaktion des L-Hüllproteins mit dem ER-luminalen Chaperon BiP. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob BiP, ähnlich wie das zytosolische Chaperon Hsc70, an der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins beteiligt ist. Hierfür wurde BiP durch die ektopische Expression seiner Ko-Chaperone BAP und ERdj4 in seiner Substrat-bindenen Kapazität manipuliert. ERdj4, ein Mitglied der Hsp40 - Proteinfamilie, stimuliert die ATPase-Aktivität von BiP, was die Substratbindung stabilisiert. Der Nukleotid - Austauschfaktor BAP hingegen vermittelt die Auflösung des BiP - Substrat - Komplexes. Die Auswirkung der veränderten in vivo-Aktivität von BiP auf die posttranslationale PräS-Translokation wurde mit Proteaseschutz - Versuchen untersucht. Die ektopische Expression des positiven als auch des negativen Regulators von BiP resultierte in einer drastischen Reduktion der posttranslationalen PräS-Translokation. Ein vergleichbarer Effekt wurde nach Manipulation des BiP ATPase - Zyklus durch Depletion der zellulären ATP - Konzentration beobachtet. Dies spricht dafür, dass das ER-luminale Chaperon BiP, zusammen mit Hsc70, eine zentrale Rolle in der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins spielt. rnZwei weitere Proteine, Sec62 und Sec63, die sich für die posttranslationale Translokation in der Hefe als essentiell erwiesen haben, wurden in die Analyse der dualen Topologie des L-Hüllproteins einbezogen. Interessanterweise konnte eine rein luminale Ausrichtung der PräS-Region nach kombinierter Depletion des endogenen Sec62 und Sec63 beobachtet werden. Dies deutet an, dass sowohl Sec62 als auch Sec63 an der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins beteiligt sind. In Analogie zur Posttranslokation der Hefe könnte Sec62 als Translokon-assoziierter Rezeptor für Substrate der Posttranslokation, und damit der PräS-Region, dienen. Sec63 könnte mit seiner J-Domäne BiP zum Translokon rekrutieren und daraufhin dessen Substrat-bindende Aktivität stimulieren. BiP würde dann, einer molekularen Ratsche gleich, die PräS-Region durch wiederholtes Binden und Freisetzen aktiv in das ER-Lumen hereinziehen, bis eine stabile duale Topologie des L-Hüllproteins ausgebildet ist. Die Bedeutung von Sec62 und Sec63 für den HBV - Lebenszyklus wird dadurch untermauert, dass sowohl die ektopische Expression als auch die Depletion des endogenen Sec63 die Freisetzung L-haltiger SVP deutlich reduziert. rn

Hox genes and the regulation of programmed cell death in the embryonic central nervous system of Drosophila melanogaster

This study deals with the function and regulation of programmed cell death, or apoptosis, in the development of the embryonic central nervous system of Drosophila melanogaster. The first part provides a description of apoptosis-deficient embryos, which showed that preventing apoptosis does not cause gross morphological defects in the CNS, as it appears well organized despite the presence of too many cells. An analysis of the incidence and pattern of apoptosis over the course of development discloses a partly very orderly pattern suggesting tight spatio-temporal control, but also reveals random apoptotic cells, which suggests a certain amount of plasticity in the embryo. This analysis also allowed precise identification of some of the dying neural cells in the embryo, and establishment of single cell models for studying regulation of segment-specific apoptosis in the embryonic CNS. In the second part of the work, further investigations into mechanisms controlling segment-specific apoptosis revealed the involvement of two Hox genes, Antennapedia (Antp) and Ultrabithorax (Ubx), in this process. Hox genes control the formation of segment-specific structures in their domains of expression, but also regulate organ and tissue morphogenesis. The study presented here shows that Antp and Ubx play antagonistic roles in motoneuron survival in the embryo. Ubx expression in the CNS is strongly upregulated at a late point in development, when most cells have begun to differentiate. This upregulation shortly precedes Ubx-dependent, segment-specific apoptosis of two differentiated motoneurons. It could further be demonstrated that Antp is required for proper development of the NB7-3 lineage and for survival of the NB7-3 motoneuron in the anterior thoracic segments. In segments where Antp and Ubx expression overlaps, Ubx counteracts the anti-apoptotic function of Antp, resulting in cell death. Thus, these two Hox genes play opposing roles in the survival of differentiated neurons in the late developing nervous system. They thereby contribute to establishment of correct connections between outward-projecting neurons and their targets, which is crucial for the assembly of functional neural circuits, as these have to fulfill region-specific locomotion and sensory requirements along the antero-posterior body axis.

Optimierung einer partikulären Cytomegalovirus-Vakzine

Pränatale Infektionen mit dem humanen Cytomegalovirus (HCMV) sind die häufigste Ursache frühkindlicher Schädigung, noch vor dem Down-Syndrom oder dem fetalen Alkoholsyndrom. Reaktivierung dieses Herpesvirus ist darüber hinaus als lebensbedrohliche Komplikation in der Transplantationsmedizin gefürchtet. Von Experten wurde daher die Entwicklung einer Vakzine vielfach angemahnt. Trotz unterschiedlicher Ansätze zu ihrer Entwicklung ist bisher jedoch kein Impfstoff verfügbar. Die Verwendung von subviralen Dense Bodies (DB) des Virus als Vakzinegrundlage stellt eine vielversprechende Strategie zur HCMV-Impfstoffentwicklung dar. DB enthalten bereits in ihrer natürlichen Form wichtige Zielantigene der humoralen und zellulären Immunantwort gegen HCMV. Durch gezielte Mutation des 230.000 Basenpaare umfassenden Genoms des HCMV konnte in Vorarbeiten der Beweis erbracht werden, dass DB hinsichtlich ihres antigenen Repertoires optimierbar sind. Allerdings waren Immunogenität und erzielte Ausbeuten noch unbefriedigend. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Ansatz der Verwendung modifizierter DB als Impfstoff-Grundlage weiter zu entwickeln und Erkenntnisse über die für die Partikelbildung entscheidenden molekularen Mechanismen zu erarbeiten. In einem ersten Abschnitt wurde der Ansatz der Modifikation von DB durch Insertion heterologer Peptidantigene in das virale Tegumentprotein pp65 verfeinert. Das pp65 ist die mengenmäßig dominante Komponente von DB. Durch Herstellung und Austestung definierter HCMV Mutanten konnte die Position 175 des pp65 als geeignete Insertionsstelle für virale wie für nicht-virale Antigene identifiziert werden. In einem zweiten Schritt der Arbeit wurde die Rolle des pp65 im Verlauf der viralen Vermehrung und Morphogenese näher untersucht. Grundlage für diese Analysen war eine Virusmutante, die eine dominant-negative Variante des pp65 exprimierte. Vergleichende massenspektrometrische Untersuchungen unter Einbeziehung von pp65-kompetenten und pp65-negativen Virusmutanten zeigten, dass pp65 in der spät-infizierten Zelle mit dem viralen RNA-Exportfaktor pUL69 und der virale Kinase pUL97 komplexiert vorkommt. Das pp65 wurde als Substrat von pUL97 identifiziert. Daneben wurden essentielle Proteine des viralen Replikationsapparates, sowie zelluläre Proteine des RNA-Metabolismus und Transports und virale DNA in diesen Komplexen gefunden. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass pp65 zu späten Zeitpunkten der viralen Infektion zu Stellen viraler DNA rekrutiert wird und dort regulatorisch in posttranskriptionelle Vorgänge von RNA Prozessierung oder RNA Transport eingreift. Die Hypothese, dass pp65 einen regulatorischen Einfluss auf die RNA-Exportfunktion von pUL69 nimmt, liegt nahe und ist nun in weiteren Analysen prüfbar.