Rôle de la ghréline dans la régulation du coactivateur transcriptionnel PGC-1alpha

L’adaptation de l’organisme à son environnement est essentielle à sa survie. L’homéostasie énergétique permet l’équilibre entre les apports, les dépenses et le stockage d’énergie. Un surplus calorique important dérègle ce processus et mène au développement du syndrome métabolique caractérisé, entre autres, par une obésité, un diabète de type II, des maladies cardiovasculaires et des dyslipidémies. La ghréline participe au maintien de l’équilibre énergétique durant le jeûne en stimulant la production de glucose par le foie et le stockage lipidique dans le tissu adipeux. Le coactivateur transcriptionnel PGC-1alpha, surexprimé en situation de jeûne, est impliqué dans l’induction de la production de glucose par le foie et l’oxydation des acides gras. Notre hypothèse est que ces deux acteurs clés du métabolisme énergétique constituent un axe de régulation commun. Dans cette étude, nous montrons que la ghréline participe à la régulation de PGC-1alpha. Son récepteur GHS-R1a, possédant une forte activité constitutive, est également impliqué de façon indépendante au ligand. GHS-R1a réduit l’activité transcriptionnelle de PGC-1alpha tandis que l’ajout du ligand inverse modérément cette action. L’effet de GHS-R1a corrèle avec l’acétylation de PGC-1alpha qui est fortement augmentée de façon dose-dépendante. La stabilité de PGC-1alpha est également augmentée par le GHS-R1a indépendamment de l’ubiquitine. La ghréline diminue la capacité de PGC-1alpha à lier PPARbeta, un récepteur nucléaire partenaire de PGC-1alpha. De plus, la ghréline réduit, de façon ligand-dépendante, la capacité de coactivation de PGC-1alpha sur PPARbeta dans les hépatocytes. L’ensemble de ces résultats identifie PGC-1alpha comme cible du signal de la ghréline et suggère un axe de régulation ghréline/PGC-1alpha/PPARbeta.Une meilleure compréhension de cet axe de régulation va permettre la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques pour faire face aux pathologies associées au syndrome métabolique.

Differential regulation of early response genes by fibroblast growth factor (FGF) 8 and FGF18 in bovine granulosa cells in vitro

Les « Facteurs de croissance des fibroblastes» (FGF) agissent comme des régulateurs locaux sur la qualité des follicules et sont connus pour promouvoir la prolifération des cellules de granulosa, réduire l’apoptose et la stéroïdogenèse. Parmi la sous-famille FGF8, FGF18 est une exception puisqu’il semblerait avoir une fonction pro-apoptotique alors que FGF8 n’a pas été jusqu’à présent rapporté comme altérant la viabilité des cellules de la granulosa. Ces deux ligands ont un mode d’activation similaire et il pourrait être proposé que toute la sous-famille FGF8 ait la même réponse. L’objectif de cette étude était de déterminer si FGF8 et FGF18 activaient la même réponse précoce de gènes dans des cultures de granulosa bovine. Pour répondre à cette question, nous avons cultivé des cellules de la granulosa dans du milieu de culture sans sérum pendant 5 jours. Le jour 5, les cellules ont été traitées avec FGF8 ou FGF18. Nous avons eu recours à une approche de « puce à ADN » afin d’identifier la réponse précoce de gènes induite par FGF8 et FGF18, et les données ont été confirmées par des PCRs en temps réel lors d’une expérience in vitro où les cellules de granulosa ont été traitées avec FGF8 et FGF18 pendant différents temps. L’analyse du puce à ADN a identifié 12 gènes surexprimés par FGF8, incluant SPRY2, NR4A1, XIRP1, BAMBI, EGR1, FOS et FOSL1. A l’inverse, FGF18 n’a régulé aucun gène de manière significative. Les analyses de PCR ont confirmé l’augmentation d’ARNm codant pour EGR1, EGR3, FOS, XIRP1, FOSL1, SPRY2, NR4A1 et BAMBI après 2 h de traitement. FGF18 a entrainé seulement une augmentation de l’expression de EGR1 après 2 h de traitement parmi tous les gènes testés. Ces résultats démontrent donc que FGF8 et FGF18, malgré leur similarité dans le mode d’activation de leurs récepteurs, agissent sur les cellules de la granulosa via différentes voies de signalisation. FGF8 et FGF18, sont donc tous les deux capables de stimuler l’expression de EGR1, mais les voies de signalisation induites par la suite divergent.

Expression du facteur de transcription SRF chez les chevaux atteints de souffle

Il a été démontré que les chevaux atteints du souffle présentent une augmentation de la masse de muscle lisse entourant les voies respiratoires comparativement à des chevaux sains (Herszberg, Ramos-Barbon et al. 2006, Leclere, Lavoie-Lamoureux et al. 2011). L’augmentation de la masse de muscle lisse ainsi observée résulte d’une hyperplasie, et possiblement, d’une hypertrophie des myocytes. Les traitements usuels du souffle ne sont que partiellement efficaces à diminuer cette augmentation. L’objectif de cette étude était d’explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans ces changements affectant la cellule musculaire lisse dans la pathologie du souffle chez le cheval. Pour ce faire, nous avons examiné les effets d’une exposition antigénique sur l’expression du «Serum Response Factor» (SRF) dans le muscle lisse bronchique. Le SRF est un facteur de transcription localisé dans le noyau de la cellule musculaire lisse et régulant l’expression génique de celle-ci en favorisant un phénotype prolifératif ou contractile. Les résultats démontrent qu’avant exposition antigénique, les pourcentages de cellules exprimant le SRF sont faibles. Une augmentation significative du pourcentage de myocytes exprimant le SRF survient suite à une stimulation antigénique chez les chevaux atteints de souffle alors qu’aucune augmentation n’est observée chez les chevaux contrôles. Ces résultats suggèrent que le SRF pourrait contribuer au remodelage du muscle lisse péribronchique dans la pathologie du souffle.

Isolation and identification of native microalgae for biodiesel production

La demande croissante en carburants, ainsi que les changements climatiques dus au réchauffement planétaire poussent le monde entier à chercher des sources d’énergie capables de produire des combustibles alternatifs aux combustibles fossiles. Durant les dernières années, plusieurs sources potentielles ont été identifiées, les premières à être considérées sont les plantes oléagineuses comme source de biocarburant, cependant l’utilisation de végétaux ou d’huiles végétales ayant un lien avec l’alimentation humaine peut engendrer une hausse des prix des denrées alimentaires, sans oublier les questions éthiques qui s’imposent. De plus, l'usage des huiles non comestibles comme sources de biocarburants, comme l’huile de jatropha, de graines de tabac ou de jojoba, révèle un problème de manque de terre arable ce qui oblige à réduire les terres cultivables de l'industrie agricole et alimentaire au profit des cultures non comestibles. Dans ce contexte, l'utilisation de microorganismes aquatiques, tels que les microalgues comme substrats pour la production de biocarburant semble être une meilleure solution. Les microalgues sont faciles à cultiver et peuvent croitre avec peu ou pas d'entretien. Elles peuvent ainsi se développer dans des eaux douces, saumâtres ou salées de même que dans les terres non cultivables. Le rendement en lipide peut être largement supérieur aux autres sources de biocarburant potentiel, sans oublier qu’elles ne sont pas comestibles et sans aucun impact sur l'industrie alimentaire. De plus, la culture intensive de microalgues pour la production de biodiesel pourrait également jouer un rôle important dans l'atténuation des émissions de CO2. Dans le cache de ce travail, nous avons isolé et identifié morphologiquement des espèces de microalgues natives du Québec, pour ensuite examiner et mesurer leur potentiel de production de lipides (biodiesel). L’échantillonnage fut réalisé dans trois régions différentes du Québec: la région de Montréal, la gaspésie et le nord du Québec, et dans des eaux douces, saumâtres ou salées. Cent souches ont été isolées à partir de la région de Montréal, caractérisées et sélectionnées selon la teneur en lipides et leur élimination des nutriments dans les eaux usées à des températures différentes (10 ± 2°C et 22 ± 2°C). Les espèces ayant une production potentiellement élevée en lipides ont été sélectionnées. L’utilisation des eaux usées, comme milieu de culture, diminue le coût de production du biocarburant et sert en même temps d'outil pour le traitement des eaux usées. Nous avons comparé la biomasse et le rendement en lipides des souches cultivées dans une eau usée par apport à ceux dans un milieu synthétique, pour finalement identifié un certain nombre d'isolats ayant montré une bonne croissance à 10°C, voir une teneur élevée en lipides (allant de 20% à 45% du poids sec) ou une grande capacité d'élimination de nutriment (>97% d'élimination). De plus, nous avons caractérisé l'une des souches intéressantes ayant montré une production en lipides et une biomasse élevée, soit la microalgue Chlorella sp. PCH90. Isolée au Québec, sa phylogénie moléculaire a été établie et les études sur la production de lipides en fonction de la concentration initiale de nitrate, phosphate et chlorure de sodium ont été réalisées en utilisant de la méthodologie des surfaces de réponse. Dans les conditions appropriées, cette microalgue pourrait produire jusqu'à 36% de lipides et croitre à la fois dans un milieu synthétique et un milieu issu d'un flux secondaire de traitement des eaux usées, et cela à 22°C ou 10°C. Ainsi, on peut conclure que cette souche est prometteuse pour poursuivre le développement en tant que productrice potentielle de biocarburants dans des conditions climatiques locales.

Mammite bovine à Escherichia coli : identification et caractérisation de la persistance

Escherichia coli est un agent de mammites environnementales. Par contre, E. coli peut persister dans la glande mammaire. Les objectifs de cette étude étaient de confirmer la présence d’infection persistante chez des vaches laitières canadiennes et d’identifier la possibilité de contagion entre les quartiers d’une vache dans une cohorte de 91 fermes suivies durant deux ans. De plus, les souches persistantes ont été comparées à des souches transitoires. Les profils génétiques ont été obtenus à l’aide de l’électrophorèse sur gel en champs pulsés. La détection de la résistance pour sept antibiotiques s’est faite par microdilution. Vingt-sept gènes de virulence ont été déterminés par hybridation sur colonies. De la persistance a été détectée chez 18 vaches et de la contagion entre quartiers, chez deux vaches. La proportion de résistance chez les E. coli persistants était de 0,0 % (enrofloxacin) à 27,8 % (ampicilline et tétracycline) et de 0,0 % (enrofloxacin) à 16,8 % (tétracycline) pour les E. coli transitoires. Pour chacune des résistances additionnelles, les probabilités d’être une souche persistante augmentaient par un facteur 1,6 (95% IC : 1.1, 2.4). Une souche résistante à l’ampicilline et à la céphalothine avait une plus forte probabilité d’être persistante. Une souche possédant le gène iroN avait 5.4 fois plus de probabilité (95% IC: 1.2, 24.0) d’être persistante. Aussi, une souche positive pour le gène sitA avait 8.6 fois plus de probabilité (95% IC: 2.8, 27.1) d’être persistante. En conclusion, cette étude confirme qu’E. coli peut persister dans la glande mammaire des vaches laitières canadiennes et que ces E. coli sont différents de ceux impliqués lors d’infection transitoire.

Characterizing cortical myosin mini-filament regulation, length and its macroscopic implications in cytokinetic dynamics.

Au cours de la cytokinèse, le génome dédoublé est compartimentalisé en deux cellules filles. L’anneau contractile, une structure dynamique, est constitué d’actine, myosine (NMY-II) et d’autres protéines accessoires. NMY-2 est le seul moteur protéique impliqué dans la contraction de l’anneau durant la cytokinèse. Depuis longtemps, il a été considéré que celle-ci glissait le long des filaments d’actine grâce à sa capacité de traction. Récemment, plusieurs études ont découvert que son activité réticulante joue un rôle en cytokinèse et il est connu que la NMY-2 peut s’assembler en filaments bipolaires à partir de dimères. Ainsi, nous postulons que leur dimension (nombre de moteurs ATPasiques) pourrait dicter leur contribution en activité motrice et réticulante. Afin de déterminer la composition des filaments corticaux de NMY-2, nous avons utilisé une technique d'imagerie de molécules individuelles à l’aide de la microscopie TIRF. J’ai trouvé à travers l’analyse statistique de la distribution des NMY-2 mesurés que les filaments sont assemblés à deux dimensions constantes: Des filaments composés de 20 dimères et 30 dimères. La kinase Rho est une activatrice de NMY-2 nécessaire pour les niveaux physiologiques de NMY-2 sur l’anneau contractile, pour des cinétiques et fermeture concentrique de l’anneau. La déplétion de RhoK augmente l’abondance relative des filaments de 20 dimères. Ainsi, RhoK pourrait réguler le recrutement de la NMY et aussi l’assemblage des filaments corticaux de NMY-2. De plus, à l’aide de la microscopie confocale à temps réel, j’ai trouvé que lors de la déplétion de RhoK, il se produit une réduction du recrutement et du délai d’initiation du sillon, une fermeture lente et une augmentation significative de la concentricité de l’anneau. De plus, j’ai mesuré des défauts dans l’organisation corticale de l’anneau contractile en patch. La déplétion de MRCK-1 n’affecte pas l’initiation du sillon, les cinétiques de fermeture, ou la fermeture concentrique de l’anneau. Paradoxalement, la déplétion de MRCK-1 augmente le recrutement cortical de NMY-2, mais quand depleté simultanément avec Rho-K il diminue NMY-2 à l’équateur comparé à la déplétion seule de Rho-K. De plus, la double déplétion, conduit à un phénotype de concentricité de l’anneau, suivie d’un recentrage.

La formine Diaphanous est essentielle pour l’organisation et la maturation de l’anneau contractile pendant la cytokinèse

Une cellule se divise en deux par le processus de cytokinèse. Elle requiert la coordination de plusieurs composants pour éviter la formation des cellules potentiellement cancéreuses. Premièrement, un anneau contractile (AC) dépendant de l’actine et de Rho-GTP diminue le diamètre de la cellule jusqu’à la formation d’une structure plus stable indépendante de l’actine, l’anneau du midbody (AM) qui guide l’éventuelle séparation des cellules sœurs. Diaphanous (Dia) est une formine dépendante de Rho responsable de l’agencement des filaments d’actine non ramifiés qui se localise à l’AC et est essentielle à la cytokinèse. Nous avons étudié le rôle de Dia pendant la cytokinèse par microscopie de haute résolution en temps réel pour suivre le comportement dynamique des protéines fluorescentes (PF) dans des cellules de Drosophile S2. Une construction fonctionnelle de Dia-PF est recrutée à l’AC et l’AM indépendamment de l’actine mais est absente dans l’AM mature. Dia quitte l’AM au même temps où l’AM dévient indépendant d’actine. La déplétion de Dia par ARN interférant ralentit la constriction de l’AC, augmente les oscillations et, dans 70% des cas, les cellules échouent la cytokinèse pendant la constriction, suggérant que Dia a un rôle dans l’organisation de l’AC. LifeAct-PF, une sonde pour F-actine, dévoile une diminution des filaments d’actine spécifique à l’AC des cellules dépourvues de Dia pendant que Anilline-PF et Myosine-PF sont recrutées en puncta. Ces résultats soutiennent un modèle où Dia nuclée des filaments d’actine qui permettent l’organisation dynamique de l’AC et la perte de Dia régule la transition à l’AM stable indépendant d’actine.

The involvement of nitric oxide in bovine follicular development and ovulation

Comprendre les événements paracriniens qui régulent la fertilité chez la vache est nécessaire non seulement en raison de l'importance agricole de cette espèce, mais aussi pour son utilisation potentielle comme modèle chez l’humain. L'oxyde nitrique (NO), un gaz de radicaux libres, a été impliqué dans la croissance folliculaire et l'ovulation chez les rongeurs et d'autres espèces, mais chez la vache c’est une énigme fascinante : le NO est produit par les cellules de la granulosa bovine et est régulé par la FSH, mais la présence et le profil d'expression des enzymes responsables de la synthèse de NO (NOS) dans les cellules de la granulosa tout au long de la croissance folliculaire ne sont pas claires. Les objectifs de cette thèse sont: (1) élucider le mécanisme de contrôle des NOS et les conséquences de la production d'oxyde nitrique pour le fonctionnement des cellules de la granulosa au cours du développement folliculaire chez la vache et (2) déterminer la régulation des NOS pendant la cascade ovulatoire induite par LH chez les cellules de la granulosa bovine et si l'activité des NOS pour l’expression des gènes critiques dans la cascade ovulatoire chez cette espèce. Les résultats sont séparés en 2 articles. Dans le premier article, la régulation de NOS2 dans les cellules de la granulosa bovine a été explorée. L'abondance des ARNm codant pour NOS2 a été stimulée par la FSH et l’IGF1 en augmentant l’estradiol, et un blocage de l'action de l’estradiol a conséquemment réduit les niveaux d'ARNm codant pour NOS2. De plus, l'inhibition de l'activité des NOS a augmenté l'apoptose dans les cellules de la granulosa in vitro. Dans le second article, il a été démontré que le pic de LH induit une activation des NOS dans les cellules de la granulosa, et que l'activité de NOS induit la production de NO, ce qui est essentiel pour l’expression des gènes critiques dans la cascade ovulatoire induite par LH comme EREG/AREG/PTGS2. Ensemble, les résultats présentés dans ces 2 articles suggèrent que les niveaux physiologiques d'activité des NOS peuvent contribuer à la croissance et la survie des cellules de la granulosa et indiquent également que NO peut être essentiel pour l'ovulation chez les bovins.

Carboxydothermus hydrogenoformans comme catalyseur biologique pour la conversion du monoxyde de carbone en hydrogène simultanément a la minéralisation de calcium et phosphate

La gazéification est aujourd'hui l'une des stratégies les plus prometteuses pour valoriser les déchets en énergie. Cette technologie thermo-chimique permet une réduction de 95 % de la masse des intrants et génère des cendres inertes ainsi que du gaz de synthèse (syngaz). Le syngaz est un combustible gazeux composé principalement de monoxyde de carbone (CO), d'hydrogène (H2) et de dioxyde de carbone (CO2). Le syngaz peut être utilisé pour produire de la chaleur et de l'électricité. Il est également la pierre angulaire d'un grand nombre de produits à haute valeur ajoutée, allant de l'éthanol à l'ammoniac et l'hydrogène pur. Les applications en aval de la production de syngaz sont dictées par son pouvoir calorifique, lui-même dépendant de la teneur du gaz en H2. L’augmentation du contenu du syngaz en H2 est rendu possible par la conversion catalytique à la vapeur d’eau, largement répandu dans le cadre du reformage du méthane pour la production d'hydrogène. Au cours de cette réaction, le CO est converti en H2 et CO2 selon : CO + H2O → CO2 + H2. Ce processus est possible grâce à des catalyseurs métalliques mis en contact avec le CO et de la vapeur. La conversion catalytique à la vapeur d’eau a jusqu'ici été réservé pour de grandes installations industrielles car elle nécessite un capital et des charges d’exploitations très importantes. Par conséquent, les installations de plus petite échelle et traitant des intrants de faible qualité (biomasse, déchets, boues ...), n'ont pas accès à cette technologie. Ainsi, la seule utilisation de leur syngaz à faible pouvoir calorifique, est limitée à la génération de chaleur ou, tout au plus, d'électricité. Afin de permettre à ces installations une gamme d’application plus vaste de leurs syngaz, une alternative économique à base de catalyseur biologique est proposée par l’utilisation de bactéries hyperthermophiles hydrogénogènes. L'objectif de cette thèse est d'utiliser Carboxydothermus hydrogenoformans, une bactérie thermophile carboxydotrophe hydrogénogène comme catalyseur biologique pour la conversion du monoxyde de carbone en hydrogène. Pour cela, l’impact d'un phénomène de biominéralisation sur la production d’H2 a été étudié. Ensuite, la faisabilité et les limites de l’utilisation de la souche dans un bioréacteur ont été évaluées. Tout d'abord, la caractérisation de la phase inorganique prédominante lorsque C. hydrogenoformans est inoculé dans le milieu DSMZ, a révélé une biominéralisation de phosphate de calcium (CaP) cristallin en deux phases. L’analyse par diffraction des rayons X et spectrométrie infrarouge à transformée de Fourier de ce matériau biphasique indique une signature caractéristique de la Mg-whitlockite, alors que les images obtenues par microscopie électronique à transmission ont montré l'existence de nanotiges cristallines s’apparentant à de l’hydroxyapatite. Dans les deux cas, le mode de biominéralisation semble être biologiquement induit plutôt que contrôlé. L'impact du précipité de CaP endogène sur le transfert de masse du CO et la production d’H2 a ensuite été étudié. Les résultats ont été comparés aux valeurs obtenues dans un milieu où aucune précipitation n'est observée. Dans le milieu DSMZ, le KLa apparent (0.22 ± 0.005 min-1) et le rendement de production d’H2 (89.11 ± 6.69 %) étaient plus élevés que ceux obtenus avec le milieu modifié (0.19 ± 0.015 min-1 et 82.60 ± 3.62% respectivement). La présence du précipité n'a eu aucune incidence sur l'activité microbienne. En somme, le précipité de CaP offre une nouvelle stratégie pour améliorer les performances de transfert de masse du CO en utilisant les propriétés hydrophobes de gaz. En second lieu, la conversion du CO en H2 par la souche Carboxydothermus hydrogenoformans fut étudiée et optimisée dans un réacteur gazosiphon de 35 L. Parmi toutes les conditions opérationnelles, le paramètre majeur fut le ratio du débit de recirculation du gaz sur le débit d'alimentation en CO (QR:Qin). Ce ratio impacte à la fois l'activité biologique et le taux de transfert de masse gaz-liquide. En effet, au dessus d’un ratio de 40, les performances de conversion du CO en H2 sont limitées par l’activité biologique alors qu’en dessous, elles sont limitées par le transfert de masse. Cela se concrétise par une efficacité de conversion maximale de 90.4 ± 0.3 % et une activité spécifique de 2.7 ± 0.4 molCO·g–1VSS·d–1. Malgré des résultats prometteurs, les performances du bioréacteur ont été limitées par une faible densité cellulaire, typique de la croissance planctonique de C. hydrogenoformans. Cette limite est le facteur le plus contraignant pour des taux de charge de CO plus élevés. Ces performances ont été comparées à celles obtenues dans un réacteur à fibres creuses (BRFC) inoculé par la souche. En dépit d’une densité cellulaire et d’une activité volumétrique plus élevées, les performances du BRFC à tout le moins cinétiquement limitées quand elles n’étaient pas impactées par le transfert de masse, l'encrassement et le vieillissement de la membrane. Afin de parer à la dégénérescence de C. hydrogenoformans en cas de pénurie de CO, la croissance de la bactérie sur pyruvate en tant que seule source de carbone a été également caractérisée. Fait intéressant, en présence simultanée de pyruvate et de CO, C. hydrogenoformans n’a amorcé la consommation de pyruvate qu’une fois le CO épuisé. Cela a été attribué à un mécanisme d'inhibition du métabolisme du pyruvate par le CO, faisant ainsi du pyruvate le candidat idéal pour un système in situ de secours.

Rôle de l'AmtB dans la régulation de la nitrogénase et la production d'hydrogène chez la bactérie Rhodobacter capsulatus

L’azote est l’élément le plus abondant dans l’atmosphère terrestre avec un pourcentage atteignant 78 %. Composant essentiel pour la biosynthèse des matériels organiques cellulaires, il est inutilisable sous sa forme diatomique (N2) très stable par la plupart des organismes. Seules les bactéries dites diazotrophiques comme Rhodobacter capsulatus sont capables de fixer l’azote moléculaire N2 par le biais de la synthèse d’une enzyme, la nitrogénase. Cette dernière catalyse la réduction du N2 en ammonium (NH4) qui peut alors être assimilé par d’autres organismes. La synthèse et l’activité de la nitrogénase consomment beaucoup d’énergie ce qui implique une régulation rigoureuse et son inhibition tant qu’une quantité suffisante d’ammonium est disponible. Parmi les protéines impliquées dans cette régulation, la protéine d’intérêt AmtB est un transporteur membranaire responsable de la perception et le transport de l’ammonium. Chez R. capsulatus, il a été démontré que suite à l’addition de l’ammonium, l’AmtB inhibe de façon réversible (switch off/switch on) l’activité de la nitrogénase en séquestrant la protéine PII GlnK accompagnée de l’ajout d’un groupement ADP ribose sur la sous unités Fe de l’enzyme par DraT. De plus, la formation de ce complexe à lui seul ne serait pas suffisant pour cette inactivation, ce qui suggère la séquestration d’une troisième protéine, DraG, afin d’inhiber son action qui consiste à enlever l’ADP ribose de la nitrogénase et donc sa réactivation. Afin de mieux comprendre le fonctionnement de l’AmtB dans la régulation et le transport de l’ammonium à un niveau moléculaire et par la même occasion la fixation de l’azote, le premier volet de ce mémoire a été d’introduire une mutation ponctuelle par mutagénèse dirigée au niveau du résidu conservé W237 de l’AmtB. La production d’hydrogène est un autre aspect longtemps étudié chez R. capsulatus. Cette bactérie est capable de produire de l’hydrogène à partir de composés organiques par photofermentation suite à l’intervention exclusive de la nitrogénase. Plusieurs études ont été entreprises afin d’améliorer la production d’hydrogène. Certaines d’entre elles se sont intéressées à déterminer les conditions optimales qui confèrent une production maximale de gaz tandis que d’autres s’intéressent au fonctionnement de la bactérie elle même. Ainsi, le fait que la bioproduction de H2 par fermentation soit catalysée par la nitrogénase cela implique la régulation de l’activité de cette dernière par différents mécanismes dont le switch off par ADP ribosylation de l’enzyme. De ce fait, un mutant de R. capsulatus dépourvu d’AmtB (DG9) a été étudié dans la deuxième partie de cette thèse en termes d’activité de la nitrogénase, de sa modification par ADP ribosylation avec la détection des deux protéines GlnK et DraG qui interviennent dans cette régulation pour connaitre l’influence de différents acides aminés sur la régulation de la nitrogénase et pour l‘utilisation future de cette souche dans la production d’H2 car R. capsulatus produit de l’hydrogène par photofermentation grâce à cette enzyme. Les résultats obtenus ont révélé une activité de la nitrogénase continue et ininterrompue lorsque l’AmtB est absent avec une activité maximale quand la proline est utilisée comme source d’azote durant la culture bactérienne ce qui implique donc que l’abolition de l’activité de cette protéine entraine une production continue d’H2 chez R. capsulatus lorsque la proline est utilisée comme source d’azote lors de la culture bactérienne. Par ailleurs, avec des Western blots on a pu déterminer l’absence de régulation par ADP ribosylation ainsi que les expressions respectives de GlnK et DraG inchangées entre R. capsulatus sauvage et muté. En conclusion, la nitrogénase n’est pas modifiée et inhibée lorsque l’amtB est muté ce qui fait de la souche R. capsulatus DG9 un candidat idéal pour la production de biohydrogène en particulier lorsque du glucose et de la proline sont respectivement utilisés comme source de carbone et d'azote pour la croissance.

Concepts «fondamentaux» en administration de l’éducation

Glossaire élaboré par des membres de la cellule "administration scolaire" au Département d'administration et fondements de l'éducation. Définitions retenues qui s’appliquent toutes au domaine de l’éducation. Document complémentaire aux notions véhiculées dans le cours ETA6900 : Introduction à l’administration de l’éducation.

Rôle du TGF-β dans la modulation du microenvironnement tumoral leucémique

Le microenvironnement tumoral et les cellules et molécules signal (cytokines et chimiokines) qu’ils contiennent sont reconnus comme jouant un rôle prépondérant dans la progression des tumeurs. Il devient donc nécessaire d’étudier la relation entre les molécules signal, les cellules infiltrantes et les cellules tumorales. Le TGF-β est une puissante cytokine immunosuppressive et suppressive de la croissance cellulaire, dont le rôle dans la formation du microenvironnement tumoral leucémique est mal connu. Dans cette étude, nous avons étudié le modèle injectable de leucémie lymphoïde T EL4 (cellules tumorales produisant du TGF-β) de souche C57BL/6. Nous avons caractérisé l’infiltration de cellules myéloïdes et lymphoïdes au niveau des tumeurs par cytométrie en flux et par microscopie à fluorescence. L’analyse des cellules infiltrant les tumeurs EL4 nous a permis de montrer la forte présence de lymphocytes T et de cellules myéloïdes CD11b+. Nous avons donc poursuivi l’étude afin de mieux caractériser ces cellules. Nous avons montré que ces cellules se retrouvent en périphérie de la tumeur et en périphérie des vaisseaux sanguins de la tumeur. Ces cellules ont des phénotypes nous laissant croire qu’elles appartiennent à la famille des cellules dite myéloïdes suppressives. Ces cellules ont de forts niveaux de transcrits de VEGF et de MMP9 au niveau de la tumeur ainsi qu’au niveau systémique, mais ne semblent pas avoir une forte capacité inhibitrice in vitro. Afin de déterminer si la production tumorale de TGF-β influe le recrutement de ces cellules, nous avons transformé des cellules EL4 à l’aide d’un shRNA afin de diminuer la production de TGF-β (shRNA-TGF-β) et, comparé l’infiltration myéloïde et lymphoïde de tumeurs formées avec des cellules EL4 contrôles (shRNA-Luc). Une diminution de 50% dans les niveaux de transcrits de TGF-β n’affecte pas la croissance tumorale mais semble diminuer l’infiltration par des cellules myéloïdes. La présente étude nous a permis de mieux comprendre le modèle de leucémie EL4 et le rôle des populations cellulaires myéloïdes dans le microenvironnement tumoral leucémique. La diminution du TGF-β produit par les cellules tumorales réduit l’infiltration de ces populations myéloïdes dans la tumeur EL4. Le rôle précis de ces cellules est encore à déterminer. Ces résultats sont en accord avec le fait qu’une thérapie anti-TGF-β n’est pas suffisante pour contrer la progression tumorale, mais pourrait influer sur le résultat post-chimiothérapie et l’immunothérapie en altérant la composition du microenvironnement.

L’immunoprotéasome : producteur de peptides-CMH I et régulateur de l’expression génique

Le système ubiquitine-protéasome est le principal mécanisme par lequel les protéines intracellulaires sont dégradées. Le protéasome dit constitutif (PC) est donc essentiel à l’homéostasie mais aussi à la régulation de la majorité des processus cellulaires importants. La découverte d’un deuxième type de protéasome, appelé immunoprotéasome (IP), soulève toutefois de nouvelles questions. Pourquoi existe-t-il plus d’un type de protéasome ? L’IP a-t-il des rôles redondants ou complémentaires avec le PC ? L’IP étant présent principalement dans les cellules immunitaires ou stimulées par des cytokines, plusieurs groupes ont tenté de définir son rôle dans la réponse immunitaire. Or, l’implication de son homologue constitutif dans un éventail de processus non spécifiquement immunitaires nous laisse croire que l’IP pourrait lui aussi avoir un impact beaucoup plus large. L’objectif de cette thèse était donc de caractériser certains rôles cellulaires de l’IP dans les cellules dendritiques. Nous avons d’abord étudié l’impact global de l’IP sur la présentation antigénique de classe I. Ce faisant, nous avons pu déterminer ses deux contributions principales, soit l’augmentation drastique du nombre et de la diversité des peptides présentés sur les complexes majeurs d’histocompatibilité de classe I. Les différences de clivage entre le PC et l’IP pourraient expliquer en partie cette diversité du répertoire peptidique, notamment par l’affinité apparente de l’IP pour les régions protéiques non structurées. Dans un deuxième temps, nous avons dévoilé un nouveau rôle de l’IP sur un processus dépassant le cadre immunitaire : la transcription. Nous avons découvert que l’IP modifie l’abondance des ARNm en agissant principalement au niveau de leur synthèse. L’impact de l’IP sur le transcriptome est majeur et serait dû en partie à une dégradation différente de facteurs de transcription des familles IRF, STAT et NF-kB. Les cellules dendritiques IP-déficientes activent moins efficacement les lymphocytes T CD8+ et nous croyons que cette défaillance est causée (du moins en partie) par la perturbation transcriptomique provoquée par l’absence d’IP. Il importe donc de comprendre les différents rôles moléculaires de l’IP afin de mieux définir sa contribution globale au fonctionnement de la cellule et comprendre l’avantage évolutif, au niveau de l’organisme, procuré par une telle plasticité du système ubiquitine-protéasome.

Influence de TDP-43 sur la régulation de hnRNP A1 : un impact potentiel sur la sclérose latérale amyotrophique

La SLA est une maladie neurodégénérative fatale se déclenchant tardivement. Elle est caractérisée par la perte des neurones moteurs supérieurs et inférieurs. Jusqu’à présent, aucun traitement ne permet de ralentir ou de guérir la maladie de façon robuste. De récentes découvertes portant sur TDP-43 et hnRNP A1 y ont identifié des mutations reliées à des cas de SLA. Comme les deux possèdent de multiples fonctions dans le métabolisme de l’ARN, l’impact de ces mutations devient difficile à définir. Notre hypothèse est que TDP-43 régule hnRNP A1 et que les mutations causant la SLA dérégulent ce mécanisme, aboutissant ainsi à un impact majeur sur la vulnérabilité des neurones moteurs. Nos résultats démontrent que TDP-43 lie l’ARNm de hnRNP A1, mais n’affecte pas sa stabilité. En revanche, TDP-43 réprime l’expression de hnRNP A1. Ce mécanisme pourrait être appliqué in vivo où le ratio protéique hnRNP A1B/A1 augmente chez les souris âgées et davantage chez les TDP-43A315T dans la région cervicale et lombaire de la moelle épinière. Cette différence n’est pas causée par un défaut de l’épissage alternatif. Aussi, la mutation TDP-43A315T serait davantage responsable de cette différence que la surexpression de TDP-43 (résultats obtenus en culture). L’impact d’une telle augmentation sur la cellule pourrait être la formation d’agrégats puisque la forme hnRNP A1B possède quatre domaines de fibrillation de plus que hnRNP A1. Nos résultats pourraient donc fournir un mécanisme potentiel de la formation d’inclusions cytoplasmiques reconnues comme étant une des caractéristiques pathologiques principales de la SLA.

Mécanismes de régulation du trafic et de l’activité du récepteur GABAB

L’acide γ-aminobutyrique (GABA) est le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central et est impliqué dans diverses pathologies incluant l’épilepsie, l’anxiété, la dépression et la dépendance aux drogues. Le GABA agit sur l’activité neuronale par l’activation de deux types de récepteurs; le canal chlorique pentamérique GABAA et l’hétérodimère obligatoire de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) GABAB. Chacun des récepteurs est responsable de phases distinctes de la réponse cellulaire au GABA. Lors d’une stimulation par le GABA, il est essentiel pour la cellule de pouvoir contrôler le niveau d’activité des récepteurs et au besoin, de limiter leur activation par des mécanismes de désensibilisation et de régulation négative. La désensibilisation nécessite le découplage du récepteur de ses effecteurs, ainsi que sa compartimentation hors de la membrane plasmique dans le but de diminuer la réponse cellulaire à l’agoniste. Les mécanismes de contrôle de l’activité de GABAB semblent anormaux pour un RCPG et sont encore mal moléculairement caractérisés. L’objet de cette thèse est d’étudier la régulation du récepteur GABAB et de sa signalisation par la caractérisation de nouvelles protéines d’interactions étant impliquées dans la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation du récepteur. Une première étude nous a permis d’identifier la protéine NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) comme interagissant avec le récepteur hétérodimérique. Nous avons caractérisé le site d’interaction au niveau du domaine coiled-coil de chacune des deux sous-unités de GABAB et constaté la dépendance de cette interaction au statut de l’activité ATPasique de NSF. Nous avons observé que cette interaction pouvait être dissociée par l’activation de GABAB, induisant la phosphorylation du récepteur par la protéine kinase C (PKC) parallèlement à la désensibilisation du récepteur. L’activation de PKC par le récepteur est dépendante de l’interaction NSF-GABAB, ce qui suggère une boucle de rétroaction entre NSF et PKC. Nous proposons donc un modèle où, à l’état basal, le récepteur interagit avec NSF, lui permettant d’activer PKC en réponse à la stimulation par un agoniste, et où cette activation permet à PKC de phosphoryler le récepteur, induisant sa dissociation de NSF et sa désensibilisation. Nous avons par la suite étudié la dégradation et l’ubiquitination constitutive de GABAB et la régulation de celles-ci par PKC et l’enzyme de déubiquitination USP14 (ubiquitin-specific protease 14). Au niveau basal, le récepteur est ubiquitiné, et présente une internalisation et une dégradation rapide. L’activation de PKC augmente l’ubiquitination à la surface cellulaire et l’internalisation, et accélère la dégradation du récepteur. USP14 est en mesure de déubiquitiner le récepteur suite à l’internalisation, mais accélère aussi la dégradation par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique. Nos résultats suggèrent un mécanisme où l’ubiquitination promeut l’internalisation et où USP14 cible le récepteur ubiquitiné vers un processus de dégradation lysosomale. La troisième étude porte sur la régulation de la densité de récepteurs à la membrane plasmique par la protéine Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2). Nous avons déterminé que Grb2 interagit avec GABAB1 au niveau de la séquence PEST (riche en proline, glutamate, sérine et thréonine) du domaine carboxyl-terminal, et que cette interaction module l’expression à la surface du récepteur hétérodimérique en diminuant l’internalisation constitutive par un mécanisme encore inconnu. Cette inhibition de l’internalisation pourrait provenir d’une compétition pour le site de liaison de Grb2 à GABAB1, ce site étant dans une région interagissant avec plusieurs protéines impliquées dans le trafic du récepteur, tels le complexe COPI et la sous-unité γ2S du récepteur GABAA (1, 2). En proposant de nouveaux mécanismes moléculaires contrôlant l’activité et l’expression à la membrane du récepteur GABAB par les protéines NSF, PKC, USP14 et Grb2, les études présentées dans cette thèse permettent de mieux comprendre les processus d’internalisation et de dégradation, ainsi que du contrôle de l’activité de GABAB par la désensibilisation, ouvrant la porte à une meilleure compréhension de la signalisation GABAergique.