Characterizing cortical myosin mini-filament regulation, length and its macroscopic implications in cytokinetic dynamics.

Au cours de la cytokinèse, le génome dédoublé est compartimentalisé en deux cellules filles. L’anneau contractile, une structure dynamique, est constitué d’actine, myosine (NMY-II) et d’autres protéines accessoires. NMY-2 est le seul moteur protéique impliqué dans la contraction de l’anneau durant la cytokinèse. Depuis longtemps, il a été considéré que celle-ci glissait le long des filaments d’actine grâce à sa capacité de traction. Récemment, plusieurs études ont découvert que son activité réticulante joue un rôle en cytokinèse et il est connu que la NMY-2 peut s’assembler en filaments bipolaires à partir de dimères. Ainsi, nous postulons que leur dimension (nombre de moteurs ATPasiques) pourrait dicter leur contribution en activité motrice et réticulante. Afin de déterminer la composition des filaments corticaux de NMY-2, nous avons utilisé une technique d'imagerie de molécules individuelles à l’aide de la microscopie TIRF. J’ai trouvé à travers l’analyse statistique de la distribution des NMY-2 mesurés que les filaments sont assemblés à deux dimensions constantes: Des filaments composés de 20 dimères et 30 dimères. La kinase Rho est une activatrice de NMY-2 nécessaire pour les niveaux physiologiques de NMY-2 sur l’anneau contractile, pour des cinétiques et fermeture concentrique de l’anneau. La déplétion de RhoK augmente l’abondance relative des filaments de 20 dimères. Ainsi, RhoK pourrait réguler le recrutement de la NMY et aussi l’assemblage des filaments corticaux de NMY-2. De plus, à l’aide de la microscopie confocale à temps réel, j’ai trouvé que lors de la déplétion de RhoK, il se produit une réduction du recrutement et du délai d’initiation du sillon, une fermeture lente et une augmentation significative de la concentricité de l’anneau. De plus, j’ai mesuré des défauts dans l’organisation corticale de l’anneau contractile en patch. La déplétion de MRCK-1 n’affecte pas l’initiation du sillon, les cinétiques de fermeture, ou la fermeture concentrique de l’anneau. Paradoxalement, la déplétion de MRCK-1 augmente le recrutement cortical de NMY-2, mais quand depleté simultanément avec Rho-K il diminue NMY-2 à l’équateur comparé à la déplétion seule de Rho-K. De plus, la double déplétion, conduit à un phénotype de concentricité de l’anneau, suivie d’un recentrage.

Non-muscle myosin II (myosin) is important for many cellular processes, including cytokinesis. Myosin is a major component of the contractile ring, which constricts to close the connection between the two daughter cells. It was long accepted that actomyosin contractile filament sliding closes the cytokinetic ring. However, several recent papers conclude that myosin’s actin crosslinking activity is more important than its motor activity. These two functions likely relate to the number of actin-binding heads per bipolar myosin mini-filament. I then measured the size of cortical bipolar myosin mini-filaments and tested how mini-filament size and abundance influences cytokinesis. To measure the composition of individual myosin-containing cortical features, I developed a TIRF microscopy-based assay to calculate the number of NMY-2 dimers per feature from a ratio of endogenous/functional NMY-2-GFP. Interestingly control cells possess 2 populations: mini-filaments with an average of 20 dimers and with 30 dimers that are built to consistent specifications. Depletion of the NMY-2 activator Rho-Kinase or Anillin, a contractile ring scaffold protein, significantly alters the relative abundance of small and larger NMY-2 filament populations. I then tested the macroscopic implications of perturbations that alter cortical NMY-2 assembly. I measured NMY-2 regulators depleted cells and measured NMY-2 cortical recruitment, organization, and the kinetics (speed and concentricity) of cytokinesis. Rho-K depletion decreases NMY-II cortical recruitment and organization, slows ring closure and makes it more concentric. Depletion of MRCK-1, a less well-understood conserved myosin kinase, increased myosin cortical recruitment but had little effect on furrowing kinetics. Following simultaneous depletion of MRCK and RhoK, cortical myosin organization and recruitment were drastically reduced and, as expected for a much weaker cortex, a unique concentric phenotype emerged. Thus, while Rho-kinase is the more important kinase for myosin activation, MRCK-1 contributes to myosin organization and contractile ring dynamics. We conclude that myosin is recruited to the cortex as multi-headed mini-filaments whose assembly is tightly regulated and which impacts several aspects of contractile ring function.