Production of Recombinant Trichoderma Reesei Endoglucanase Protein CEL7B by Using Kluyveromyces Lactis

This research is about producing recombinant Trichoderma reesei endoglucanase Cel7B by using Kluyveromyces lactis, transformed with chromosomally integrated Cel7B cDNA, as a host cell (K. lactis Cel7B). Cel7B is one of the glycoside hydrolyze family of proteins that are produced by T. reesei. Cel7B together with other endoglucanases, exoglucanases, and â-glucosidases hydrolyze cellulose to glucose, which can then be fermented to biofuels or other value-added products. The research objective of this MS project is to examine favorable fermentation conditions for recombinant Cel7B enzyme production and improved activity. Production of enzyme on different types of media was examined, and the activity of the enzyme was measured by using different tools or procedures. The first condition tested for was using different concentrations of galactose as a carbon and energy source; however galactose also acts as a potent promoter of recombinant Cel7B expression in K. lactis Cel7B. The purpose of this method is to determine the relationship between production of enzyme with increasing sugar concentration. The second culture condition test was using different types of media: a complex medium-yeast extract, peptone, galactose (YPGal); a minimal medium-yeast nitrogen base (YNB) with galactose; and a minimal medium with supplement-yeast nitrogen base with casamino acid (YBC), a nitrogen source, with galactose. The third condition was using different types of reactors or fermenters: a small reactor (shake flask) and a larger automated bioreactor (BioFlo 3000 fermenter). The purpose of this method is to determine the quantity of the protein produced by using different environments of production. Different tools to determine the presence and activity of Cel7B enzyme were used. For the presence of enzyme, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was used. Secondly, to detect enzyme activity, the carboxymethyl cellulose- 3,5-dinitrosalicylic acid (CMC- DNS) assay was employed. SDS-PAGE showed that the enzyme band was at 67 kDa, which is larger than native Cel7B (52 kDa.), likely due to over glycolylation during post-translational processing in K. lactis. For the different types of media used in our fermentation, recombinant Cel7B was produced from yeast extract peptone galactose (YPGal), and yeast nitrogen base with casamino acid (YBC), but was not produced and no activity was detected from yeast nitrogen base (YNB). This experiment concluded that the Cel7B production requires the amino acid resources as part of fermentation medium. In experiments where recombinant Cel7B net activity was measured at 1% galactose initial concentration in YPGal and YBC media, higher enzyme activity was detected for the complex medium YPGal. Higher activity of recombinant Cel7B was detected for flask culture in 2% galactose compared to 1% galactose for YBC medium. Two bioreactor experiments were conducted under these culture conditions at 30°C, pH 7.0, dissolved oxygen of 50% of saturation, and 250 rpm agitation (variable depending on DO control) K. lactis-Cel7B yeast growth curves were quite reproducible with maximum optical density (O.D) at 600 nm of between 7 and 8 (when factoring dilution of 10:1). Galactose was consumed rapidly during the first 15 hours of bioreactor culture and recombinant Cel7B started to appear in the culture at 10-15 hours and increased thereafter up to a maximum of between 0.9 and 1.6 mg/mL/hr in these experiments. These bioreactor enzyme activity results are much higher than comparable experiments conducted with flask-scale culture (0.5 mg/mL/hr). In order to achieve the highest recombinant Cel7B activity from batch culture of K. lactis-Cel7B, based on this research it is best to use a complex medium, 2% initial galactose concentration, and an automated bioreactor where good control of temperature, pH, and dissolved oxygen can be achieved.

Effects of fibrosis morphology on reentrant ventricular tachycardia inducibility and simulation fidelity in patient-derived models

Myocardial fibrosis detected via delayed-enhanced magnetic resonance imaging (MRI) has been shown to be a strong indicator for ventricular tachycardia (VT) inducibility. However, little is known regarding how inducibility is affected by the details of the fibrosis extent, morphology, and border zone configuration. The objective of this article is to systematically study the arrhythmogenic effects of fibrosis geometry and extent, specifically on VT inducibility and maintenance. We present a set of methods for constructing patient-specific computational models of human ventricles using in vivo MRI data for patients suffering from hypertension, hypercholesterolemia, and chronic myocardial infarction. Additional synthesized models with morphologically varied extents of fibrosis and gray zone (GZ) distribution were derived to study the alterations in the arrhythmia induction and reentry patterns. Detailed electrophysiological simulations demonstrated that (1) VT morphology was highly dependent on the extent of fibrosis, which acts as a structural substrate, (2) reentry tended to be anchored to the fibrosis edges and showed transmural conduction of activations through narrow channels formed within fibrosis, and (3) increasing the extent of GZ within fibrosis tended to destabilize the structural reentry sites and aggravate the VT as compared to fibrotic regions of the same size and shape but with lower or no GZ. The approach and findings represent a significant step toward patient-specific cardiac modeling as a reliable tool for VT prediction and management of the patient. Sensitivities to approximation nuances in the modeling of structural pathology by image-based reconstruction techniques are also implicated.

La cronémimca de reuniones multipartitas en videoconferencia : Observaciones en torno al silencio de la fase de preparación

En este estudio se examinan los silencios que aparecen durante la fase de preparación de dieciocho reuniones multipartitas por videoconferencia. Partiendo de la metodología del Análisis Conversacional, el análisis del material muestra que la duración de los silencios entre turnos se reduce considerablemente en dos momentos cruciales de la interacción en línea. Esto a su vez confirma la existencia de tres etapas diferenciadas en la preparación: etapa inicial, etapa de transición y etapa audiovisual, en cada una de las cuales los silencios presentan unas características concretas. Se muestra que en el chat escrito también se producen intervalos y lapsos y que el nivel de tolerancia de los participantes hacia el silencio varía en cada una de las etapas, lo cual puede relacionarse con su nivel de atención y disponibilidad. Se sugiere un estándar máximo aproximado para los intervalos que ocurren en la etapa de transición y se demuestra que, en el canal audio-oral, el límite de tolerancia se sitúa por encima de los tres segundos de duración. Por último, este estudio pone de manifiesto la aparición de diferentes ritmos cronémicos a lo largo de la preparación en videoconferencia, donde elementos como la apertura de la cámara web parecen poseer una gran relevancia interaccional.

Aplicação pré-colheita de leveduras para o controle de podridões pós-colheita de manga Kent.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência da aplicação de leveduras pulverizadas durante o desenvolvimento dos frutos no campo, seguido de reaplicações pós-colheita, em comparação com produto comercial registrado para a cultura. O experimento foi conduzido no Campo Experimental de Bebedouro, da Embrapa Semiárido (Petrolina, PE) com quatro tratamentos: com fungicida pré e pós-colheita; Sacharomyces sp. LF; Pichia kudriavzevii L9; controle sem aplicação de fungicida pré ou pós-colheita, apenas com imersão em solução de CMC. Houve efeito significativo dos agentes de controle biológico sobre a incidência e a severidade das podridões com aplicação de tratamentos pré e pós-colheita, resultado este estatisticamente similar ao tratamento com fungicida. Os tratamentos com Sacharomyces sp. LF e P. kudriavzevii L9 apresentaram risco de desenvolvimento de podridão 3,2 e 3,5 vezes menor que o controle, respectivamente. Esses valores são similares a 3,7, alcançado com a aplicação de fungicida.

Shoulder kinematic evaluation in patients with rotator cuff tears using inertial and magnetic sensors.

Questo progetto di tesi fa parte di un più ampio studio clinico condotto all’interno dell’azienda NCS Lab (Carpi,(MO)), in collaborazione con il Dr. Claudio Chillemi (ICOT, Latina (RM)) che mira ad eseguire un confronto tra diverse tecniche chirurgiche per la riparazione della cuffia dei rotatori. Lo studio clinico in questione durerà circa due anni: per questo motivo i dati analizzati in questo progetto di tesi provengono solo dal gruppo di pazienti acquisiti nella fase preoperatoria. Tutti i dati sono stati acquisiti utilizzando i sensori magneto-inerziali WISE (tecnologia proprietaria dell’azienda NCS Lab). Questo lavoro di tesi si propone, quindi, di valutare la ripetibilità del movimento in termini di coefficiente di correlazione multipla e di estrapolare alcuni parametri di interesse clinico come, ad esempio, i range di movimento (ROM) della scapola e dell’omero e il ritmo scapolo-omerale (SHR). Questi parametri sono stati poi caratterizzati da un punto di vista statistico al fine di valutare le differenze tra arto patologico e controlaterale. Sono state calcolate, inoltre, le prediction bands con lo scopo di descrivere le differenze tra arto patologico e controlaterale nella coordinazione scapolo-omerale dei pazienti. Per quanto riguarda la ripetibilità del movimento, i risultati ottenuti in questo lavoro di tesi mostrano che la rotazione medio-laterale è caratterizzata da un eccellente CMC sia per l'arto patologico che per il controlaterale. Inoltre, sono state riscontrate differenze significative dal punto di vista statistico tra le distribuzioni dei range di movimento dell'arto patologico e controlaterale. Tali differenze sono state trovate anche per quanto riguarda il ritmo scapolo-omerale.

Caratterizzazione fluidodinamica di reattori agitati meccanicamente tramite tecniche di diagnostica ottica: effetto del comportamento reologico delle fasi.

Il lavoro di tesi si è posto l'obiettivo di studiare il comportamento fluidodinamico di un reattore agitato meccanicamente, scale-down di un digestore anaerobico per la produzione di biogas, attraverso tecniche di diagnostica ottica. Le tecniche utilizzate sono state la Particle Image Velocimetry, PIV, e la Planar Laser Induced Fluorescence, PLIF. Le prove sono iniziate utilizzando acqua all’interno del reattore e sono proseguite utilizzando una soluzione di acqua e Carbometilcellulosa (CMC) a concentrazione di CMC progressivamente crescente per aumentare la viscosità apparente della soluzione non newtoniana con lo scopo di simulare il più realisticamente possibile la viscosità del contenuto reale del digestore. Tutte le diverse soluzioni sono state indagate per diverse velocità e diversi sensi di rotazione. Le prove di diagnostica ottica sono state progressivamente affiancate da prove al reometro di campioni di soluzione per il calcolo della viscosità apparente. La PIV ha fornito la misura del campo di moto di un piano, è stato scelto di analizzare un piano verticale. Il metodo di diagnostica ottica ho previsto l’utilizzo di quattro componenti: una sezione per il test otticamente trasparente contenente la soluzione inseminata con piccole particelle di tracciante (particelle di argento e vetro cavo) che seguono il flusso, una sorgente di illuminazione pulsata (laser), un dispositivo di registrazione (una telecamera digitale ad alta definizione) ed un software per la cross-correlazione delle immagini acquisite (DynamicStudio). La PLIF è stata implementata per lo studio del tempo caratteristico di miscelazione nel reattore. La strumentazione utilizzata è stata la stessa della PIV con un tracciante diverso a base di Rodhamina-6G. Lo studio ha riguardato il tempo necessario all’omogeneizzazione del tracciante mediante un’analisi del coefficiente di variazione, CoV, delle immagini acquisite.