Incerteza associada à falha de registos udométricos/udográficos e respetiva estimativa do escoamento de superfície

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia e Gestão da Água

Contribuição para o estudo de infecção por Treponema pallidum subespécie pallidum: resposta serológica, diagnóstico molecular e genotipagem

A sífilis é uma doença sexualmente transmitida, reconhecida como tal desde o século XVI, cujo agente etiológico é Treponema pallidum subespécie pallidum, para o qual não existe meio de cultura artificial. Sendo uma infecção com inúmeras manifestações clínicas, incluindo a fase de latência e não havendo uma técnica que possa ser um verdadeiro teste padrão, o seu diagnóstico clínico e laboratorial afigura-se muitas vezes difícil. Nesta tese foram avaliados vários testes Venereal Disease Research Laboratory (VDRL), Rapid Plasma Reagin Test (RPR), Treponema pallidum Hemaglutination Antibody (TPHA), Fluorescent Treponemal Antibody Absortion (FTA-Abs), Passive Particle Agglutination Test (TP.PA), teste imunoenzimática (SYPHILIS-EIA) e Western-blot para a pesquisa de anticorpos anti-Treponema pallidum e técnicas de biologia molecular reacção em cadeia da polimerase (PCR) para o diagnóstico da sífilis nos seus diferentes estádios, incluindo neurossífilis. Experimentaram-se várias sequências iniciadoras (47-F/47-R, polA-F/polA-R-(PE), KO3A/KO4 e polA-F/polA-R) para amplificação de fragmentos dos genes da lipoproteína de 47kDa e do ADN polimerase I, e diferentes tipos de amostras: exsudado de úlceras genitais e de lesões cutâneas de secundarismo, exsudado de biopsias do lóbulo da orelha, sangue total, plasma, soro e liquor. Foram também optimizadas técnicas de PCR para a genotipagem de Treponema pallidum (amplificação de um fragmento do gene tpr e do gene arp) as quais foram aplicadas em algumas amostras incluídas neste estudo. Com a técnica de RPR obtiveram-se resultados idênticos ao VDRL no sangue e no liquor, pelo que parece que ambas as técnicas podem ser indiscriminadamente utilizadas nos dois tipos de produtos. Com os testes treponémicos obtiveram-se também, resultados semelhantes no liquor e no sangue. No entanto, as diferenças encontradas indicam que: a) o FTA-Abs, o Western-blot e o TP.PA devem ser os testes a utilizar nas fases precoces da infecção; b) o teste EIA parece indicado no caso de um grande número de amostras; c) o TP.PA e o TPHA podem ser utilizados na rotina laboratorial e, o primeiro eventualmente, também, na monitorização da terapêutica; d) o FTA-Abs e o Western-blot são os testes treponémicos que, de preferência devem ser utilizados no diagnóstico de neurossífilis embora os resultados do TP.PA se comparem aos do TPHA, no caso da infecção do sistema nervoso central por Treponema pallidum. A co-infecção com o VIH parece, ter efeito apenas, na reactividade dos testes não treponémicos, ocasionando falsa reactividade, independentemente da existência simultânea de toxicodependência. Em relação à técnica de PCR para o diagnóstico de sífilis, e para as várias sequências iniciadoras experimentadas os melhores resultados obtiveram-se com o par KO3A/KO4. A sensibilidade da técnica de PCR e de genotipagem nas amostras das úlceras genitais e das lesões cutâneas de sífilis secundária foi de 100%, o mesmo não acontecendo quando as técnicas se aplicaram à identificação de Treponema pallidum no sangue e no liquor, pelo que a técnica de PCR aplicada a este tipo de amostras necessita de ser aperfeiçoada. No entanto o exsudado de biopsia do lóbulo da orelha, seguida do plasma são os produtos, em que mais vezes, se identificou ADN de Treponema pallidum. O genótipo de Treponema pallidum subespécie pallidum mais frequentemente encontrado foi o 14c, sendo que o genótipo 10a foi pela primeira vez identificado no presente estudo.

Infecção por Cryptosporidium parvum: resposta imunitária e tecnologia de anticorpos monoclonais para o diagnóstico

Cryptosporidium parvum é um protozoário intracelular, de distribuição ubiquitária, que causa enterite em humanos e animais. A diarreia é autolimitada em indivíduos imunocompetentes, podendo ser fatal em imunocomprometidos. Actualmente não existem terapêuticas específicas ou preventivas disponíveis, e o elevado custo dos actuais métodos de diagnóstico, sustentam a importância do desenvolvimento de novas abordagens. Vários estudos salientam a importância das células T CD4+ na resposta imunitária à infecção por C. parvum; outros direccionam a sua atenção para as células reguladoras (Treg); e outros tentam esclarecer qual o papel das citocinas específicas produzidas pelas células Th1 e Th2, na regulação da resposta imune, acompanhada pela produção de imunoglobulinas particulares. Na área do diagnóstico, vários e diferentes métodos têm sido utilizados, variando entre a rapidez de execução, especificidade e custo. Várias questões colocam-se, relacionadas com as características das células envolvidas na resposta à infecção e com a especificidade/sensibilidade de cada técnica. Com o objectivo de estudar a resposta imunitária de longo-termo à infecção por C. parvum, no modelo animal imunocompetente, murganhos Balb/c foram inoculados por via oral com oocistos de C. parvum, e efectivadas colheitas e análise de amostras fecais, intestino, sangue e baço, segundo um protocolo previamente definido. A caracterização das populações celulares do sangue e baço foi feita por citometria de fluxo e a identificação e quantificação de imunoglobulinas e citocinas no soro, por tecnologia xMAP® Luminex. A análise por citometria de fluxo não revelou diferenças estatisticamente significativas entre os murganhos infectados e os controlos, tendo sido apenas observado um aumento do número de neutrófilos e eosinófilos circulantes, e a sua posterior diminuição, no primeiro grupo de murganhos. Associada à elevada variabilidade observada após a reinfecção, tais variações são sugeridas como sendo o perfil exibido por estas populações de células no contexto de infecção por C. parvum no organismo imunocompetente, particularmente os eosinófilos, que apresentam um comportamento idêntico em infecção por outros parasitas. O aumento da secreção de TNF-α e IFN-γ (citocinas Th1) nos murganhos infectados, comparativamente com os grupos controlo, para além da secreção de citocinas Th2, como IL-4, IL-5 e IL-10, após a reinfecção, sugere um balanço entre as respostas Th1, para controlar o crescimento do parasita, e Th2, para limitar a patologia. A IgG1 foi o isotipo predominante ao longo de toda a infecção e reinfecção, tendo-se observado um pico de IgG2a após a reinfecção, seguido de diminuição. Esta variação poderá estar relacionada com a função da IgG1 e da IgG2a, ao nível da opsonização e neutralização dos agentes patogénicos, respectivamente. A obtenção de hibridomas secretores de anticorpos específicos para antigénios de C. parvum, por fusão celular, permitiu obter anticorpos e testar a sua aplicação à detecção de oocistos de C. parvum, em amostras fecais humanas e de animais (bovinos). Em resumo, os resultados obtidos permitem sugerir o perfil de imunoglobulinas e citocinas envolvido na resposta à infecção por C. parvum no modelo roedor imunocompetente, assim como desenvolver um futuro “kit” para detecção de C. parvum em amostras biológicas, por técnicas de imunofluorescência

Os erros não amostrais e os fatores da não-resposta em inquéritos por amostragem na Cidade de Maputo

Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Estatística e Gestão de Informação

Resposta proliferativa das células T contra a cruzipaina na cardiopatia chagásica crônica

A natureza dos antigenos do T. cruzi, bem como dos fatores do hospedeiro que contribuem para a cardiopatia chagásica tem sido intensamente investigada nestes últimos anos. Nesse contexto, a caracterização funcional das populações de linfócitos T reativos na fase crônica da doença é particularmente relevante. No presente trabalho, pretende-se analisar a resposta proliferativa de células mononucleares de sangue periférico de pacientes acometidos com a forma cardíaca da doença de Chagas. Os estudos se restrigem à cruzipaina, a cisteíno-protease majoritária do T. cruzi, uma glicoproteína altamente irnunogênica em pacientes chagásicos. Utilizando o índice de estimulação (IE) das culturas de células mononucleares como critério de avaliação de reatividade celular, analisamos 24 individuos: doadores normais (n = 8), cardiopatas não-chagásicos (n = 8) e cardiopatas chagásicos crônicos (n = 8) sem outras associações mórbidas. Pela análise de variância observou-se que os IE dos pacientes chagásicos são significativamente mais altos do que o valor observado nos demais grupos (p = 0,0001) enquanto o teste de comparações múltiplas de Tukey revelou que a média do IE dos individuos normais e cardiopatas não-chagásicos não difere significativamente entre si. Nossos estudos indicam que a resposta dos linfócitos T, face à cruzipaina, está exclusivamente associada ã doença de Chagas. A análise do repertório de epitópos T da cruzipaina e do padrão funcional de reatividade (Th1/Th2) de linfócitos T de sangue periférico estã sendo presentemente conduzida. Em vista da abundante expressão de cruzipaina presente em amastigotas, é possível que linfócitos T anticruzipaina participem das reações inflamatórias associadas com a cardiopatia chagásica. A caracterização destas subpopulações poderá oferecer possíveis subsídios para a identificação de marcadores de cardiopatia chagásica.

Tratamento da forma mucosa de leishmaniose sem resposta a glucantime, com anfotericina B liposomal

Tratamos com ambisome (2 a 5g totais de dose) seis pacientes com leishmaniose mucosa sem resposta a tratamento com glucantime (20mg SbV/kg/dia). A dose diária usada foi 2 a 3mg/kg/dia, aplicada por um mínimo de 20 dias. Após 26 a 38 meses de acompanhamento, cinco pacientes estão clinicamente curados. Um recidivou aos 6 meses. Não foram observados efeitos colaterais além de cefaléia, após a injeção. O ambisome constitue uma opção terapêutica para os pacientes com leishmaniose mucosa sem resposta aos antimoniais.

Análise das reclamações sobre ruído e ferramentas de resposta

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre Engenharia do Ambiente, perfil de Gestão e Sistemas Ambientais

Resposta imune produzida por vacinas anti-rábicas em sagüis (Callithrix sp)

Visando avaliar a resposta imunológica produzida por vacinas anti-rábicas em primatas não humanos neotropicais, trinta sagüis (Callithrix sp) foram divididos em cinco grupos de seis indivíduos e submetidos a cinco diferentes esquemas de vacinação anti-rábica, utilizando-se duas vacinas animais distintas existentes no mercado. A primeira produzida em cérebro de camundongos lactentes (Fuenzalida e Palacios), e a segunda, em cultura de células NIL-2. Acompanhamento sorológico pós-vacinal foi realizado periodicamente. Os resultados mostraram que a vacina Fuenzalida e Palacios não foi eficaz para a proteção dos animais, utilizando-se uma única dose ou mesmo com o reforço. Porém, os sagüis apresentaram anticorpos detectáveis, ao adotar-se o esquema semelhante ao de pré-exposição indicado para os seres humanos, e apenas um animal contraiu raiva após o desafio viral. Por outro lado, a vacina produzida em cultura de células NIL-2 produziu elevados títulos de anticorpos em todos os animais imunizados e todos os animais resistiram ao desafio viral.

Pyruvate kinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase deficies and their association with malaria - population genetics and proteomic studies

A malária é reconhecida como uma das principais forças selectivas a actuar na história recente no genoma humano. Inúmeros polimorfismos genéticos têm sido descritos como protectores contra a gravidade da malária, como o alelo HbS (designado de traço falciforme) e o alelo G6PD A- (associado à deficiência de G6PD). Mais recentemente, também a deficiência de PK foi associada com a protecção contra a malária. Evidências desta associação foram obtidas em estudos com modelos de roedor e estudos in vitro utilizando GV humanos deficientes em PK. Até à data, não foram obtidos dados em populações humanas que revelem esta associação: ainda não foi identificada uma variante de PK com uma prevalência elevada em regiões endémicas de malária e não foram identificadas marcas de selecção na região do gene que codifica para a PK (gene PKLR). Além disso, os mecanismos subjacentes à protecção contra a malária por deficiências enzimáticas dos GV não estão bem esclarecidos. Assim, os objectivos do presente estudo foram: investigar os polimorfismos genéticos humanos com associação com a malária em Cabo Verde; pesquisar marcas de selecção da malária na região do gene PKLR em populações Africanas; determinar a frequência da deficiência em PK e identificar uma eventual variante da enzima que possa estar sob selecção positiva em regiões endémicas de malária; avaliar o efeito das duas deficiências enzimáticas (PK e G6PD) na invasão e maturação do parasita em culturas in vitro de Plasmodium usando GV normais e deficientes; e analisar o perfil proteómico de GV infectados e não infectados, normais e com deficiência (em PK e G6PD), bem como de parasitas isolados de GV tanto deficientes como normais. Em Cabo Verde (área epidémica), não foram identificadas marcas de selecção pela malária, através da análise dos vários polimorfismos. No entanto, quando a análise foi realizada em dois países endémicos (Angola e Moçambique), foram detectadas várias marcas de selecção: a genotipagem de microssatélites (STRs) e polimorfismos de base única (SNPs) localizados na vizinhança do gene PKLR revelou uma diferenciação consideravelmente maior entre as populações Africana e Europeia (Portuguesa), do que a diferenciação determinada aquando da utilização de marcadores genéticos neutros. Além disso, uma região genómica de maior amplitude apresentou um Desequilíbrio de Ligação (LD) significativo no grupo de malária não grave (e não no grupo de malária grave), sugerindo que a malária poderá estar a exercer pressão selectiva sobre a região do genoma humano que envolve o gene PKLR. No estudo que incidiu na determinação da prevalência da deficiência de PK no continente Africano (realizado em Moçambique), esta revelou-se elevada - 4,1% - sendo o valor mais elevado descrito até ao momento a nível mundial para esta enzimopatia. Na pesquisa de mutações que pudessem estar na causa deste fenótipo (baixa actividade de PK), foi identificada uma mutação não sinónima 829G>A (277Glu>Lys), significativamente associada à baixa actividade enzimática. Esta mutação foi também identificada em Angola, São Tomé e Príncipe e Guiné Equatorial, onde a frequência de portadores heterozigóticos foi entre 2,6 e 6,7% (valores que se encontram entre os mais elevados descritos globalmente para mutações associadas à deficiência em PK). Não foi possível concluir acerca da associação entre a deficiência de PK e o grau de severidade da malária e da associação entre o alelo 829A e a mesma, devido ao baixo número de amostras. Os resultados dos ensaios de invasão/maturação do parasita sugeriram que, nos GV com deficiência de PK ou G6PD, a invasão (onde está envolvida a membrana do GV hospedeiro e o complexo apical do parasita) é mais relevante para a eventual protecção contra a malária do que a maturação. Os resultados da análise proteómica revelaram respostas diferentes por parte do parasita nas duas condições de crescimento (GV com deficiência de PK e GV com deficiência de G6PD). Esta resposta parece ser proporcional à gravidade da deficiência enzimática. Nos parasitas que cresceram em GV deficientes em G6PD (provenientes de um indivíduo assintomático), a principal alteração observada (relativamente às condições normais) foi o aumento do número de proteínas de choque térmico e chaperones, mostrando que os parasitas responderam às condições de stress oxidativo, aumentando a expressão de moléculas de protecção. Nos parasitas que cresceram em condições de deficit de PK (GV de indivíduo com crises hemolíticas regulares, dependente de transfusões sanguíneas), houve alteração da expressão de um maior número de proteínas (relativamente ao observado em condições normais), em que a maioria apresentou uma repressão da expressão. Os processos biológicos mais representados nesta resposta do parasita foram a digestão da hemoglobina e a troca de proteínas entre hospedeiro e parasita/remodelação da superfície do GV. Além disso, uma elevada percentagem destas proteínas com expressão alterada está relacionada com as fendas de Maurer, que desempenham um papel importante na patologia da infecção malárica. É colocada a hipótese de que a protecção contra a malária em GV deficientes em PK está relacionada com o processo de remodelação da membrana dos GV pelo parasita, o que pode condicionar a invasão por novos parasitas e a própria virulência da malária. Os resultados da análise do proteoma dos GV contribuirão para confirmar esta hipótese.

Resposta de fase aguda, subnutrição e estado nutricional do ferro em adultos com AIDS

Foram comparados o estado nutricional e parâmetros do metabolismo do ferro de adultos HIV-positivos, com ou sem resposta de fase aguda (RFA). Adultos HIV-positivos (n = 29) submeteram-se a antropometria, recordatório alimentar e determinação sérica de albumina, proteína C reativa (PCR), ferritina e capacidade total de ligação do ferro (CTLF), além de creatinina urinária. Infecção mais PCR > 7mg/dl foram critérios de positividade da RFA. Índice de massa corporal (IMC < 18,5kg/m2) e índice creatinina-altura (ICA < 70%) definiram subnutrição. Subnutrição (77,8 vs 40%) e tuberculose pulmonar (44,4 vs 9,5%) foram mais freqüentes nos pacientes RFA-positivos, que também apresentaram menores níveis de albumina (3,7 ± 0,9 vs 4,3 ± 0,9g/dl), CTLF (165,8 ± 110,7 vs 265,9 ± 74,6mg/dl) e hemoglobina (10,5± 1,8 vs 12,6 ± 2,3g/dl). A ingestão de ferro foi adequada e similar entre RFA-positivos e RFA-negativos, o mesmo ocorrendo, respectivamente, quanto à ferritina sérica (mediana; variação, 568; 45,3-1814 vs 246; 18,4-1577ng/ml). Pacientes HIV-positivos com resposta de fase aguda são nutricionalmente mais comprometidos e têm anemia que parece não depender da ingestão recente de ferro.

A relevância do factor de transcrição Yap5 de Saccharomyces cerevisiae na resposta ao excesso de ferro

A capacidade que os organismos possuem de alterar os seus padrões de expressão de genes em resposta a alterações no meio ambiente é essencial para a sua viabilidade. A levedura Saccharomyces cerevisiae, em particular, possui um programa complexo e muito flexível de expressão de genes quando exposta a mudanças agressivas do seu meio ambiente. As células mantêm a sua homeostase através de mecanismos coordenados de regulação de vários factores de transcrição, cada um desempenhando funções específicas. Neste trabalho foi estudada a relevância do factor de transcrição da família Yap de S. cerevisiae, o Yap5, na destoxificação do excesso de ferro na célula. Os resultados obtidos neste trabalho mostram que após a incubação com elevadas quantidades de sulfato de ferro, embora o potencial de transactivação do Yap5 aumente, os níveis da proteína diminuem, sendo esta diminuição dependente da concentração de ferro. Demonstrámos também que embora a expressão do gene CCC1 (que codifica para o único transportador vacuolar de ferro conhecido) seja dependente do Yap5 em condições de excesso de ferro, os níveis basais de expressão deste gene são suficientes para a sobrevivência nessas condições. Observámos ainda que, ao contrário do que acontece em Schizosaccharomyces pombe, o factor de transcrição Hap4, não parece estar envolvido nesta regulação. Através de delecções sequenciais da região promotora do CCC1, verificámos que os níveis de expressão ditados por uma região de 58pb a montante do codão de iniciação, ATG, são suficientes para a célula sobreviver sob concentrações elevadas de ferro. Verificámos ainda que a região 3’UTR do gene é importante para a sobrevivência celular. Nessa região, identificámos uma estrutura em forma de “hairpin” que poderá estar envolvida na regulação do gene.