Genome-wide methylation profiling identifies an essential role of reactive oxygen species in pediatric glioblastoma multiforme and validates a methylome specific for H3 histone family 3A with absence of G-CIMP/isocitrate dehydrogenase 1 mutation

Background. Pediatric glioblastoma multiforme (GBM) is rare, and there is a single study, a seminal discovery showing association of histone H3.3 and isocitrate dehydrogenase (IDH) 1 mutation with a DNA methylation signature. The present study aims to validate these findings in an independent cohort of pediatric GBM, compare it with adult GBM, and evaluate the involvement of important functionally altered pathways. Methods. Genome-wide methylation profiling of 21 pediatric GBM cases was done and compared with adult GBM data (GSE22867). We performed gene mutation analysis of IDH1 and H3 histone family 3A (H3F3A), status evaluation of glioma cytosine-phosphate-guanine island methylator phenotype (G-CIMP), and Gene Ontology analysis. Experimental evaluation of reactive oxygen species (ROS) association was also done. Results. Distinct differences were noted between methylomes of pediatric and adult GBM. Pediatric GBM was characterized by 94 hypermethylated and 1206 hypomethylated cytosine-phosphate-guanine (CpG) islands, with 3 distinct clusters, having a trend to prognostic correlation. Interestingly, none of the pediatric GBM cases showed G-CIMP/IDH1 mutation. Gene Ontology analysis identified ROS association in pediatric GBM, which was experimentally validated. H3F3A mutants (36.4%; all K27M) harbored distinct methylomes and showed enrichment of processes related to neuronal development, differentiation, and cell-fate commitment. Conclusions. Our study confirms that pediatric GBM has a distinct methylome compared with that of adults. Presence of distinct clusters and an H3F3A mutation-specific methylome indicate existence of epigenetic subgroups within pediatric GBM. Absence of IDH1/G-CIMP status further indicates that findings in adult GBM cannot be simply extrapolated to pediatric GBM and that there is a strong need for identification of separate prognostic markers. A possible role of ROS in pediatric GBM pathogenesis is demonstrated for the first time and needs further evaluation.

Targeted Modifications in Adeno-Associated Virus Serotype 8 Capsid Improves Its Hepatic Gene Transfer Efficiency In Vivo

Recombinant adeno-associated virus vectors based on serotype 8 (AAV8) have shown significant promise for liver-directed gene therapy. However, to overcome the vector dose dependent immunotoxicity seen with AAV8 vectors, it is important to develop better AAV8 vectors that provide enhanced gene expression at significantly low vector doses. Since it is known that AAV vectors during intracellular trafficking are targeted for destruction in the cytoplasm by the host-cellular kinase/ubiquitination/proteasomal machinery, we modified specific serine/threonine kinase or ubiquitination targets on the AAV8 capsid to augment its transduction efficiency. Point mutations at specific serine (S)/threonine (T)/lysine (K) residues were introduced in the AAV8 capsid at the positions equivalent to that of the effective AAV2 mutants, generated successfully earlier. Extensive structure analysis was carried out subsequently to evaluate the structural equivalence between the two serotypes. scAAV8 vectors with the wild-type (WT) and each one of the S/T -> Alanine (A) or K-Arginine (R) mutant capsids were evaluated for their liver transduction efficiency in C57BL/6 mice in vivo. Two of the AAV8-S -> A mutants (S279A and S671A), and a K137R mutant vector, demonstrated significantly higher enhanced green fluorescent protein (EGFP) transcript levels (similar to 9- to 46-fold) in the liver compared to animals that received WT-AAV8 vectors alone. The best performing AAV8 mutant (K137R) vector also had significantly reduced ubiquitination of the viral capsid, reduced activation of markers of innate immune response, and a concomitant two-fold reduction in the levels of neutralizing antibody formation in comparison to WT-AAV8 vectors. Vector bio-distribution studies revealed that the K137R mutant had a significantly higher and preferential transduction of the liver (106 vs. 7.7 vector copies/mouse diploid genome) when compared to WT-AAV8 vectors. To further study the utility of the K137R-AAV8 mutant in therapeutic gene transfer, we delivered human coagulation factor IX (h. FIX) under the control of liver-specific promoters (LP1 or hAAT) into C57BL/6 mice. The circulating levels of h. FIX: Ag were higher in all the K137R-AAV8 treated groups up to 8 weeks post-hepatic gene transfer. These studies demonstrate the feasibility of the use of this novel AAV8 vectors for potential gene therapy of hemophilia B.

A novel gene THSD7A is associated with obesity

Body mass index (BMI) is a non-invasive measurement of obesity. It is commonly used for assessing adiposity and obesity-related risk prediction. Genetic differences between ethnic groups are important factors, which contribute to the variation in phenotypic effects. India inhabited by the first out-of-Africa human population and the contemporary Indian populations are admixture of two ancestral populations; ancestral north Indians (ANI) and ancestral south Indians (ASI). Although ANI are related to Europeans, ASI are not related to any group outside Indian-subcontinent. Hence, we expect novel genetic loci associated with BMI. In association analysis, we found eight genic SNPs in extreme of distribution (P <= 3.75 x 10(-5)), of which WWOX has already been reported to be associated with obesity-related traits hence excluded from further study. Interestingly, we observed rs1526538, an intronic SNP of THSD7A; a novel gene significantly associated with obesity (P = 2.88 x 10(-5), 8.922 x 10(-6) and 2.504 x 10(-9) in discovery, replication and combined stages, respectively). THSD7A is neural N-glycoprotein, which promotes angiogenesis and it is well known that angiogenesis modulates obesity, adipose metabolism and insulin sensitivity, hence our result find a correlation. This information can be used for drug target, early diagnosis of obesity and treatment.

Regulation of Growth, Cell Shape, Cell Division, and Gene Expression by Second Messengers (p)ppGpp and Cyclic Di-GMP in Mycobacterium smegmatis

The alarmone (p)ppGpp regulates transcription, translation, replication, virulence, lipid synthesis, antibiotic sensitivity, biofilm formation, and other functions in bacteria. Signaling nucleotide cyclic di-GMP (c-di-GMP) regulates biofilm formation, motility, virulence, the cell cycle, and other functions. In Mycobacterium smegmatis, both (p) ppGpp and c-di-GMP are synthesized and degraded by bifunctional proteins Rel(Msm) and DcpA, encoded by rel(Msm) and dcpA genes, respectively. We have previously shown that the Delta rel(Msm) and Delta dcpA knockout strains are antibiotic resistant and defective in biofilm formation, show altered cell surface properties, and have reduced levels of glycopeptidolipids and polar lipids in their cell wall (K. R. Gupta, S. Kasetty, and D. Chatterji, Appl Environ Microbiol 81:2571-2578, 2015, http://dx.doi.org/10.1128/AEM.03999-14). In this work, we have explored the phenotypes that are affected by both (p) ppGpp and c-di-GMP in mycobacteria. We have shown that both (p) ppGpp and c-di-GMP are needed to maintain the proper growth rate under stress conditions such as carbon deprivation and cold shock. Scanning electron microscopy showed that low levels of these second messengers result in elongated cells, while high levels reduce the cell length and embed the cells in a biofilm-like matrix. Fluorescence microscopy revealed that the elongated Delta rel(Msm) and Delta dcpA cells are multinucleate, while transmission electron microscopy showed that the elongated cells are multiseptate. Gene expression analysis also showed that genes belonging to functional categories such as virulence, detoxification, lipid metabolism, and cell-wall-related processes were differentially expressed. Our results suggests that both (p) ppGpp and c-di-GMP affect some common phenotypes in M. smegmatis, thus raising a possibility of cross talk between these two second messengers in mycobacteria. IMPORTANCE Our work has expanded the horizon of (p) ppGpp and c-di-GMP signaling in Gram-positive bacteria. We have come across a novel observation that M. smegmatis needs (p) ppGpp and c-di-GMP for cold tolerance. We had previously shown that the Delta rel(Msm) and Delta dcpA strains are defective in biofilm formation. In this work, the overproduction of (p) ppGpp and c-di-GMP encased M. smegmatis in a biofilm-like matrix, which shows that both (p) ppGpp and c-di-GMP are needed for biofilm formation. The regulation of cell length and cell division by (p) ppGpp was known in mycobacteria, but our work shows that c-di-GMP also affects the cell size and cell division in mycobacteria. This is perhaps the first report of c-di-GMP regulating cell division in mycobacteria.

Gene enrichment using antibodies to DNA/RNA hybrids : mapping the ribosomal DNA of slime mold and rat

A novel method for gene enrichment has been developed and applied to mapping the rRNA genes of two eucaryotic organisms. The method makes use of antibodies to DNA/RNA hybrids prepared by injecting rabbits with the synthetic hybrid poly(rA)•poly(dT). Antibodies which cross-react with non-hybrid nucleic acids were removed from the purified IgG fraction by adsorption on columns of DNA-Sepharose, oligo(dT)-cellulose, and poly(rA)-Sepharose. Subsequent purification of the specific DNA/RNA hybrid antibody was carried out on a column of oligo(dT)-cellulose to which poly(rA) was hybridized. Attachment of these antibodies to CNBr-activated Sepharose produced an affinity resin which specifically binds DNA/RNA hybrids.

In order to map the rDNA of the slime mold Dictyostelium discoideum, R-loops were formed using unsheared nuclear DNA and the 178 and 268 rRNAs of this organism. This mixture was passed through a column containing the affinity resin, and bound molecules containing R- loops were eluted by high salt. This purified rDN A was observed directly in the electron microscope. Evidence was obtained that there is a physical end to Dictyostelium rDN A molecules approximately 10 kilobase pairs (kbp) from the region which codes for the 268 rRNA. This finding is consistent with reports of other investigators that the rRNA genes exist as inverse repeats on extra-chromosomal molecules of DNA unattached to the remainder of the nuclear DNA in this organism.

The same general procedure was used to map the rRNA genes of the rat. Molecules of DNA which contained R-loops formed with the 188 and 288 rRNAs were enriched approximately 150- fold from total genomal rat DNA by two cycles of purification on the affinity column. Electron microscopic measurements of these molecules enabled the construction of an R-loop map of rat rDNA. Eleven of the observed molecules contained three or four R-loops or else two R-loops separated by a long spacer. These observations indicated that the rat rRNA genes are arranged as tandem repeats. The mean length of the repeating units was 37.2 kbp with a standard deviation of 1.3 kbp. These eleven molecules may represent repeating units of exactly the same length within the errors of the measurements, although a certain degree of length heterogeneity cannot be ruled out. If significantly shorter or longer repeating units exist, they are probably much less common than the 37.2 kbp unit.

The last section of the thesis describes the production of antibodies to non-histone chromosomal proteins which have been exposed to the ionic detergent sodium dodecyl sulfate (SDS). The presence of low concentrations of SDS did not seem to affect either production of antibodies or their general specificity. Also, a technique is described for the in situ immunofluorescent detection of protein antigens in polyacrylamide gels.

Estudio comparativo entre tumor primario y metastásico de la trimetilación de la Histona H3 en el modelo in vivo de metástasis hepática de cáncer colorrectal murino.

Los mecanismos epigenéticos, entre los que está implicada la modificación covalente de histonas, son esenciales para el mantenimiento estable de la actividad génica en las células. Estos mecanismos también están implicados en la aparición de enfermedades como el cáncer colorrectal (CCR), siendo la metástasis hepática una de las formas más agresivas de la misma al producir una drástica disminución de la esperanza de vida del enfermo. Las modificaciones en las histonas, conocidas recientemente como código histónico, afectan a la estructura de la cromatina y juegan un papel importante en el desarrollo de la tumorogénesis. Sin embargo, se sabe poco acerca de aquellas células que adquieren la capacidad de metastatizar, y es por ello que en el presente trabajo se estudian las diferencias epigenéticas entre células tumorales primarias y células tumorales metastásicas para el patrón de trimetilación de la histona H3 en tres residuos diferentes del aminoácido lisina: lisina 4 (H3K4me3), lisina 9 (H3K9me3) y lisina 27 (H3K27me3).

The Interplay between Natural Selection and Susceptibility to Melanoma on Allele 374F of SLC45A2 Gene in a South European Population

We aimed to study the selective pressures interacting on SLC45A2 to investigate the interplay between selection and susceptibility to disease. Thus, we enrolled 500 volunteers from a geographically limited population (Basques from the North of Spain) and by resequencing the whole coding region and intron 5 of the 34 most and the 34 least pigmented individuals according to the reflectance distribution, we observed that the polymorphism Leu374Phe (L374F, rs16891982) was statistically associated with skin color variability within this sample. In particular, allele 374F was significantly more frequent among the individuals with lighter skin. Further genotyping an independent set of 558 individuals of a geographically wider population with known ancestry in the Spanish population also revealed that the frequency of L374F was significantly correlated with the incident UV radiation intensity. Selection tests suggest that allele 374F is being positively selected in South Europeans, thus indicating that depigmentation is an adaptive process. Interestingly, by genotyping 119 melanoma samples, we show that this variant is also associated with an increased susceptibility to melanoma in our populations. The ultimate driving force for this adaptation is unknown, but it is compatible with the vitamin D hypothesis. This shows that molecular evolution analysis can be used as a useful technology to predict phenotypic and biomedical consequences in humans.

Efeito da dieta hipocalórica no perfil metabólico e composição corporal de mulheres com e sem Síndrome Metabólica e genótipo Pro12Pro do gene PPAR&#947;&#947;2

A obesidade é uma doença crônica não transmissível, caracterizada pelo excesso de gordura corporal. Então, a gordura acumulada na região abdominal promove resistência à insulina e conseqüentemente alterações metabólicas as quais em conjunto configuram o quadro de síndrome metabólica (SM). O genótipo Pro12Pro parece estar relacionado à menor sensibilidade à insulina, desencadeando o processo fisiopatológico da SM. Então, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de uma dieta hipocalórica sobre o perfil metabólico e composição corporal de mulheres com e sem SM com genótipo Pro12Pro no gene PPAR&#947;2. O presente estudo trata-se de um ensaio clínico, onde mulheres entre 30 e 45 anos, obesas grau I, sem SM (n=23) e com SM (n=7) foram submetidas à dieta hipocalórica por 90 dias. A identificação do genótipo foi realizada por reação em cadeia da polimerase (PCR). No início e nos dias 30, 60 e 90 foram avaliados peso corporal, massa magra (MM), massa gorda (MG), componentes da SM, uricemia, insulinemia, leptinemia, adiponectinemia, os índices HOMA-IR e QUICKI. O consumo energético foi avaliado nas 12 semanas de tratamento. Foi utilizado o teste t de Student para amostras independentes foi utilizado para comparar os grupos entre si, e o modelo pareado para comparar a evolução dentro de cada grupo em relação ao início do estudo. Todas as mulheres apresentaram genótipo Pro12Pro. O grupo com SM apresentou menor HDL-c (44,43,2 vs. 56,82,4 mg/dL, p=0,013), e maior triglicerídeo (180,926,7 vs. 89,76,6mg/dL, p=0,014) e VLDL-c (36,25,3 vs. 17,91,3mg/dL, p=0,014) no início do estudo. Ambos os grupos apresentaram redução ponderal (-3,30,7% grupo sem SM e - 4,20,9% grupo com SM) e da circunferência da cintura (-2,40,5% grupo sem SM e - 5,91,4% grupo com SM) significativas. O grupo sem SM reduziu da MG progressivamente até os 90 dias (37,00,8 para 36,60,5%, p=0,02), e com isso aumentou MM (62,00,5 para 63,40,5%, p=0,01), o grupo com SM também reduziu MG ao longo do estudo (32,62,3 para 29,62,4%, p<0,01) e aumentou MM significativamente (62,21,0 para 64,31,3%). A pressão arterial sistólica reduziu no primeiro mês de tratamento no grupo sem SM (de 120,41,8 para 112,32,1 mmHg, p<0,01). No que diz respeito aos parâmetros metabólicos, o grupo sem SM mostrou redução da insulinemia (32,54,2 para 25,92,4U/mL, p=0,05) e aumento da adiponectinemia (4,70,6 para 5,10,8 ng/mL, p=0,02) aos 30 dias, do colesterol total (180,25,8 para 173,85,4 mg/dL, p=0,04), e da leptina (27,01,9 para 18,21,4 ng/mL, p<0,01) aos 60 dias, porém, houve redução do QUICKI aos 90 dias (0,390,03 para 0,350,01, p=0,01). No grupo com SM, a leptinemia reduziu aos 60 dias (20,31,9 para 14,71,1 ng/mL, p=0,01) e a adiponectinemia aos 90 dias (5,71,2 para 7,11,4 ng/mL, p<0,01), também houve remissão de 57,1% dos casos de SM. Sugerimos que, a dieta hipocalórica foi eficaz na redução do peso corporal e da MG, principalmente a localizada na região abdominal. Conseqüentemente, houve melhora considerável do perfil metabólico relacionado à obesidade no grupo sem SM, e também dos marcadores de sensibilidade à insulina e cardioprotetores relacionados à SM, além da remissão dos casos de SM.

Mutações no gene JARID1C e rearranjos subteloméricos como causas de deficiência intelectual familiar de etiologia idiopática

A Deficiência Intelectual (DI) é uma condição complexa, que acomete 2-3% da população mundial, constituindo um importante problema de saúde pública. No entanto, uma parcela significativa dos casos de DI permanece sem um diagnóstico definitivo, o que demonstra que muitos fatores etiológicos associados a esta condição ainda precisam ser elucidados. Há um consenso de que o número de homens com DI supera em 30% o número de mulheres, um achado atribuído à presença de mutações em genes localizados no cromossomo X. Dentre os genes presentes neste cromossomo que são expressos no cérebro, o Jumonji AT-rich interactive domain 1C (JARID1C) foi identificado como um potencial candidato a estar relacionado à DI ligada ao X (DILX). O gene JARID1C codifica uma desmetilase da lisina 4 da histona H3 (H3K4), imprescindível para a regulação epigenética. Tão importante quanto o estudo do gene JARID1C em pacientes com DI é a busca por variações no número de cópias gênicas (VNCs) em regiões cromossômicas subteloméricas. Genes relacionados ao desenvolvimento cerebral são enriquecidos em VNCs e as regiões subteloméricas são mais susceptíveis à formação destes rearranjos. Diante do exposto, neste estudo, investigamos mutações no gene JARID1C (exons 3, 4, 5, 8, 10, 14 e 23) em 148 homens portadores de DI pertencentes a famílias com padrão de segregação sugestivo de DILX. Paralelamente, analisamos VNCs subteloméricas em 174 homens com DI familiar de etiologia idiopática, independente do padrão de segregação. Para todos os indivíduos selecionados, amostras de DNA genômico foram extraídas a partir de sangue periférico e alterações genéticas frequentemente relacionadas à DI foram previamente excluídas (expansões trinucleotídicas nos loci FRAXA e FRAXE e mutações nos genes MECP2 e ARX). A análise do gene JARID1C foi realizada pela técnica de PCR, seguida da análise dos produtos amplificados por sequenciamento. Foram identificadas quatro variantes silenciosas (c.564G>A, c.633G>C, c.1884G>A, c.1902C>A). Através da análise in silico de sequências exônicas acentuadoras de splicing (ESEs) localizadas nas posições das variantes encontradas, foi possível classificar a variante c.1884G>A como neutra e as três variantes restantes como possíveis criadoras de ESEs. Já para a investigação das VNCs subteloméricas, foi utilizada a metodologia de Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA), capaz de identificar microdeleções e microduplicações nas 46 regiões subteloméricas. Para este fim, inicialmente, os indivíduos foram investigados pelo kit de MLPA P036, enquanto que para aqueles que exibiram alterações também foi utilizado o kit P070. A validação das VNCs encontradas foi realizada por PCR quantitativo em Tempo Real. A análise por MLPA revelou um indivíduo apresentando duas deleções (9p e 13q), um indivíduo apresentando duas amplificações (1p e 2p), dois indivíduos apresentando uma deleção e uma amplificação (18p e 18q; 4p e 8p), quatro indivíduos portadores de uma deleção cada (10p, 20p, 3q e 22q) e dois indivíduos com uma amplificação cada (7q e 20p). Algumas das alterações subteloméricas encontradas (2,87%) representam VNCs de relevância clínica para o estudo da DI, reforçando a importância do rastreamento de rotina de VNCs subteloméricas na DI familiar. Consideramos que a elucidação de novos genes ou mecanismos moleculares diretamente relacionados à DI é um caminho promissor e urgente para o estabelecimento de novas estratégias terapêuticas possíveis.

Associação entre variantes do gene da adiponectina (ADIPOQ): -11391 G/A, -11377 C/G, 45T>G e I164T e os níveis circulantes de adiponectina de alto peso molecular e fatores de risco cardiometabólico

A adiponectina, um hormônio produzido pelo tecido adiposo, atua na regulação do metabolismo energético e interfere favoravelmente na sensibilidade à insulina através de suas ações no fígado e musculatura esquelética. Ao contrário da maioria das outras adipocitocinas, associa-se inversamente com a obesidade visceral, resistência à insulina, diabetes tipo 2 e doença cardiovascular. Inúmeros estudos demonstraram nos últimos anos os efeitos de variantes genéticas no gene ADIPOQ sobre os níveis circulantes de adiponectina, resistência à insulina, diabetes e obesidade. Entretanto, além de resultados contraditórios, a maior parte desses estudos foi realizada em populações Caucasianas e Asiáticas. Avaliar, em uma população multiétnica adulta do município do Rio de Janeiro, as possíveis associações das variantes genéticas (-11391 G>A, -11377C>G, +45T>G e T517G) no gene ADIPOQ com o fenótipo obeso, níveis circulantes de adiponectina de alto peso molecular e fatores de risco cardiometabólico. Trata-se de um estudo transversal. Foram estudados 100 indivíduos eutróficos (IMC 18,5 24,9 kg/m2, idade: 32,5 + 9,8 anos) e 100 obesos (IMC 30 58,2 kg/m2, idade 37,5 + 14,1 anos), igualmente divididos entre homens e mulheres. Os indivíduos obesos apresentaram valores significativamente maiores de circunferência abdominal, pressão arterial sistólica, diastólica e média, glicemia de jejum, triglicerídeos, LDL-colesterol, leptina, insulina, HOMA-IR e proteína C reativa, quando comparados aos eutróficos. Contrariamente, exibiram menores valores de adiponectina e HDL-colesterol. Análises de correlação mostraram relação inversa e significativa entre a adiponectina, circunferência abdominal, insulina, HOMA-IR e pressão arterial. Com os níveis de HDL-colesterol, a correlação foi positiva. Por meio de análise de regressão múltipla foi possível identificar os determinantes dos níveis séricos de adiponecinta. Sexo masculino, circunferência abdominal, HOMA-IR e a variante genética -11391G>A, foram os principais responsáveis por essa variação, com um R2 de 30%. Quanto à análise genética, não encontramos nenhuma associação entre essas variantes e o fenótipo obeso. Entretanto, os indivíduos carreadores do alelo mutante -11391A apresentaram menores valores de glicemia, pressão arterial e relação cintura-quadril e maiores concentrações sanguíneas de adiponectina, quando comparados aos indivíduos ditos selvagens. Ademais, os carreadores do alelo mutante -11377G apresentaram menores valores de pressão arterial sistólica, diastólica e média. Os resultados do presente estudo demonstram que níveis de adiponectina diferem entre eutróficos e obesos e que concentrações mais baixas dessa adipocitocina estão associadas a um pior perfil cardiometabólico. Variantes no gene ADIPOQ podem interferir nessa relação e alguns polimorfismos parecem ter um perfil protetor no risco cardiovascular.