898 resultados para Transfection transitoire
Resumo:
Ralis en cotutelle avec l'Universit de Lorraine (France)
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Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l'actylation de l'histone H3 sur la lysine 56 (H3K56ac) est prsente sur les histones no-synthtises dposes derrire les fourches de rplication et est essentielle pour prserver la viabilit cellulaire en rponse au dommage l'ADN. La dsactylation d'H3K56 sur l'ensemble du gnome catalyse par Hst3 et Hst4 et a lieu en phase G2 ou M. H3K56ac est une lame double tranchant. L'absence d'H3K56ac rend les cellules sensibles aux dommages l'ADN. En revanche, un excs d'actylation d'H3K56 dans un mutant hst3 hst4 a des consquences encore plus svres tels que la thermo-sensibilit, l'hypersensibilit aux agents gnotoxiques, l'instabilit gnomique ainsi qu'une courte dure de vie rplicative. Les dsactylases Hst3 et Hst4 sont troitement rgules au cours du cycle cellulaire afin de permettre l'H3K56ac d'exercer son rle en rponse aux dommages l'ADN tout en vitant les consquences nfastes de l'hyperactylation d'H3K56. Dans cette thse, nous avons identifi la machinerie molculaire responsable de la dgradation de Hst3. De plus, nous avons explor les raisons pour lesquelles l'absence de dsactylation donne lieu aux phnotypes du mutant hst3 hst4. Au chapitre 2, nous dmontrons que la dgradation d'Hst3 peut tre complte avant l'anaphase. Ceci suggre que la dsactylation de H3K56 a lieu durant une courte fentre du cycle cellulaire se situant entre la compltion de la phase S et la mtaphase. De plus, nous avons identifi deux sites de phosphorylation d'Hst3 par la kinase cycline-dpendante 1 (Cdk1) et dmontr que ces vnements de phosphorylation conduisent la dgradation d'Hst3 in vivo. Nous avons aussi dmontr que l'ubiquityltransfrase Cdc34 et l'ubiquitine ligase SCFCdc4 sont requises pour la dgradation d'Hst3. Finalement, nous avons montr que la phosphorylation d'Hst3 par la kinase mitotique Clb2-Cdk1 peut directement entraner l'ubiquitylation d'Hst3 par SCFCdc4 in vitro. Au chapitre 3, nous avons tudi les mcanismes molculaires sous-jacents la sensibilit extrme du mutant hst3 hst4 aux agents qui endommagent l'ADN. Nous avons tabli qu'en raison de la prsence anormale d'H3K56ac devant les fourches de rplication, le mutant hst3 hst4 exhibe une forte perte de viabilit lorsqu'expos au mthyl mthanesulfonate (MMS) durant un seul passage travers la phase S. Nous avons aussi dcouvert que, malgr le fait que le point de contrle de rponse aux dommages l'ADN est activ normalement dans le mutant hst3 hst4, ce mutant est incapable de complter la rplication de l'ADN et d'inactiver le point de contrle pour une longue priode de temps aprs exposition transitoire au MMS. L'ensemble de nos rsultats suggre que les lsions l'ADN induites par le MMS dans le mutant hst3 hst4 causent une forte perte de viabilit parce que ce mutant est incapable de complter la rplication de l'ADN aprs une exposition transitoire au MMS. Dans la deuxime section du chapitre 3, nous avons employ une approche gntique afin d'identifier de nouveaux mcanismes de suppression de deux phnotypes prononcs du mutant hst3 hst4. Nous avons dcouvert que la dltion de plusieurs gnes impliqus dans la formation de frontires entre l'htrochromatine et de l'euchromatine attnue les phnotypes du mutant hst3 hst4 sans rduire l'hyperactylation d'H3K56. Nos rsultats indiquent aussi que l'abondante actylation de l'histone H4 sur la lysine 16 (H4K16ac) est nfaste au mutant hst3 hst4. Ce rsultat suggre un lien gntique intriguant entre l'actylation d'H3K56 et celle d'H4K16. L'existence de ce lien tait jusqu' prsent inconnu. Nous avons identifi un groupe de suppresseurs spontans o H3K56ac est indtectable, mais la majorit de nos suppresseurs ne montrent aucune rduction flagrante d'H3K56ac ou d'H4 K16ac par rapport aux niveaux observs dans le mutant hst3 hst4. Une tude plus approfondie de ce groupe de suppresseurs est susceptible de mener la dcouverte de nouveaux mcanismes gntiques ou pigntiques permettant d'viter les consquences catastrophiques de l'hyperactylation d'H3K56 chez le mutant hst3 hst4. En rsum, cette thse identifie la machinerie molculaire responsable de la dgradation d'Hst3 (une dsactylase d'H3K56) durant une fentre de temps situes entre la fin de la phase S et la mtaphase. Nos rsultats permettent aussi d'expliquer pourquoi la dgradation d'Hst3 prcde le dbut de la phase S durant laquelle l'actylation d'H3K56 s'accumule derrire les fourches de rplication afin d'exercer son rle de mcanisme de dfense contre le dommage l'ADN. De plus, nous avons identifi plusieurs suppresseurs qui permettent de contourner le rle important d'Hst3 et Hst4 en rponse au dommage l'ADN. Plusieurs suppresseurs rvlent un lien gntique inattendu entre deux formes abondantes d'actylation des histones chez Saccharomyces cerevisiae, soit H3K56ac et H4K16ac.
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Les cellules T CD8+ jouent un rle primordial dans le contrle des infections virales en limitant la dissmination des cellules infectes. Lors de linfection chronique par le virus HIV, les cellules T CD8+ HIV-spcifiques ne se diffrencient pas en cellules effectrices fonctionnelles capables de tuer les cellules infectes par le virus ; ces cellules ne sont plus capables de prolifrer ou de produire l IL-2. Ces cellules expriment PD-1 et lengagement de PD-1, par son ligand, aboutit a plusieurs de ces dficits fonctionnels des cellules T . Le rle de PD-1 dans la rgulation d'vnements transcriptionnels contrlant la diffrentiation et l'obtention des fonction effectrices des cellules T CD8+ reste dmontrer. Id2 joue un rle central dans la diffrenciation des cellules T CD8+ effectrices. Nous avons mis lhypothse que le dfaut de maturation observ chez les cellules T CD8+ PD-1 high HIV-spcifiques (CD8+PD-1hi) au cours de linfection chronique par le virus HIV pouvait tre li la diminution dexpression du rgulateur Id2. Nous avons ainsi dmontr que l'engagement de PD-1 contribuait une diminution d'expression de Id2 et de ses cibles transcriptionnelles. La surexpression de Id2 de ces cellules a permis de restaurer l'expression de marqueurs tels que Granzyme B et Bcl-2 et diminuir lexpression du marqueur de maturation de CD27. La famille des cytokines chaine gamma joue un rle clef dans la survie et lhomostasie des cellules T. Dans ce travail, nous avons dmontr que lIL-15 tait unique grce ses capacits de stimulation de lexpression dId2 et ses proprits favorisant la survie ainsi que la diffrenciation des cellules T CD8+ effectrices. lIL-15 induit la prolifration de toutes les populations de cellules T mmoires provenant de donneurs sains. Laddition de cette cytokine aux sous-populations cellulaires Ttm et Tem a permis leur diffrenciation en cellules effectrices capables de produire Granzyme B alors que la stimulation par lIL-15 des cellules Tcm ne favorise pas leur diffrenciation. Un test de cytotoxiciti par cytomtrie en flux nous a permis de confirmer que la stimulation de cellules T CD8+ HIV spcifiques par lIL-15 favorisait lexpression de Id2 et restaurait les fonctions cytotoxiques des cellules T CD8+ HIV spcifiques. En conclusion, nous avons pour la premire fois dans cette thse dfini les mcanismes molculaires impliqus dans la modulation de lexpression du rgulateur transcriptionnel Id2 par lIL-15. Nous avons galement rvl comment lengagement de PD-1 conduisait a une altration de lexpression et de la fonction dId2 et favorisait la diminution des fonctions effectrices des cellules T CD8-HIV spcifiques. Une perspective de traitement avec des agents tels que lIL-15 ou le bloquage de PD-1, en combinaison avec les traitements conventionnels, pourrait contribuer une meilleure stimulation des rponses immunes favorisant ainsi la ractivation des cellules T CD8+ et permettant la destruction de cellules T CD4+ infectes de manire latente.
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L'tre humain utilise trois systmes sensoriels distincts pour rguler le maintien de la station debout: la somesthsie, le systme vestibulaire, et le systme visuel. Le rle de la vision dans la rgulation posturale demeure peu connu, notamment sa variabilit en fonction de l'ge, du type dveloppemental, et des atteintes neurologiques. Dans notre travail, la rgulation posturale induite visuellement a t value chez des participants au dveloppement et vieillissement normaux gs de 5-85 ans, chez des individus autistes (dveloppement atypique) gs de 12-33 ans, ainsi que chez des enfants entre 9-18 ans ayant subi un TCC lger. cet effet, la ractivit posturale des participants en rponse un tunnel virtuel entirement immersif, se mouvant trois niveaux de vlocit, a t mesure; des conditions contrles, o le tunnel tait statique ou absent, ont t incluses. Les rsultats montrent que la ractivit (i.e. instabilit) posturale induite visuellement est plus leve chez les jeunes enfants; ensuite, elle s'attnue pour rejoindre des valeurs adultes vers 16-19 ans et augmente de faon linaire en fonction de l'ge aprs 45 ans jusqu' redevenir leve vers 60 ans. De plus, la plus haute vlocit du tunnel, les plus jeunes participants autistes ont manifest significativement moins de ractivit posturale comparativement leurs contrles; cette diffrence n'tait pas prsente chez des participants plus gs (16-33 ans). Enfin, les enfants ayant subi un TCC lger, et qui taient initialement modrment symptomatiques, ont montr un niveau plus lev d'instabilit posturale induite visuellement que les contrles, et ce jusqu' 12 semaines post-trauma malgr le fait que la majorit d'entre eux (89%) n'taient plus symptomatiques ce stade. En somme, cela suggre la prsence d'une importante priode de transition dans la maturation des systmes sous-tendant l'intgration sensorimotrice implique dans le contrle postural vers l'ge de 16 ans, et d'autres changements sensorimoteurs vers l'ge de 60 ans; cette sur-dpendance visuelle pour la rgulation posturale chez les enfants et les ans pourrait guider l'amnagement d'espaces et l'laboration d'activits ajusts l'ge des individus. De plus, le fait que l'hypo-ractivit posturale aux informations visuelles chez les autistes dpende des caractristiques de l'environnement visuel et de l'ge chronologique, affine notre comprhension des anomalies sensorielles propres l'autisme. Par ailleurs, le fait que les enfants ayant subi un TCC lger montrent des anomalies posturales jusqu' 3 mois post-trauma, malgr une diminution significative des symptmes rapports, pourrait tre reli une altration du traitement de l'information visuelle dynamique et pourrait avoir des implications quant la gestion clinique des patients aux prises avec un TCC lger, puisque la rsolution des symptmes est actuellement le principal critre utilis pour la prise de dcision quant au retour aux activits. Enfin, les rsultats obtenus chez une population dveloppement atypique (autisme) et une population avec atteinte neurologique dite transitoire (TCC lger), contribuent non seulement une meilleure comprhension des mcanismes d'intgration sensorimotrice sous-tendant le contrle postural mais pourraient aussi servir comme marqueurs sensibles et spcifiques de dysfonction chez ces populations. Mots-cls : posture, quilibre, vision, dveloppement/vieillissement sensorimoteur, autisme, TCC lger symptomatique, ralit virtuelle.
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La vaccination ADN laide de plasmides codant pour des autoantignes sest avre efficace dans la protection contre plusieurs maladies auto-immunes. Le but de ce mmoire tait dans un premier temps dtablir si un protocole de vaccination ADN compos de 3 injections de pCMV-CTLA-4-NP et de pVR-IL-12 deux semaines dintervalle avait un effet protecteur contre le dveloppement dune hpatite auto-immune chez la souris TTR-NP, un modle murin transgnique de la maladie et prcdemment dvelopp au laboratoire. Dans un deuxime temps, le but tait dlucider, le cas chant, les mcanismes sous-tendant la protection confre par la vaccination ADN. Les hypothses initiales taient quune protection allait effectivement tre confre par la vaccination ADN et que celle-ci pouvait tre attribuable une dviation de la rponse typiquement Th1 de la maladie vers une rponse Th2, un puisement des cellules immunitaires et/ou lactivation et linduction de prolifration de cellules rgulatrices. Les rsultats montrent que la vaccination ADN induit une protection transitoire contre le dveloppement dinfiltrations lymphocytaires au foie. Cette protection se ferait via un puisement des cellules CD4+, CD8+ et CD19+ se retrouvant la rate et exprimant PD 1 dans une plus forte proportion 3 mois, et ne serait mdie ni par les lymphocytes T rgulateurs CD4+CD25+FoxP3+, ni par les cellules CD8+FoxP3+. Une dviation de la rponse Th1 vers une rponse Th2 demeure une explication supplmentaire plausible la protection confre mais ncessiterait une caractrisation en situation plus physiologique avant de pouvoir infrer sur son implication relle. La vaccination ADN ninflue ni sur la prsence dautoanticorps, ni sur les niveaux dalanine aminotransfrase, deux marqueurs de la maladie.
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Les dyskinsies tardives (DT) sont des troubles moteurs associs lutilisation chronique des antagonistes des rcepteurs dopaminergiques D2 tels que les antipsychotiques et le mtoclopramide. Ces dyskinsies correspondent une incoordination motrice portant prfrentiellement sur la musculature oro-faciale. La gestion des DT s'est impose comme dfi de sant publique surtout en labsence dune alternative thrapeutique efficace et abordable. Lhypothse classiquement avance pour expliquer la physiopathologie des DT inhrente au traitement par les antipsychotiques sarticule autour de lhypersensibilit des rcepteurs dopaminergiques D2, cibles principales de ces molcules. Nanmoins, plusieurs donnes remettent la vracit de cette hypothse en question. Hypothse: nous proposons que le blocage chronique des rcepteurs dopaminergiques soit effectivement responsable dun phnomne dhypersensibilisation mais contrairement lhypothse classique, cette hypersensibilisation porterait sur des paramtres de la transmission dopaminergique autres que les rcepteurs D2. De mme nous postulons que cette hypersensibilisation se traduirait par des altrations des cascades signaltiques au niveau des cellules du striatum. Ces altrations aboutissent des changements portant sur le rcepteur nuclaire (Nur77), qui est hautement associ au systme dopaminergique; linduction de ces rcepteurs dclencherait des cascades associes la compensation ou la gense des DT. Matriels et mthodes: 23 femelles Cebus apella, rparties en 3 groupes: groupe halopridol, groupe clozapine, et groupe contrle, ont t exposes aux traitements respectifs pendant 6-36 mois. Aprs lanalyse comportementale, les animaux ont t dcapits et leurs cerveaux isols pour fin danalyse. Hybridation in situ: nous avons fait appel cette technique pour mesurer lexpression de lARNm de Nur77 et du neuropeptide enkphaline. Hybridation in situ double: nous avons exploits cette technique pour identifier les populations neuronales exprimant les rcepteurs dopaminergiques D3 et localiser leur ventuelle induction. Autoradiographies des rcepteurs dopaminergiques D1, D2 et D3 et autoradiographies des rcepteurs i glutamatergiques mGluR5. Ces autoradiographies avaient pour objectif dvaluer lexpression de ces diffrents rcepteurs. Mutagense dirige et transfection cellulaire: nous faisons appel ces techniques pour reproduire le polymorphisme identifi au niveau de la rgion 3UTR de lARNm Nur77 et valuer limpact que pourrait avoir ce polymorphisme sur la stabilit de lARNm Nur77 sinon sur lexpression de la protine Nur77. Western Blot des kinases ERK 1 et 2: cette technique nous a servi comme moyen pour quantifier lexpression globale de ces kinases. Analyses statistiques: lexpression de lARNm Nur77 a t value en utilisant lanalyse de la variance un seul facteur (One way ANOVA). Nous avons procd de la mme faon pour mesurer lexpression des rcepteurs D2, D3 et mGluR5. Rsultats: le groupe des animaux traits par lhalopridol montre une plus forte expression des rcepteurs D3 par rapport aux sujets des autres groupes. Cette expression se produit au niveau des neurones de la voie directe. De plus, cette augmentation corrle positivement avec la svrit des DT. Lexpression des rcepteurs D2 et mGluR5 reste relativement inchange entre les diffrents groupes, alors quun gradient dexpression a t observ pour le rcepteur D1. Par ailleurs, Nur77 est induit par lhalopridol, alors que son expression semble baisser chez les animaux traits par la clozapine. Linduction de lexpression de Nur77 par lhalopridol est plus accrue chez les animaux non dyskintiques. Les animaux traits par la clozapine dmontrent une expression amoindrie de lARNm de Nur77 qui tend tre plus faible que lexpression de base. Dautre part, la prsence du polymorphisme au niveau de la rgion 3UTR semble affecter lexpression cellulaire de Nur77. Conclusion: ces rsultats confortent notre hypothse concernant lexistence dun phnomne dhypersensibilisation prenant place suite un traitement chronique par les antipsychotiques. Ce phnomne sest traduit par une augmentation de lexpression des rcepteurs D3 sans porter sur les rcepteurs D2 tel que prn classiquement. Cette hypersensibilisation des rcepteurs D3 implique galement lexistence dun dbalancement des voies striatales pouvant ainsi sous tendre lapparition des DT. Ces rsultats dvoilent ainsi un nouveau mcanisme qui pourrait contribuer lapparition des DT et pourraient permettre une meilleure gestion, nous lesprons, des DT lchelle clinique.
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Une comprehension profonde de la separation de charge a lheterojonction de semi-con- ducteurs organiques est necessaire pour le developpement de diodes photovoltaiques organiques plus efficaces, ce qui serait une grande avancee pour repondre aux besoins mondiaux en energie durable. Lobjectif de cette these est de decrire les processus impliques dans la separation de charges a heterojonctions de semi-conducteurs organiques, en prenant en exemple le cas particulier du PCDTBT: PCBM. Nous sondons les excitations dinterface a laide de methodes spectroscopiques resolues en temps couvrant des echelles de temps de 100 femto- secondes a 1 milliseconde. Ces principales methodes spectroscopiques sont la spectroscopie Raman stimulee femtoseconde, la fluorescence resolue en temps et labsorption transitoire. Nos resultats montrent clairement que le transfert de charge du PCDTBT au PCBM a lieu avant que lexciton ne soit relaxe et localise, un fait experimental irreconciliable avec la theorie de Marcus semi-classique. La paire de charges qui est creee se divise en deux categories : les paires de polarons geminales non piegees et les paires profondement piegees. Les premiers se relaxent rapidement vers lexciton a transfert de charge, qui se recombine radiativement avec une constante de temps de 1 2 nanoseconde, alors que les seconds se relaxent sur de plus longues echelles de temps via leffet tunnel. Notre modele photophysique quantitatif demontre que 2 % de lexcitation creee ne peut jamais se dissocier en porteurs de charge libre, un chiffre qui est en accord avec les rendements eleves rapportes pour ce type de systeme.
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Escherichia coli est un agent de mammites environnementales. Par contre, E. coli peut persister dans la glande mammaire. Les objectifs de cette tude taient de confirmer la prsence dinfection persistante chez des vaches laitires canadiennes et didentifier la possibilit de contagion entre les quartiers dune vache dans une cohorte de 91 fermes suivies durant deux ans. De plus, les souches persistantes ont t compares des souches transitoires. Les profils gntiques ont t obtenus laide de llectrophorse sur gel en champs pulss. La dtection de la rsistance pour sept antibiotiques sest faite par microdilution. Vingt-sept gnes de virulence ont t dtermins par hybridation sur colonies. De la persistance a t dtecte chez 18 vaches et de la contagion entre quartiers, chez deux vaches. La proportion de rsistance chez les E. coli persistants tait de 0,0 % (enrofloxacin) 27,8 % (ampicilline et ttracycline) et de 0,0 % (enrofloxacin) 16,8 % (ttracycline) pour les E. coli transitoires. Pour chacune des rsistances additionnelles, les probabilits dtre une souche persistante augmentaient par un facteur 1,6 (95% IC : 1.1, 2.4). Une souche rsistante lampicilline et la cphalothine avait une plus forte probabilit dtre persistante. Une souche possdant le gne iroN avait 5.4 fois plus de probabilit (95% IC: 1.2, 24.0) dtre persistante. Aussi, une souche positive pour le gne sitA avait 8.6 fois plus de probabilit (95% IC: 2.8, 27.1) dtre persistante. En conclusion, cette tude confirme quE. coli peut persister dans la glande mammaire des vaches laitires canadiennes et que ces E. coli sont diffrents de ceux impliqus lors dinfection transitoire.
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Loestradiol joue un rle important dans la reproduction en gnral, particulirement dans la croissance folliculaire chez la vache. La production de lstradiol ncessite lexpression du gne CYP19A1 suite la stimulation des cellules de granulosa par lhormone folliculostimulante (FSH) ou le facteur de croissance insulinique de type 1 (IGF-1). Chez la vache, il existe six promoteurs (1.1 ; 1.2 ; 1.3 ; 1.4 ; 1.5 et 2) qui dirigent la transcription du gne CYP19A1 dans les cellules de la granulosa. Le principal promoteur qui dirige la transcription au niveau de lovaire (cellules de granulosa) est le promoteur 2 (P2). Cependant, leffet de la FSH et de lIGF-1 sur lactivation de ces promoteurs daromatase demeure mal connu. De plus, la demi-vie du transcrit CYP19A1 est trs courte avec une rgion 3UTR relativement longue. Lanalyse de la squence 3UTR montre la prsence des motifs ARE (squence riche en AU), des tudes antrieur montrent que ces squences impliquent dans la rgulation de la stabilit ou la dgradation de lARNm, ce qui est fort probable que la courte demi-vie de lARNm CYP19A1 est sous le contrle post-transcriptionel. Lobjectif de la thse visait tudier la rgulation de lexpression du gne CYP19A1 chez la vache. Il y a deux thmes soit tude de la rgulation transcriptionnelle ciblant le promoteur et soit tude de la rgulation post-transcriptionnelle impliquant la rgion 3non traduite (3UTR). Le premier objectif vise tudier la rgulation transcriptionnelle du gne CYP19A1. Nous avons tudi l'activit du promoteur ovarien bovin dans deux modles de cellules de la granulosa, les cellules lutinises et nonlutinises in vitro, suite une stimulation des cellules par la FSH ou IGF-1. Nous avons galement valu la voie de signalisation implique dans la rgulation des diffrents promoteurs en utilisant un RT-PCR et un gne rapporteur (les diffrents promoteurs daromatase ont t insrs dans le vecteur pGL3promoter en amont du gne exprimant la lucifrase). Les rsultats de RT-PCR dmontrent que la FSH et lIGF-1 augmentent les concentrations dARNm provenant des deux promoteurs 2 et 1.1 dans les cellules de la granulosa non lutinises. Des expriences subsquentes ont montr que la FSH stimule le promoteur 2 via la voie PKA tandis que l'IGF-1 stimule le promoteur 2 via la voie PKC. La FSH et lIGF-1 stimulent lexpression du promoteur 1.1 via la voie PI3K. Lanalyse de lactivit lucifrase dmontre que dans les cellules de granulosa lutinises, la FSH stimule le promoteur 1.1 de faon dose dpendante et ne semble y avoir aucun effet significatif sur le promoteur 2. Nous avons donc compar lactivit du promoteur PII/P2 humain, du rat, de la chvre et de la vache dans les cellules de granulosa bovine lutinises. Le rsultat le plus significatif est que le promoteur 2 bovine (et caprine) dpend de plusieurs facteurs de transcription (NR5A2, FOXL2) compar au promoteur PII humain et celui du promoteur proximal du rat qui dpendent principalement de l'AMPc. En effet, nos rsultats ont dmontr une expression raisonnablement robuste du P2 bovine lorsque les cellules sont traites la forskoline, NR5A2 et FOXL2. Le facteur FOXL2 semble dterminer l'activit du promoteur 2 chez le ruminant. Le deuxime objectif vise tudier la rgulation post-transcriptionnelle du gne CYP19A1. Pour ce faire, nous avons dtermin la squence minimale de l'ARNm CYP19A1 requise pour la rgulation de sa demi-vie. Diffrents squences de la rgion 3UTR ont t insrs dans le vecteur pGL3promoter en aval du gne exprimant la lucifrase ou soit dans le vecteur pGEMTeasy. Le vecteur pGL3promoter a t transfect dans les cellules de granulosa lutinises pour valuer l'impact de la squence 3'UTR sur l'expression du gne rapporteur de la lucifrase, alors que le vecteur pGEMTeasy a t utilis pour la transcription in vitro afin de gnrer de lARNm. Ce dernier sera utilis en raction croise au UV avec des extraits protiques pour dmontrer lassociation du complexe ARNm/protine. Lanalyse de lactivit lucifrase a permis didentifier une squence de 200 pb situe entre 926 et 1134 pb de la rgion 3'UTR de lARNm CYP19A1 qui a rduit significativement lactivit de la lucifrase. Selon les analyses de la raction croise au UV, une ou plusieurs protines de 66 et 80 kDA se lient spcifiquement la squence de 200 pb qui rduit lactivit de lucifrase. Cette protine s'exprime dans les cellules de granulosa, mais na pas t dtecte dans d'autres tissus comme le foie et le cur. Par ailleurs, lutilisation du gne rapporteur sensible la FSH a suscit lintrt d'une compagnie pharmaceutique qui vend de lequine chorionic gonadotropin (eCG) pour lui permettre de distinguer facilement leCG ayant une forte activit FSH et donc, avoir un produit commercial plus efficace et de meilleure qualit. Dans cette tude, nous avons dvelopp un systme de bioessai la FSH bas sur la transfection des cellules avec un rcepteur la FSH et un gne rapporteur colorimtrique qui permet destimer lactivit de la FSH dans le srum de la jument et qui pourrait tre applicable au niveau de la ferme/industrie.
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L'arthrose est une maladie articulaire dgnrative, avec une pathogense inconnue. Des tudes rcentes suggrent que l'activation du facteur de transcription du rcepteur activateur de la prolifration des peroxysomes (PPAR) gamma est une cible thrapeutique pour ce maladie. Les agonistes du PPAR inhibent l'inflammation et rduisent la synthse des produits de dgradation du cartilage in vitro et in vivo. Cependant, des tudes utilisant des agonistes du PPAR nlucident pas les effets exacts mdis par ce gne complexe. En effet, certains de ces agonistes ont la capacit de rgulariser d'autres voies de signalisation indpendantes de PPAR, ainsi entranant des effets secondaires graves. Afin d'obtenir une efficacit thrapeutique avec potentiellement moins de problmes de scurit, il est donc essentiel d'lucider, in vivo, le rle exact de PPAR dans la physiopathologie OA. Mon projet de thse permettra de dterminer, pour la premire fois, le rle spcifique de PPAR in vivo dans la physiopathologie OA. Les souris utilises pour ltude avaient une dltion conditionnelle du gne PPAR dans le cartilage. Ces dernires ont t gnres en employant le systme LoxP/Cre. Pour tester cette hypothse, j'ai gnr deux types de souris avec une dltion au PPAR, (a) une suppression du gne PPAR spcifiquement dans le cartilage germinale pour l'tude de l'arthrose lie au dveloppement et l'ge et (b) la suppression inductible du gne PPAR spcifiquement dans le cartilage chez la souris adulte pour les tudes OA. Ltude prcdente dans notre laboratoire, utilisant ces souris ayant une dltion au gne PPAR germinales, montre que ces souris prsentent des anomalies du dveloppement du cartilage. J'ai galement explor si ces souris qui prsentent des dfauts prcoces du dveloppement ont toutes les modifications phnotypiques dans le cartilage au cours du vieillissement. Mes rsultats ont montr que les souris adultes, ayant une dltion au gne PPAR, ont prsenter un phnotype de l'arthrose spontane associe une dgradation du cartilage, lhypocellularit, la fibrose synoviale. Cette tude a montr que PPAR est un rgulateur essentiel pour le cartilage, et cest le manque (labsence) de ce dernier qui conduit un phnotype de l'arthrose spontane acclre (American Journal of Pathologie). A partir de ce but de l'tude, on na pas pu vrifier si ces souris prsentaient lOA spontane en raison des dfauts de dveloppement ou la suite de la dltion du gne PPAR. Pour contourner les dfauts de dveloppement, j'ai gnr des souris ayant une dltion du gne PPAR spcifiquement dans le cartilage inductible avec le systme Col2rTACre. Ces souris ont t soumises modle de la chirurgie OA (DMM: dstabilisation du mnisque mdial) et les rsultats rvlent que les souris PPAR KO ont une dgradation acclre du cartilage, une hypocellularit, une fibrose synoviale et une augmentation de l'expression des marqueurs cataboliques et des marqueurs inflammatoire. La perte de PPAR dans le cartilage articulaire est un vnement critique qui initie la dgradation de cartilage dans OA. Les tudes rcentes suggrent que le procs dautophagie, une forme de survie cellulaire programme, est altr pendant lOA et peut contribuer vers une protection diminue des cellules, rsultant la dgradation du cartilage. Jai donc explor le rle de PPAR dans la protection des cellules en dterminant leffet de manque de PPAR dans le cartilage par lexpression de mTOR (rgulateur ngatif principal dautophagie) et les gnes dautophagie durant OA. Mes rsultats ont montr que les souris KO PPAR prsentent galement une augmentation sur l'expression de mTOR et une diminution sur lexpression des marqueurs autophagiques en comparaison avec les chondrocytes articulaires isols des souris contrles OA. J'ai suggr l'hypothse que PPAR contrle la rgulation de la signalisation de mTOR/autophagie, et finalement la mort des chondrocytes et lexpression des facteurs cataboliques et les facteurs inflammatoire. Pour tester cette hypothse, jai fait la transfection des chondrocytes arthrosiques PPAR-KO avec le vecteur dexpression de PPAR pour dterminer si la restauration de l'expression de PPAR peut sauver le phnotype des cellules PPAR-KO OA. J'ai observ que la restauration de l'expression de PPAR dans les cellules PPAR-KO en prsence du vecteur d'expression PPAR, a pu considrablement rgulariser ngativement l'expression de mTOR et mettre en rgle positivement l'expression des gnes autophagiques ainsi que le sauvetage significative de l'expression du collagne de type II et laggrecan et de baisser de manire significative l'expression de marqueurs cataboliques critiques et des marqueurs inflammatoires. Pour prouver que laugmentation de la signalisation de mTOR et la diminution de l'autophagie est responsable du phnotype OA acclre observe dans les souris PPAR KO in vivo, j'ai gnr les souris doubles KO PPAR- mTOR inductible spcifique du cartilage en utilisant le systme Col2 - rtTA -Cre et soumis ces souris DMM modle de l'arthrose. Mes rsultants dmontrent que les souris avec PPAR- mTOR doubles KO ont t significativement protgs contre les OA DMM induites associes une protection significative contre la destruction du cartilage, la perte de protoglycanes et la perte de chondro-cellularit par rapport aux souris tmoins. Considrant que mTOR est un rpresseur majeur de l'autophagie, j'ai trouv que l'expression de deux marqueurs de l'autophagie critiques (ULK1 et LC3B) a t significativement plus leve dans les chondrocytes extraits les souris doubles KO PPAR-mTOR par rapport aux souris tmoins. En plus, les tudes de sauvetage in vitro en utilisant le vecteur d'expression PPAR et les tudes in vivo utilisant les souris doubles KO PPAR- mTOR montrent que PPAR est impliqu dans la rgulation de la protine signalant de mTOR/autophagie dans le cartilage articulaire. Ces rsultats contournent PPAR et sa signalisation en aval de mTOR/autophagie en tant que cibles thrapeutiques potentielles pour le traitement de l'arthrose.
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Le fichier vido en format .avi accompagne mon document et correspond l'annexe II. C'est une vidomicroscopie dont la lgende est mise en annexe II.
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Le diabte est une maladie chronique dont la principale caractristique est un niveau plasmatique lev de glucose, qui est caus soit par un dfaut dans la production dinsuline, laction de linsuline, ou les deux la fois. Plusieurs tudes ont dmontr que lhyperglycmie chronique peut mener la dysfonction et mme la dfaillance de plusieurs organes, dont le coeur, le systme vasculaire, les yeux et les reins, se traduisant par des infarctus du myocarde, des accidents crbro-vasculaires et des complications rtinales et rnales, respectivement. La nphropathie diabtique (DN) est la principale cause de dficience rnale et affecte prs de 25-40% des patients diabtiques. La DN est invariablement associe un risque lev daccident crbrovasculaire et de dysfonction cardivasculaire. Langiotensinogne (Agt) est lunique prcurseur de tous les types dangiotensines. En plus du systme rnine-angiotensine (RAS) sytmique, le rein possde son propre systme intrarnal et exprime tous les composants du RAS. LAgt est fortement exprim dans les cellules du tubule proximal rnal (RPTC) et y est converti en angiotensine II (AngII), le peptide biologiquement actif du RAS. Les patients diabtiques prsentent de hauts niveaux dAngII et une augmentation de lexpression des gnes du RAS, suggrant que lactivation du RAS intrarnal joue un rle important dans la progression de la DN. Les mcanismes qui contrlent la rgulation du niveau rnal dAgt par lhyperglycmie et linsuline demeurent mal compris. Le but global de cette thse est de mieux comprendre les mcanismes molculaires qui contrlent lexpression du gne Agt chez la souris Akita (un modle murin de diabte de type 1). Dans cette optique, la premire partie de la thse se concentre sur deux facteurs de transcription de la famille des ribonucloprotines nuclaires htrognes (hnRNP). Chan et collaborateurs ont dj identifi 2 protines nuclaires hnRNP F et hnRNP K, de 48kD et 70kD respectivement. HnRNP F et hnRNP K forment un htrodimre et se lient llment de rponse linsuline (IRE) prsent dans le promoteur du gne Agt du rat et inhibent la transcription du gne Agt in vitro. Afin de dterminer si hnRNP F / K sont responsables de linhibition de lexpression rnale de Agt par linsuline in vivo, nous avons tudi des souris Akita males traits ou non avec des implants dinsuline pour une priode de 4 semaines. Des souris non-Akita males ont t employes comme contrles. Les souris Akita dveloppent de lhypertension et de lhypertrophie rnale. Le traitement linsuline rtablit les niveaux de glucose plasmatiques et la pression systolique (SBP), et attnue lhypertrophie rnale, lalbuminurie (ratio albumine/cratinine urinaire, ACR) et les niveaux urinaires dAgt et AngII chez les souris Akita. De plus, le traitement linsuline inhibe lexpression rnale du gne Agt, tout en augmentant lexpression des gnes hnRNP F, hnRNP K et ACE2 (enzyme de conversion de langiotensine-2). Dans des RPTC in vitro, linsuline inhibe Agt, mais stimule lexpression de hnRNP F et hnRNP K en prsence de hautes concentrations de glucose, et ce via la voie de signalisation MAPK p44/42 (protine kinase active par un mitogne). La transfection avec des petits ARN interfrents (siRNA) contre hnRNP F et hnRNP K prvient linhibition de lexpression dAgt par linsuline dans les RPTC. Cette tude dmontre bien que linsuline prvient lhypertension et attnue les dommages rnaux observs chez les souris Akita diabtiques, en partie grce la suppression de la transcription rnale de Agt, via une augmentation de lexpression de hnRNP F et hnRNP K. La seconde partie de cette thse change de focus et se tourne vers le facteur Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2). Nrf2 est un facteur de transcription qui contrle les gnes de la rponse antioxydante cellulaire en rponse au stress oxydant ou aux lectrophiles. Le but de cette tude est dexaminer limpact de la surexpression de la catalase (Cat) dans les RPTC sur lexpression du gne Agt via Nrf2 et sur le dveloppement de lhypertension et des dommages rnaux rsultants chez les souris diabtiques Akita transgniques (Tg). Nos tudes ont dmontr que la surexpression de Cat dans les souris Akita Cat-Tg normalise la SBP, attnue les dommages rnaux et inhibe lexpression des gnes Nrf2 et Agt dans les RPTC. In vitro, le glucose lev (HG) et loltipraz (un activateur de Nrf2) stimulent lexpression de Nrf2 et Agt, et cet effet peut tre bloqu par la trigonelline (inhibiteur de Nrf2), des siRNA contre Nrf2, des antioxydants ou des inhibiteurs pharmacologiques NF-B et MAPK p38. La suppression de sites de rponse Nrf2 prsents dans le promoteur du gne Agt du rat abolit la stimulation par loltipraz. Finalement, des souris males adultes non-transgniques traites avec loltipraz montrent une augmentation de lexpression de Nrf2 et Agt dans leurs RPTC et cette augmentation peut tre normalise par la trigonelline. Ces donnes permettent didentifier un nouveau mcanisme daction de Nrf2, par la stimulation du gne Agt intrarnal et lactivation du RAS, qui induisent lhypertension et les dommages rnaux par le glucose lev et les espces ractives de loxygne chez les souris diabtiques. Nos conclusions permettent de dmontrer que linsuline induit lexpression de hnRNP F et hnRNP K, qui jouent ensuite un rle protecteur en prvenant lhypertension. La surexpression de la catalase dans les RPTC vient quant elle attnuer lactivation de Nrf2 et ainsi rduit la SBP chez les souris Akita.
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lintrieur de la cellule sillonnent dinnombrables molcules, certaines par diffusion et dautres sur des routes molculaires phmres, empruntes selon les directives spcifiques de protines responsables du trafic intracellulaire. Parmi celles-ci, on compte les sorting nexins, qui dterminent le sort de plusieurs types de protine, comme les rcepteurs, en les guidant soit vers des voies de dgradation ou de recyclage. ce jour, il existe 33 membres des sorting nexins (Snx1-33), tous munies du domaine PX (PHOX-homology). Le domaine PX confre aux sorting nexins la capacit de dtecter la prsence de phosphatidylinositol phosphates (PIP), sur la surface des membranes lipidiques (ex : membrane cytoplasmique ou vsiculaire). Ces PIPs, produits de faon spcifique et transitoire, recrutent des protines ncessaires la progression de processus cellulaires. Par exemple, lorsquun rcepteur est internalis par endocytose, la rgion avoisinante de la membrane cytoplasmique devient occupe par PI(4,5)P2. Ceci engendre le recrutement de SNX9, qui permet la progression de lendocytose en faisant un lien entre le cytoskelette et le complexe dendocytose. Les recherches exposes dans cette thse sont une description fonctionnelle de deux sorting nexins peux connues, Snx11 et Snx30. Le rle de chacun de ces gnes a t tudi durant lembryogense de la grenouille (Xenopus laevis). Suite aux rsultats in vivo, une approche biomolculaire et de culture cellulaire a t employe pour approfondir nos connaissances. Cet ouvrage dmontre que Snx11 est impliqu dans le dveloppement des somites et dans la polymrisation de lactine. De plus, Snx11 semble influencer le recyclage de rcepteurs membranaires indpendamment de lactine. Ainsi, Snx11 pourrait jouer deux rles intracellulaires : une rgulation actine-dpendante du milieu extracellulaire et le triage de rcepteurs actine-indpendant. De son ct, Snx30 est impliqu dans la diffrentiation cardiaque prcoce par linhibition de la voie Wnt/-catenin, une tape ncessaire lengagement dune population de cellules du msoderme la lign cardiaque. Lexpression de Snx30 chez le Xnope concide avec cette priode critique de spcification du msoderme et le knockdown suscite des malformations cardiaques ainsi qu dautres tissus drivs du msoderme et de lendoderme. Cet ouvrage fournit une base pour des tudes futures sur Snx11 et Snx30. Ces protines ont un impact subtil sur des voies de signalisation spcifiques. Ces caractristiques pourraient tre exploites des fins thrapeutiques puisque leffet dune interfrence avec leurs fonctions pourrait tre suffisant pour rtablir un dsquilibre cellulaire pathologique tout en minimisant les effets secondaires.
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De nombreux travailleurs sont exposs aux hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP). Le benzo(a)pyrne (BaP) fait partie de ce groupe de polluants. Cette substance a t classe cancrogne reconnu chez lhumain. Pour valuer l'exposition aux HAP cancrognes, plusieurs chercheurs ont propos dutiliser la mesure du 3-hydroxybenzo(a)pyrne (3-OHBaP) dans lurine des travailleurs exposs. Dans le cadre du prsent projet, deux approches de modlisation ont t dveloppes et appliques pour permettre une meilleure comprhension de la toxicocintique du BaP et son biomarqueur dintrt actuel, le 3-OHBaP, et pour aider interprter les rsultats de surveillance biologique. Un modle toxicocintique plusieurs compartiments a t dvelopp sur la base des donnes pralablement obtenues sur le rat par notre groupe. Selon le modle, le BaP inject par voie intraveineuse est rapidement distribu du sang vers les tissus (t 4 h), avec une affinit particulire pour les poumons et les composantes lipidiques des tissus. Le BaP est ensuite distribu vers la peau et le foie. Au foie, le BaP est promptement mtabolis et le 3-OHBaP est form avec une demi-vie de 3 h. Le mtabolisme pulmonaire du BaP a galement t pris en compte, mais sa contribution la cintique globale du BaP a t juge ngligeable. Une fois form, le 3-OHBaP est distribu vers les diffrents organes presque aussi rapidement que la molcule mre (t 2 h). Le profil temporel du 3-OHBaP dans le rein montre une accumulation transitoire en raison de la diffrence observe entre le taux dentre (t = 28 min) et le taux de sortie (t = 4,5 h). La clairance totale de 3-OHBaP du corps est principalement gouverne par le taux de transfert de la bile vers le tractus gastro-intestinal (t 4 h). Le modle toxicocintique plusieurs compartiments a russi simuler un ensemble indpendant de profils urinaires publis sur le 3-OHBaP. Ce modle toxicocintique compartiments s'est avr utile pour la determination des facteurs biologiques dterminants de la cintique du BaP et du 3-OHBaP. Par la suite, un modle pharmacocintique base physiologique (PCBP) reproduisant le devenir du BaP et du 3-OHBaP chez le rat a t construit. Les organes (ou tissus) reprsents comme des compartiments ont t choisis en fonction de donnes exprimentales obtenues in vivo chez le rat. Les coefficients de partition, les coefficients de permabilit, les taux de mtabolisation, les paramtres d'excrtion, les fractions absorbes et les taux d'absorption pour diffrentes voies dexposition ont t obtenus directement partir des profils sanguins, tissulaires, urinaires et fcaux du BaP et du 3-OHBaP. Les valeurs de ces derniers paramtres ont t calcules par des procdures Monte-Carlo. Des analyses de sensibilit ont ensuite t ralises pour sassurer de la stabilit du modle et pour tablir les paramtres les plus sensibles de la cintique globale. Cette modlisation a permis didentifier les facteurs dterminants de la cintique: 1) la sensibilit leve des paramtres de la mtabolisation hpatique du BaP et du 3-OHBaP ainsi que du taux d'limination; 2) la forte distribution du BaP dans les poumons par rapport d'autres tissus; 3) la distribution considrable du BaP dans les tissus adipeux et le foie; 4) la forte distribution du 3-OHBaP dans les reins; 5) le transfert limit du BaP par la diffusion tissulaire dans les poumons; 6) le transfert limit du 3-OHBaP par la diffusion tissulaire dans les poumons, les tissus adipeux et les reins; 7) la recirculation entro-hpatique significative du 3-OHBaP. Suite des analyses de qualit des ajustements des quations du modle aux donnes observes, les probabilits que les simulations reproduisent les donnes exprimentales par pur hasard se sont avres toujours infrieures 10% pour les quatre voies dexposition : intraveineuse, orale, cutane et respiratoire. Nous avons extrapol les modles cintiques du rat lhumain afin de se doter dun outil permettant de reconstituer les doses absorbes chez des travailleurs exposs dans diverses industries partir de mesures de l'volution temporelle du 3-OHBaP dans leur urine. Les rsultats de ces modlisations ont ensuite t compars ceux de simulations obtenues avec un modle toxicocintique compartiment unique pour vrifier lutilit comparative dun modle simple et complexe. Les deux types de modle ont ainsi t construits partir de profils sanguins, tissulaires, urinaires et fcaux du BaP et du 3-OHBaP sur des rats exposs. Ces donnes ont t obtenues in vivo par voie intraveineuse, cutane, respiratoire et orale. Ensuite, les modles ont t extrapols lhumain en tenant compte des dterminants biologiques essentiels des diffrences cintiques entre le rat et lhumain. Les rsultats ont montr que l'inhalation n'tait pas la principale voie d'exposition pour plusieurs travailleurs tudis. Les valeurs de concentrations de BaP dans lair utilises afin de simuler les profils dexcrtion urinaire chez les travailleurs taient diffrentes des valeurs de concentrations de BaP mesures dans lair. Une exposition au BaP par voie cutane semblait mieux prdire les profils temporels observs. Finalement, les deux types de modlisation se sont avrs utiles pour reproduire et pour interprter les donnes disponibles chez des travailleurs.
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La moxonidine, un mdicament antihypertenseur sympatholytique de type imidazolinique, agit au niveau de la mdulla du tronc crbral pour diminuer la pression artrielle, suite lactivation slective du rcepteur aux imidazolines I1 (rcepteur I1, aussi nomm nischarine). Traitement avec de la moxonidine prvient le dveloppement de lhypertrophie du ventricule gauche chez des rats hypertendus (SHR), associ une diminution de la synthse et une lvation transitoire de la fragmentation dADN, des effets antiprolifratifs et apoptotiques. Ces effets se prsentent probablement chez les fibroblastes, car lapoptose des cardiomyocytes pourrait dtriorer la fonction cardiaque. Ces effets apparaissent aussi avec des doses non hypotensives de moxonidine, suggrant lexistence deffets cardiaques directes. Le rcepteur I1 se trouv aussi dans les tissus cardiaques; son activation ex vivo par la moxonidine stimule la libration de lANP, ce qui montre que les rcepteurs I1 cardiaques sont fonctionnels malgr labsence de stimulation centrale. Sur la base de ces informations, en plus du i) rle des peptides natriurtiques comme inhibiteurs de lapoptose cardiaque et ii) des tudes qui lient le rcepteur I1 avec la maintenance de la matrix extracellulaire, on propose que, part les effets sympatholytiques centrales, les rcepteurs I1 cardiaques peuvent contrler la croissance-mort cellulaire. Lactivation du rcepteur I1 peut retarder la progression des cardiopathies vers la dfaillance cardiaque, en inhibant des signaux mal adaptatifs de prolifration et apoptose. Des tudes ont t effectues pour : 1. Explorer les effets in vivo sur la structure et la fonction cardiaque suite au traitement avec moxonidine chez le SHR et le hamster cardiomyopathique. 2. Dfinir les voies de signalisation impliques dans les changements secondaires au traitement avec moxonidine, spcifiquement sur les marqueurs inflammatoires et les voies de signalisation rgulant la croissance et la survie cellulaire (MAPK et Akt). 3. Explorer les effets in vitro de la surexpression et lactivation du rcepteur I1 sur la survie cellulaire dans des cellules HEK293. 4. Rechercher la localisation, rgulation et implication dans la croissance-mort cellulaire du rcepteur I1 in vitro (cardiomyocytes et fibroblastes), en rponse aux stimuli associs au remodelage cardiaque : norpinephrine, cytokines (IL-1, TNF-) et oxydants (H2O2). Nos tudes dmontrent que la moxonidine, en doses hypotensives et non-hypotensives, amliore la structure et la performance cardiaque chez le SHR par des mcanismes impliquant linhibition des cytokines et des voies de signalisation p38 MAPK et Akt. Chez le hamster cardiomyopathique, la moxonidine amliore la fonction cardiaque, module la rponse inflammatoire/anti-inflammatoire et attnue la mort cellulaire et la fibrose cardiaque. Les cellules HEK293 surexprimant la nischarine survivent et prolifrent plus en rponse la moxonidine; cet effet est associ linhibition des voies ERK, JNK et p38 MAPK. La surexpression de la nischarine protge aussi de la mort cellulaire induite par le TNF-, lIL-1 et le H2O2. En outre, le rcepteur I1 sexprime dans les cardiomyocytes et fibroblastes, son activation inhibe la mort des cardiomyocytes et la prolifration des fibroblastes induite par la norpinephrine, par des effets diffrentiels sur les MAPK et lAkt. Dans des conditions inflammatoires, la moxonidine/rcepteur aux imidazolines I1 protge les cardiomyocytes et facilite llimination des myofibroblastes par des effets contraires sur JNK, p38 MAPK et iNOS. Ces tudes dmontrent le potentiel du rcepteur I1/nischarine comme cible anti-hypertrophique et anti-fibrose niveau cardiaque. Lidentification des mcanismes cardioprotecteurs de la nischarine peut amener au dveloppement des traitements bass sur la surexpression de la nischarine chez des patients avec hypertrophie ventriculaire. Finalement, mme si leffet antihypertenseur des agonistes du rcepteur I1 centraux est salutaire, le dveloppement de nouveaux agonistes cardioslectifs du rcepteur I1 pourrait donner des bnfices additionnels chez des patients non hypertendus.
