Evaluation of the effects of hyperbaric oxygen therapy for spinal cord lesion in correlation with the moment of intervention

Study design: Experimental, controlled, animal study. Objectives: To evaluate the functional effect of hyperbaric oxygen therapy administered shortly, one day after, and no intervention (control) in standardized experimental spinal cord lesions in Wistar rats. Setting: Sao Paulo, Brazil. Methods: In all, 30 Wistar rats with spinal cord lesions were divided into three groups: one group was submitted to hyperbaric oxygen therapy beginning half an hour after the lesion and with a total of 10 one-hour sessions, one session per day, at 2 atm; the second received the same treatment, but beginning on the day after the lesion; and the third received no treatment (control). The Basso, Beattie and Bresnahan scales were used for functional evaluation on the second day after the lesion and then weekly, until being killed 1 month later. Results: There were no significant differences between the groups in the functional analysis on the second day after the lesion. There was no functional difference comparing Groups 1 and 2 (treated shortly after or one day after) in any evaluation moment. On the 7th day, as well as on the 21st and 28th postoperative days, the evaluation showed that Groups 1 and 2 performed significantly better than the control group (receiving no therapy). Conclusion: Hyperbaric chamber therapy is beneficial in the functional recovery of spinal cord lesions in rats, if it is first administered just after spinal cord injury or within 24 h. Spinal Cord (2012) 50, 502-506; doi: 10.1038/sc.2012.16; published online 6 March 2012

Cell organisation, sulphur metabolism and ion transport-related genes are differentially expressed in Paracoccidioides brasiliensis mycelium and yeast cells

Abstract Background Mycelium-to-yeast transition in the human host is essential for pathogenicity by the fungus Paracoccidioides brasiliensis and both cell types are therefore critical to the establishment of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis endemic to Latin America. The infected population is of about 10 million individuals, 2% of whom will eventually develop the disease. Previously, transcriptome analysis of mycelium and yeast cells resulted in the assembly of 6,022 sequence groups. Gene expression analysis, using both in silico EST subtraction and cDNA microarray, revealed genes that were differential to yeast or mycelium, and we discussed those involved in sugar metabolism. To advance our understanding of molecular mechanisms of dimorphic transition, we performed an extended analysis of gene expression profiles using the methods mentioned above. Results In this work, continuous data mining revealed 66 new differentially expressed sequences that were MIPS(Munich Information Center for Protein Sequences)-categorised according to the cellular process in which they are presumably involved. Two well represented classes were chosen for further analysis: (i) control of cell organisation – cell wall, membrane and cytoskeleton, whose representatives were hex (encoding for a hexagonal peroxisome protein), bgl (encoding for a 1,3-β-glucosidase) in mycelium cells; and ags (an α-1,3-glucan synthase), cda (a chitin deacetylase) and vrp (a verprolin) in yeast cells; (ii) ion metabolism and transport – two genes putatively implicated in ion transport were confirmed to be highly expressed in mycelium cells – isc and ktp, respectively an iron-sulphur cluster-like protein and a cation transporter; and a putative P-type cation pump (pct) in yeast. Also, several enzymes from the cysteine de novo biosynthesis pathway were shown to be up regulated in the yeast form, including ATP sulphurylase, APS kinase and also PAPS reductase. Conclusion Taken together, these data show that several genes involved in cell organisation and ion metabolism/transport are expressed differentially along dimorphic transition. Hyper expression in yeast of the enzymes of sulphur metabolism reinforced that this metabolic pathway could be important for this process. Understanding these changes by functional analysis of such genes may lead to a better understanding of the infective process, thus providing new targets and strategies to control PCM.

Natural blood feeding and temperature shift modulate the global transcriptional profile of Rickettsia rickettsii infecting its tick vector

Rickettsia rickettsii is an obligate intracellular tick-borne bacterium that causes Rocky Mountain Spotted Fever (RMSF), the most lethal spotted fever rickettsiosis. When an infected starving tick begins blood feeding from a vertebrate host, R. rickettsii is exposed to a temperature elevation and to components in the blood meal. These two environmental stimuli have been previously associated with the reactivation of rickettsial virulence in ticks, but the factors responsible for this phenotype conversion have not been completely elucidated. Using customized oligonucleotide microarrays and high-throughput microfluidic qRT-PCR, we analyzed the effects of a 10 degrees C temperature elevation and of a blood meal on the transcriptional profile of R. rickettsii infecting the tick Amblyomma aureolatum. This is the first study of the transcriptome of a bacterium in the genus Rickettsia infecting a natural tick vector. Although both stimuli significantly increased bacterial load, blood feeding had a greater effect, modulating five-fold more genes than the temperature upshift. Certain components of the Type IV Secretion System (T4SS) were up-regulated by blood feeding. This suggests that this important bacterial transport system may be utilized to secrete effectors during the tick vector's blood meal. Blood feeding also up-regulated the expression of antioxidant enzymes, which might correspond to an attempt by R. rickettsii to protect itself against the deleterious effects of free radicals produced by fed ticks. The modulated genes identified in this study, including those encoding hypothetical proteins, require further functional analysis and may have potential as future targets for vaccine development.

Bcl-2-homologe Proteine aus dem Schwamm Geodia cydonium

'Bcl-2-homologe Proteine aus dem Schwamm Geodia cydonium: Klonierung, Charakterisierung und Funktionsanalyse von Apoptose-Regulatoren der Porifera'. Auf der Suche nach der molekularbiologischen Grundlage der Apoptose in den Porifera, dem phylogenetisch ältesten Metazoen-Tierstamm, wurden Mitglieder der apoptoseregulatorischen Bcl?2 Familie unter Anwendung diverser Techniken im Schwamm G. cydonium identifiziert: GCBHP1 und GCBHP2. Detaillierte Analysen offenbarten Bcl-2-charakteristische Signaturen sowie eine durch apoptotische Stimuli induzierbare Expression. Die parallele HSP70-Induktion zeugte von der GCBHP2-Expression als Teil einer antiapoptotischen Streßantwort zum Schutz des Organismus'. Die kontinuierliche Transkription des im Rahmen dieser Arbeit gleichfalls klonierten Proliferationsmarkers SEP1 veranschaulichte zudem die Effektivität dieser Streßreaktion. Mit der Herstellung eines rekombinanten Proteins und der Gewinnung eines Antiserums konnte auch die streßinduzierte Proteinexpression des GCBHP2 verfolgt werden. Zum Zweck der Funktionsstudie wurden Säugetierzellen (HEK-293, NIH/3T3) mit einem GCBHP2-Konstrukt stabil transfiziert und auf die Expression des Schwammproteins untersucht. Diese Zellen unterschieden sich bereits phänotypisch von mock-transfizierten Zellen. Immunzytochemische Untersuchungen enthüllten eine für antiapoptotische Bcl-2 Proteine charakteristische Assoziation mit Mitochondrien. Unter dem Einfluß zweier apoptotischer Stimuli wurde für GCBHP2-transfizierte Zellen eine vierzehn-/sechsmal höhere Vitalität und eine reduzierte Aktivierung der Caspase-Kaskade registriert (im Vergleich zu mock-transfizierten Kontrollen). Somit wurde der antiapoptotische Charakter des GCBHP2 und die Existenz apoptotischer Mechanismen in den Porifera bestätigt.

Expressions- und Funktionsanalysen von Neuroglobin und Cytoglobin

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden Untersuchungen zur Expression und Funktion der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Ngb) und Cytoglobin (Cygb) in Vertebraten durchgeführt. Beide Globine wurden erst kürzlich entdeckt, und ihre Funktionen konnten trotz vorliegender Daten zur Struktur und biochemischen Eigenschaften dieser Proteine bisher nicht eindeutig geklärt werden. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde die zelluläre und subzelluläre Lokalisation von Neuroglobin und Cytoglobin in murinen Gewebeschnitten untersucht. Die Expression von Ngb in neuronalen und endokrinen Geweben hängt offensichtlich mit den hohen metabolischen Aktivitäten dieser Organe zusammen. Insbesondere im Gehirn konnten regionale Unterschiede in der Ngb-Expression beobachtet werden. Dabei korrelierte eine besonders starke Neuroglobin-Expression mit Gehirnbereichen, die bekanntermaßen die höchsten Grundaktivitäten aufweisen. In Anbetracht dessen liegt die Funktion des Neuroglobins möglicherweise im basalen O2-Metabolismus dieser Gewebe, wobei Ngb als O2-Lieferant und kurzfristiger O2-Speicher den vergleichsweise hohen Sauerstoffbedarf vor Ort sicherstellen könnte. Weitere Funktionen in der Entgiftung von ROS bzw. RNS oder die kürzlich publizierte mögliche Rolle des Ngb bei der Verhinderung der Mitochondrien-vermittelten Apoptose durch eine Reduktion des freigesetzten Cytochrom c wären darüber hinaus denkbar. Die Cygb-Expression im Gehirn beschränkte sich auf relativ wenige Neurone in verschiedenen Gehirnbereichen und zeigte dort vorwiegend eine Co-Lokalisation mit der neuronalen NO-Synthase. Dieser Befund legt eine Funktion des Cytoglobins im NO-Metabolismus nahe. Quantitative RT-PCR-Experimente zur mRNA-Expression von Ngb und Cygb in alternden Säugern am Bsp. der Hamsterspezies Phodopus sungorus zeigten keine signifikanten Änderungen der mRNA-Mengen beider Globine in alten im Vergleich zu jungen Tieren. Dies widerspricht publizierten Daten, in denen bei der Maus anhand von Western Blot-Analysen eine Abnahme der Neuroglobin-Menge im Alter gezeigt wurde. Möglicherweise handelt es sich hierbei um speziesspezifische Differenzen. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte vergleichende Sequenzanalyse der humanen und murinen NGB/Ngb-Genregion liefert zum einen Hinweise auf die mögliche Regulation der Ngb-Expression und zum anderen eine wichtige Grundlage für die funktionellen Analysen dieses Gens. Es konnte ein minimaler Promotorbereich definiert werden, der zusammen mit einigen konservierten regulatorischen Elementen als Basis für experimentelle Untersuchungen der Promotoraktivität in Abhängigkeit von äußeren Einflüssen dienen wird. Bioinformatische Analysen führten zur Identifizierung des sog. „neuron restrictive silencer element“ (NRSE) im Ngb-Promotor, welches vermutlich für die vorwiegend neuronale Expression des Proteins verantwortlich ist. Die kontrovers diskutierte O2-abhängige Regulation der Ngb-Expression konnte hingegen anhand der durchgeführten komparativen Sequenzanalysen nicht bestätigt werden. Es wurden keine zwischen Mensch und Maus konservierten Bindestellen für den Transkriptionsfaktor HIF-1 identifiziert, der die Expression zahlreicher hypoxieregulierter Gene, z.B. Epo und VEGF, vermittelt. Zusammen mit den in vivo-Daten spricht dies eher gegen eine Regulation der Ngb-Expression bei verminderter Verfügbarkeit von Sauerstoff. Die Komplexität der Funktionen von Ngb und Cygb im O2-Stoffwechsel der Vertebraten macht den Einsatz muriner Modellsysteme unerlässlich, die eine sukzessive Aufklärung der Funktionen beider Proteine erlauben. Die vorliegende Arbeit liefert auch dazu einen wichtigen Beitrag. Die hergestellten „gene-targeting“-Vektorkonstrukte liefern in Verbindung mit den etablierten Nachweisverfahren zur Genotypisierung von embryonalen Stammzellen die Grundlage zur erfolgreichen Generierung von Ngb-knock out sowie Ngb- und Cygb-überexprimierenden transgenen Tieren. Diese werden für die endgültige Entschlüsselung funktionell relevanter Fragestellungen von enormer Bedeutung sein.

Finite-element discretization of 3D energy-transport equations for semiconductors

In this thesis a mathematical model was derived that describes the charge and energy transport in semiconductor devices like transistors. Moreover, numerical simulations of these physical processes are performed. In order to accomplish this, methods of theoretical physics, functional analysis, numerical mathematics and computer programming are applied. After an introduction to the status quo of semiconductor device simulation methods and a brief review of historical facts up to now, the attention is shifted to the construction of a model, which serves as the basis of the subsequent derivations in the thesis. Thereby the starting point is an important equation of the theory of dilute gases. From this equation the model equations are derived and specified by means of a series expansion method. This is done in a multi-stage derivation process, which is mainly taken from a scientific paper and which does not constitute the focus of this thesis. In the following phase we specify the mathematical setting and make precise the model assumptions. Thereby we make use of methods of functional analysis. Since the equations we deal with are coupled, we are concerned with a nonstandard problem. In contrary, the theory of scalar elliptic equations is established meanwhile. Subsequently, we are preoccupied with the numerical discretization of the equations. A special finite-element method is used for the discretization. This special approach has to be done in order to make the numerical results appropriate for practical application. By a series of transformations from the discrete model we derive a system of algebraic equations that are eligible for numerical evaluation. Using self-made computer programs we solve the equations to get approximate solutions. These programs are based on new and specialized iteration procedures that are developed and thoroughly tested within the frame of this research work. Due to their importance and their novel status, they are explained and demonstrated in detail. We compare these new iterations with a standard method that is complemented by a feature to fit in the current context. A further innovation is the computation of solutions in three-dimensional domains, which are still rare. Special attention is paid to applicability of the 3D simulation tools. The programs are designed to have justifiable working complexity. The simulation results of some models of contemporary semiconductor devices are shown and detailed comments on the results are given. Eventually, we make a prospect on future development and enhancements of the models and of the algorithms that we used.

Klonierung und Charakterisierung der Luziferase und des Luziferin regenerierenden Enzyms aus dem marinen Schwamm Suberites domuncula

Bereits 1971 erkannte Reiswig bei einigen Schwämmen in der Kontraktion des Osculums eine Reaktion auf Licht. Nachfolgend konnte für eine Reihe von Schwämmen die Existenz von Lichtreaktionen beobachtet werden (Wapstra & van Soest, 1987). In dieser Arbeit sollten Gene eines Luziferin/Luziferase Systems im marinen Schwamm Suberites domuncula identifiziert werden, die eine Rolle bei der Bio¬lumineszenz spielen. Mit Hilfe der PCR-Technik konnten die in der cDNA-Bank identifizierten Fragmente einer Luziferase und eines Luziferin regenerierenden Enzyms erfolgreich vervollständigt, kloniert und analysiert werden. Datenbank¬analysen der abgeleiteten Aminosäuresequenzen ergeben sowohl für die Luziferase als auch für das Luziferin regenerierende Enzym Ähnlichkeiten zu den entsprechenden Proteinen aus Leuchtkäfern, wie z. B. Photinus pyralis. Ausgehend von der cDNA wurden zunächst beide Enzyme in E. coli rekombinant exprimiert und affinitätschromatographisch aufgereinigt. Für die Luziferase gelang es, spezifische Antikörper herzustellen, die im Anschluss an den im Western Blot durchgeführten Nachweis eine Identifizierung in histologischen Schwamm¬schnitten ermöglichte. Weitere Analysen konnten für Suberites domuncula sowohl im Schwammgewebe, im Proteinextrakt als auch für das rekombinante Protein die Licht-generierende Fähigkeit nachweisen. Das ermittelte in vitro Biolumineszenz-Emissionsspektrum der rekombinanten Luziferase weist eine Lichtemission im gelb-grünen Bereich des Spektrums mit einem Maximum bei 548 nm und einer Schulter bei 590 nm auf. Ausserdem bestätigte die Funktionanalyse des rekombinanten Enzyms die für Luziferasen bekannte ATP- und Temperatur¬abhängigkeit sowie den stimulierenden Effekt von Coenzym A. Die Existenz einer bioaktiven Luziferase in einem der ältesten, rezent vertretenen Metazoa deutet darauf hin, dass sich die Oxygenasefunktion der Luziferasen bereits früher entwickelte, als bisher von Viviani* vermutet. Die bisherigen Daten über die optischen Eigenschaften der Spiculae liefern gemeinsam mit den Ergebnissen dieser Arbeit – einer Licht-emittierenden Luziferase in S. domuncula – die Voraussetzungen für die mögliche Existenz eines Photorezeptionssystems in Schwämmen.

Meccanismi replicativi e di regolazione dell'espressione genica di Parvovirus B19

Il Parvovirus B19, virus patogeno umano della famiglia Parvoviridae, mostra uno specifico tropismo per i precursori eritroidi e una limitata replicazione in alcune linee cellulari megacarioblastoidi. Allo scopo di sviluppare sistemi utili allo studio delle caratteristiche biologiche del virus, diversi laboratori si sono occupati della costruzione di cloni genomici di B19 dotati di competenza funzionale e capaci di generare virus infettante. Parte del presente lavoro ha riguardato l’analisi funzionale di diversi cloni genomici di B19 e ha permesso di caratterizzare le regioni terminali del virus e di identificare requisiti essenziali per la loro funzionalità. Nel contesto intracellulare, esistono differenti livelli di restrizione in relazione alla capacità della cellula di supportare la replicazione virale, non ancora del tutto caratterizzati. Inoltre si sono accumulate evidenze circa la capacità del B19 di instaurare persistenza in numerosi tessuti. Non sono ancora note le caratteristiche funzionali del genoma virale in questo stato, è possibile che il virus persista in forma silente e meccanismi epigenetici possano regolare tale silenziamento. In questo studio è stato analizzato lo stato di metilazione del genoma di B19 e il suo possibile effetto sul ciclo replicativo virale ed è stata investigata la possibile associazione del DNA virale agli istoni cellulari nel corso di infezione in vitro. I risultati ottenuti confermano la presenza di questi meccanismi epigenetici, potendo ipotizzare che giochino un importante ruolo nella regolazione della funzionalità virale e nell’interazione B19-cellula e siano un elemento critico per l’adattamento del virus nell’ambiente in cui si trova. Inoltre l’ipotesi che anche i microRNA possano assumere un importante significato nell’interazione B19-cellula è stata proposta da diversi lavori e nel presente studio è stata valutata la produzione di queste piccole molecole durante l'infezione in vitro, ricercando microRNA (cellulari e/o virali) con omologia di sequenza per il genoma di B19 e quindi specifici per il virus.

Identifizierung, Sequenzierung und Charakterisierung des Dmxl1-Gen in Mus musculus sowie die funktionelle Analyse durch Knock-Out

Identifizierung, Sequenzierung und Charakterisierung des Dmxl1-Gen in Mus musculus sowie die funktionelle Analyse durch Knock-OutrnrnBei Dmxl1 handelt es sich um ein neuartiges Gen aus Mus musculus. Das ebenfalls in der vorliegenden Arbeit bioinformatisch untersuchte Gen DMXL1 ist das zu Dmxl1 homologe Gen des Menschen. Beide Gene bestehen aus 43 Exons, das murine Dmxl1 codiert für eine mRNA von 10992 bp bzw. 12210 bp, das humane DMXL1 kodiert für eine cDNA von 11082 bp, der offene Leserahmen umfasst bei der Maus 9042 bp. In der Maus konnte ein mögliches alternatives Polyadenylierungssignal identifiziert werden. Zwischen beiden Spezies sind die Exonpositionen und ihre Längen hoch konserviert. Dmxl1 liegt auf dem Crick-Strang von Chromosom 18 Bande C, der translatierte Bereich erstreckt sich auf genomischer Ebene über 129558 bp und die Orientierung verläuft in Richtung Centromer. Dmxl1 und DMXL1 gehören damit zu den größten bekannten Genen in Maus und Mensch. Bei beiden Spezies liegen die DmX-Homologen genomisch innerhalb eines Bereichs der Isochoren-Klasse L1 in einer Gen-armen Region. Die Anzahl der repetitiven Elemente innerhalb der Genregion von Dmxl1 liegt 6% unter dem erwarteten Wert eines L1 Isochors, die Anzahl beim Menschen liegt 4% über dem erwarteten Wert. Um die mögliche Promotorstruktur von Dmxl1 darzustellen, wurden umfangreiche in silico-Analysen der Region um den putativen Transkriptionsstart vorgenommen. Mit Hilfe der gewonnenen Daten konnte ein Transkriptionstartpunkt identifiziert werden. Zudem wurde eine Promotorstruktur erarbeitet, bei der angenommen werden kann, dass sie eine gute Näherung an die tatsächlich vorhandenen Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren darstellt. Die mit bioinformatischen Werkzeugen erzeugte virtuelle Promotor- und Enhancerstruktur zeigt das Potenzial, Dmxl1 basal und ubiquitär zu exprimieren. Gleichzeitig zeigen diese Daten, dass Dmxl1 vermutlich in einigen Geweben der Keimbahn, im Fettgewebe, dem blutbildenen System und während der Embryogenese hochkomplex reguliert werden kann. Eine regulierte Expression zur Steuerung des Energiestoffwechsels ist ebenfalls wahrscheinlich. Diese Ergebnisse passen sehr gut zu den experimentell ermittelten Daten und den beobachteten Phänotypen Dmxl1-chimärer Mäuse.rnDie abgeleitete Aminosäuresequenz umfasst in der Maus 3013 AS, im Menschen 3027 AS, der Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigt eine Identität von 89,3 % und eine Similarität von 94,7 % zwischen beiden Spezies. Im Dmxl1/DMXL1-Protein von Maus und Mensch konnten mindestens 24 und maximal 36 WD-Wiederholungseinheiten identifiziert werden, zudem wurden eine Reihe weiterer konservierter Proteinmotive gefunden. Die in silico-Strukturanalysen beider abgeleiteter Aminosäuresequenzen lässt vermuten, dass sich C- und N-terminal WD-Propellerstrukturen befinden. In dieser Arbeit gelang eine C-terminale Rekonstruktion einer 10-blättrigen Propellerstruktur, denkbar ist jedoch auch eine Struktur mit mindestens drei WD-Propellern, wenn eine prädominante Struktur mit Propellern aus jeweils sieben Propellerblättern angenommen wird.rnDas primäre Ziel dieser Arbeit, die Etablierung einer stabilen Mauslinie mit diruptiertem Dmxl1-Gen konnte aufgrund einer beobachteten Haploinsuffizienz nicht erreicht werden. Trotz zahlreicher Transformationen von Maus-Stammzelllinien konnte letztlich nur eine stabil transformierte Linie mit einem Dmxl1-Null-Allel identifiziert werden, was auch zu den theoretischen Daten und den angenommenen Aufgaben von Dmxl1 als komplex und diffizil reguliertes Multifunktions-Protein passt. Aus der transformierten Mauszelllinie konnten chimäre Mäuse entwickelt werden, die in Abhängigkeit von dem Ausmaß des Chimärismus phänotypisch massive Schädigungen aufwiesen. Neben einer Teilsterilität wurden massive Fettleibigkeit und ein ausgeprägter Hypogonadismus beobachtet. Keines der Tiere war in der Lage das Dmxl1-Null-Allel zu transduzieren. Die Tiere waren nur sehr eingeschränkt fertil, die wenigen Nachkommen entsprachen genotypisch und phänotypisch ausschließlich den verwendeten Blastocysten.rn

Drosophila melanogaster as a model to study host-parasitoid interactions: the case of the polydnaviral protein TnBVANK1

Parasitic wasps attack a number of insect species on which they feed, either externally or internally. This requires very effective strategies for suppressing the immune response and a finely tuned interference with the host physiology that is co-opted for the developing parasitoid progeny. The wealth of physiological host alterations is mediated by virulence factors encoded by the wasp or, in some cases, by polydnaviruses (PDVs), unique viral symbionts injected into the host at oviposition along with the egg, venom and ovarian secretions. PDVs are among the most powerful immunosuppressors in nature, targeting insect defense barriers at different levels. During my PhD research program I have used Drosophila melanogaster as a model to expand the functional analysis of virulence factors encoded by PDV focusing on the molecular processes underlying the disruption of the host endocrine system. I focused my research on a member of the ankyrin (ank) gene family, an immunosuppressant found in bracovirus, which associates with the parasitic wasp Toxoneuron nigriceps. I found that ankyrin disrupts ecdysone biosynthesis by impairing the vesicular traffic of ecdysteroid precursors in the cells of the prothoracic gland and results in developmental arrest.

Molekularbiologische Charakterisierung und funktionelle Analyse des in Kopf-Hals-Tumoren überexprimierten Proteins OSF-2

Im Rahmen dieser Arbeit wurde das in Kopf-Hals-Tumoren überexprimierte, hinsichtlich seiner Funktion jedoch kontrovers diskutierte Protein OSF-2 (Osteoblast specific factor-2) molekularbiologisch charakterisiert und funktionell analysiert. Die endogene OSF-2-Expression wurde in verschiedenen Zelllinien, Geweben, sowie in Primärzellen untersucht. Die durch das N-terminale Sekretionssignal verursachte Proteinsekretion konnte sowohl morphologisch als auch biochemisch nachgewiesen werden. In Microarray-Experimenten konnte gezeigt werden, dass sowohl Tumorzellen als auch Tumor- assoziierte Fibroblasten OSF-2 exprimieren, wobei allerdings keine OSF-2-Isoformsignatur nachgewiesen werden konnte. In funktionellen Assays zeigte OSF-2 zwar keinen Einfluß auf die Proliferation von Kopf-Hals-Tumorzellen, stellte sich jedoch als wichtig für die Zellmigration und das Überleben der Zellen unter ungünstigen Wachstumsbedingungen heraus. Diese Ergebnisse konnten anhand von in vivo-Untersuchungen bestätigt werden. Das verbesserte Überleben der Zellen lässt sich wahrscheinlich durch die OSF-2-induzierte Aktivierung des “Survival Pathways“ Akt/PKB über die PI3-Kinase erklären. Bei den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen humanen Tumorgewebes war es möglich eine neue Tumorzelllinie des frontalen Sinus zu etablieren und charakterisieren. Hierbei konnte gezeigt werden, dass es sich um HPV-negative, morphologisch äußerst heterogene Zellen mit geringer Migrationsgeschwindigkeit handelt, die eine große Zahl an Chromosomenaberrationen aufweisen. Sie konnten ungünstige Wachstumsbedingungen wie Nährstoffmangel besser überleben als die im Vergleich untersuchte Kopf-Hals-Tumorzelllinie und waren dazu in der Lage nach subkutaner Injektion Tumorwachstum in immundefizienten Nacktmäusen zu initiieren. Aus der Tumorzellpopulation isolierte CD133+ Zellen erhöhten die Tumorinitiation erheblich, was auf das Vorhandensein von Tumorstammzellen innerhalb der CD133+ Zellfraktion hindeutet. Um die Bedeutung von OSF-2 als Zielstruktur für neue Krebsmedikamente einschätzen zu können, sind allerdings weitere Informationen über dessen funktionelle Bedeutung notwendig.

Segmentale Musterbildung in der terminalen Abdominalregion des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster

In dieser Arbeit wurden Mechanismen der Musterbildung in der terminalen Abdominalregion des Zentralnervensystems von Drosophila melanogaster untersucht. Dazu wurden zunächst die Anzahl der angelegten Neuromere und das Muster der dort lokalisierten neuralen Stammzellen (Neuroblasten) analysiert. Dabei zeigte sich, dass sowohl die Größe der Neuromere, als auch die Anzahl an Neuroblasten von anterior nach posterior sukzessiv abnimmt, wobei keine geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Anzahl der vorhandenen Neuroblasten festgestellt werden konnten. Durch die Kombination einer Vielzahl von molekularen Markern war es anschließend möglich, die Identität aller Neuroblasten in diesem Bereich aufzuklären und in einer Karte zusammenzutragen. Sie weisen alle eine serielle Homologie zu Neuroblasten in weiter anterior gelegenen Segmenten auf. Des Weiteren wurde die embryonale Identität der geschlechtsspezifischen Neuroblasten untersucht und deren postembryonalen mänchenspezifischen Zellstammbäume charakterisiert. Diese detaillierten Beschreibungen bildeten die Grundlage für die funktionelle Analyse von geschlechts- und segmentspezifischen Faktoren, die zur Musterbildung in dieser Region des Zentralnervensystems beitragen. So konnte gezeigt werden, dass die weibliche Isoform von doublesex den programmierten Zelltod der geschlechtsspezifischen Neuroblasten induziert, während die männliche Isoform diesen verhindert. Das Hox-Gen Abdominal-B zeigt relativ milde Effekte auf das Überleben dieser Neuroblasten, was darauf hindeutet, dass weitere Faktoren benötigt werden, um diesen Prozess in segmentspezifischer Weise zu kontrollieren. Die Funktion von Hox-Genen wurde ferner im Hinblick auf die abgeleitete Morphologie der terminalen Neuromere untersucht. Es konnte herausgefunden werden, dass die regulatorische Isoform von Abdominal-B auf mehreren Ebenen wirkt: Sie beeinflusst die Zusammensetzung bestimmter Zellstammbäume durch Modifikation von Zelldeterminationsprozessen und durch die Kontrolle des programmierten Zelltods. Außerdem unterdrückt sie die Bildung einer spezifischen Subpopulation von Neuroblasten. Allerdings benötigt Abdominal-B.r die Co-Expression des ParaHox-Gens caudal, um sein gesamtes Potenzial bezüglich der Suppression dieser Neuroblasten zu entfalten. Die vorliegende Arbeit hat somit erste Einblicke in die geschlechtsspezifische und segmentspezifische Spezifizierung der terminalen Abdominalregion des Zentralnervensystems von Drosophila auf Ebene des Neuroektoderms, der daraus hervorgehenden Neuroblasten und deren Tochterzellen gewährt. Die vollständige und detailgetreue Beschreibung des Neuroblasten-Musters und der postembryonalen männchenspezifischen Zellstammbäume hat zudem attraktive Modellsysteme für zukünftige Untersuchungen etabliert, an denen sich weitere Mechanismen der Musterbildung im Zentralnervensystem analysieren lassen.

Regulatory T cell-mediated suppression of Th9 cell development and effector function

T helper (Th) 9 cells are an important subpopulation of the CD4+ T helper cells. Due to their ability to secrete Interleukin-(IL-)9, Th9 cells essentially contribute to the expulsion of parasitic helminths from the intestinal tract but they play also an immunopathological role in the course of asthma. Recently, a beneficial function of Th9 cells in anti-tumor immune responses was published. In a murine melanoma tumor model Th9 cells were shown to enhance the anti-melanoma immune response via the recruitment of CD8+ T cells, dendritic cells and mast cells. In contrast to Th9 effector cells regulatory T cells (Tregs) are able to control an immune response with the aid of different suppressive mechanisms. Based on their ability to suppress an immune response Tregs are believed to be beneficial in asthma by diminishing excessive allergic reactions. However, concerning cancer they can have a detrimental function because Tregs inhibit an effective anti-tumor immune reaction. Thus, the analysis of Th9 suppression by Tregs is of central importance concerning the development of therapeutic strategies for the treatment of cancer and allergic diseases and was therefore the main objective of this PhD thesis.rnIn general it could be demonstrated that the development of Th9 cells can be inhibited by Tregs in vitro. The production of the lineage-specific cytokine IL-9 by developing Th9 cells was completely suppressed at a Treg/Th9 ratio of 1:1 on the transcriptional (qRT-PCR) as well as on the translational level (ELISA). In contrast, the expression of IRF4 that was found to strongly promote Th9 development was not reduced in the presence of Tregs, suggesting that IRF4 requires additional transcription factors to induce the differentiation of Th9 cells. In order to identify such factors, which regulate Th9 development and therefore represent potential targets for Treg-mediated suppressive mechanisms, a transcriptome analysis using “next-generation sequencing” was performed. The expression of some genes which were found to be up- or downregulated in Th9 cells in the presence of Tregs was validated with qRT-PCR. Time limitations prevented a detailed functional analysis of these candidate genes. Nevertheless, the analysis of the suppressive mechanisms revealed that Tregs probably suppress Th9 cells via the increase of the intracellular cAMP concentration. In contrast, IL-9 production by differentiated Th9 cells was only marginally affected by Tregs in vitro and in vivo analysis (asthma, melanoma model). Hence, Tregs represent very effective inhibitors of Th9 development whereas they have only a minimal suppressive influence on differentiated Th9 cells.rn

Unmittelbare, dauerhafte sowie evolutionäre Anpassung an Fremdstoffexpositionen

Eine der Hauptursachen für unerwünschte oder reduzierte Wirkungen von Medikamenten ist die Induktion von Enzymen und Transportern des Medikamentenstoffwechsels. Diese Induktion stellt ursprünglich eine physiologische Reaktion auf die Aufnahme von potentiell schädlichen Fremdstoffen aus der Umwelt dar und sichert so die Gesundheit und Fortpflanzungsfähigkeit von Lebewesen. Beim Menschen sowie anderen Säugetieren werden Fremdstoffe hauptsächlich von den nukleären Rezeptoren PXR und CAR in der Leber und im Dünndarm detektiert. Zu den Medikamenten, welche über PXR und CAR wirken, gehören unter anderem Antikonvulsiva, Statine, antiretrovirale Medikamente, Glucocorticoide sowie Antimykotika. Die durch Fremdstoffe aktivierten Transkriptionsfaktoren PXR und CAR steigern die Menge der Enzyme und Transporter des Fremdstoffmetabolismus. Hierzu zählen vor allem die Cytochrom P450-Enzyme (Cyp-Enzyme) mit breitem Substratspektrum oder der Transporter MDR1, welcher eine Vielzahl von Substraten über Membranen transportiert. Durch die Biotransformation werden die induzierenden, lipophilen Substanzen so modifiziert, dass sie leichter über den Urin oder die Galle ausgeschieden werden können. \r\nDie Dauer der Induktion sollte auf die Zeit der Fremdstoffexposition beschränkt sein, um Störungen des endogenen Stoffwechsels zu vermindern. In dieser Arbeit werden jedoch Hinweise auf dauerhafte und sogar generationsübergreifende Effekte von Medikamenten in Mäusen geliefert. Nachkommen von Müttern, welche bereits vor ihrer Verpaarung einmalig mit TCPOBOP, einem Liganden des murinen CAR, injiziert wurden, hatten eine ungefähr 100-fach gesteigerte Genexpression von Cyp2b10. Auch gab es Expressionsänderungen von Genen, deren Produkte eine Rolle im Lipidstoffwechsel sowie bei Immunkrankheiten spielen. Eine Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung der injizierten Elterngeneration ergab außerdem dauerhafte Expressionsveränderungen anderer Gene des Medikamentenstoffwechsels sowie von Genen mit Verbindung zum Energiemetabolismus. \r\nBerücksichtigt man die enge evolutionäre Verwandtschaft der nukleären Rezeptoren CAR und PXR, sind Langzeitveränderungen auch für PXR möglich und wurden im Verlauf dieser Arbeit ebenfalls untersucht. Eine Hochdurchsatz-Sequenzierung ergab für Mäuse, welche mit dem PXR-Aktivator PCN induziert wurden, dass selbst noch drei Monate nach der Exposition Gene verändert exprimiert waren, welche im Zusammenhang mit Lebernekrosen stehen. Bei Nachkommen von PCN-injizierten Müttern wurden Gene unterschiedlich exprimiert, welche eine Rolle bei der Energiehomöostase sowie im Glukosestoffwechsel spielen. Im Erwachsenenalter sind bei diesen Nachkommen darüber hinaus noch Gene unterschiedlich exprimiert, deren Produkte eine Funktion in der Immunantwort haben. \r\nDa Erwachsene aufgrund ihrer Lebensdauer sowie der absoluten Krankheitshäufigkeit wesentlich öfter Kontakt mit Fremdstoffen haben, war medizinisch von besonderem Interesse, ob anhaltende Genexpressionsänderungen auch bei Erwachsenen zu beobachten sind. So konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass auch einmalig exponierte Adulttiere Gene dauerhaft verändert exprimieren und die Veränderungen im Medikamentenstoffwechsel an die nächste Generation übertrugen. \r\n\r\nBisher sind klinische Studien zur Risikobewertung von Medikamenten (Pharmakovigilanz) nicht generationsübergreifend angelegt. Diese Arbeit gibt Anstöße dafür, dass dies in Zukunft für viel mehr Medikamente notwendig werden könnte. Neben Veränderungen im Medikamentenstoffwechsel ergeben sich Nebenwirkungen von PXR- und CAR-Liganden vor allem aus ihrer Beteiligung an endogenen Stoffwechselwegen. Nach Aktivierung von CAR, welcher viele metabolische Stoffwechselwege steuert, treten beispielsweise Störungen des Energiestoffwechsels auf. Ein tieferes Verständnis der Rezeptoraktivität von CAR samt einer gezielten Modulierung seiner Aktivität würde wichtige Beiträge zum Verständnis der Regulation des Fremdstoffmetabolismus sowie der Entstehung von Nebenwirkungen durch eine Behandlung mit CAR-Liganden leisten. Dauerhafte Veränderungen endogener Stoffwechselwege könnten dann möglicherweise über eine pharmakologische Modulierung der CAR-Aktivität reduziert werden. \r\nZu diesem Zweck wurden im Verlauf dieser Arbeit die CAR-Rezeptoren der Amphibien (Xenopus tropicalis, Xenopus laevis) und Reptilien (Anolis carolinensis) erstmals kloniert, als Proteine exprimiert und charakterisiert. Vergleiche zwischen Tierarten ermöglichen ein besseres Verständnis von humanen Proteinen. Funktionelle Analysen ergaben Ähnlichkeiten des Xenopus laevis-CAR mit dem PXR der Säugetiere: eine niedrige basale Aktivität sowie eine starke Induzierbarkeit durch Liganden. In weiteren funktionellen Analysen wurden die Determinanten der basalen Aktivität des Xenopus laevis-CAR untersucht. Die basale Aktivität war nicht abhängig von der subzellulären Lokalisation, sondern ergab sich aus der Proteinstruktur, welche nur beim CAR der Landvertebraten in einer aktiven Konformation fixiert ist. Ähnlich dem PXR der Säugetiere besitzt CAR der Amphibien eine Aktivierungsdomäne, welche erst durch Ligandenbindung in eine aktive Konformation gebracht wird. Mutationen einzelner Aminosäuren zum jeweils humanen Homolog erhöhten die basale Aktivität des Xenopus laevis-CAR auf die des humanen Rezeptors. Diese Mutanten mit erhöhter basalen Aktivität zeigten eine verstärkte Interaktion mit dem Kofaktor PGC-1a, einem Regulator des Energiestoffwechsels bei Säugetieren. Die hepatischen Zielgene des CAR der Amphibien überlappen zum Teil mit den humanen Zielgenen und spielen ebenfalls eine Rolle im Energiestoffwechsel.

Detrimental effects of exuberant and restrained immune responses against the central nervous system in the context of multiple sclerosis and glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and most aggressive astrocytic tumor of the central nervous system (CNS) in adults. The standard treatment consisting of surgery, followed by a combinatorial radio- and chemotherapy, is only palliative and prolongs patient median survival to 12 to 15 months. The tumor subpopulation of stem cell-like glioma-initiating cells (GICs) shows resistance against radiation as well as chemotherapy, and has been suggested to be responsible for relapses of more aggressive tumors after therapy. The efficacy of immunotherapies, which exploit the immune system to specifically recognize and eliminate malignant cells, is limited due to strong immunosuppressive activities of the GICs and the generation of a specialized protective microenvironment. The molecular mechanisms underlying the therapy resistance of GICs are largely unknown. rnThe first aim of this study was to identify immune evasion mechanisms in GICs triggered by radiation. A model was used in which patient-derived GICs were treated in vitro with fractionated ionizing radiation (2.5 Gy in 7 consecutive passages) to select for a more radio-resistant phenotype. In the model cell line 1080, this selection process resulted in increased proliferative but diminished migratory capacities in comparison to untreated control GICs. Furthermore, radio-selected GICs downregulated various proteins involved in antigen processing and presentation, resulting in decreased expression of MHC class I molecules on the cellular surface and diminished recognition potential by cytotoxic CD8+ T cells. Thus, sub-lethal fractionated radiation can promote immune evasion and hamper the success of adjuvant immunotherapy. Among several immune-associated proteins, interferon-induced transmembrane protein 3 (IFITM3) was found to be upregulated in radio-selected GICs. While high expression of IFITM3 was associated with a worse overall survival of GBM patients (TCGA database) and increased proliferation and migration of differentiated glioma cell lines, a strong contribution of IFITM3 to proliferation in vitro as well as tumor growth and invasiveness in a xenograft model could not be observed. rnMultiple sclerosis (MS) is the most common autoimmune disease of the CNS in young adults of the Western World, which leads to progressive disability in genetically susceptible individuals, possibly triggered by environmental factors. It is assumed that self-reactive, myelin-specific T helper cell 1 (Th1) and Th17 cells, which have escaped the control mechanisms of the immune system, are critical in the pathogenesis of the human disease and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). It was observed that in vitro differentiated interleukin 17 (IL-17) producing Th17 cells co-expressed the Th1-phenotypic cytokine Interferon-gamma (IFN-γ) in combination with the two respective lineage-associated transcription factors RORγt and T-bet after re-isolation from the CNS of diseased mice. Pathogenic molecular mechanisms that render a CD4+ T cell encephalitogenic have scarcely been investigated up to date. rnIn the second part of the thesis, whole transcriptional changes occurring in in vitro differentiated Th17 cells in the course of EAE were analyzed. Evaluation of signaling networks revealed an overrepresentation of genes involved in communication between the innate and adaptive immune system and metabolic alterations including cholesterol biosynthesis. The transcription factors Cebpa, Fos, Klf4, Nfatc1 and Spi1, associated with thymocyte development and naïve T cells were upregulated in encephalitogenic CNS-isolated CD4+ T cells, proposing a contribution to T cell plasticity. Correlation of the murine T-cell gene expression dataset to putative MS risk genes, which were selected based on their proximity (± 500 kb; ensembl database, release 75) to the MS risk single nucleotide polymorphisms (SNPs) proposed by the most recent multiple sclerosis GWAS in 2011, revealed that 67.3% of the MS risk genes were differentially expressed in EAE. Expression patterns of Bach2, Il2ra, Irf8, Mertk, Odf3b, Plek, Rgs1, Slc30a7, and Thada were confirmed in independent experiments, suggesting a contribution to T cell pathogenicity. Functional analysis of Nfatc1 revealed that Nfatc1-deficient CD4+ T cells were restrained in their ability to induce clinical signs of EAE. Nfatc1-deficiency allowed proper T cell activation, but diminished their potential to fully differentiate into Th17 cells and to express high amounts of lineage cytokines. As the inducible Nfatc1/αA transcript is distinct from the other family members, it could represent an interesting target for therapeutic intervention in MS.rn