Structural and functional analysis of the hepatitis C virus non-structural protein 5A

Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein umhülltes RNA Virus aus der Familie der Flaviviridae. Sein Genom kodiert für ein ca. 3000 Aminosäuren langes Polyprotein, welches co- und posttranslational in seine funktionellen Einheiten gespalten wird. Eines dieser viralen Proteine ist NS5A. Es handelt sich hierbei um ein stark phosphoryliertes Protein, das eine amphipatische α-Helix im Amino-Terminus trägt, welche für die Membran-Assoziation von NS5A verantwortlich ist. Welche Rolle die Phosphorylierung für die Funktion des Proteins spielt, bzw. welche Funktion NS5A überhaupt ausübt, ist zur Zeit noch unklar. Beobachtungen lassen Vermutungen über eine Funktion von NS5A bei der Resistenz infizierter Zellen gegenüber Interferon-alpha zu. Weiterhin wird vermutet, das NS5A als Komponente des membranständigen HCV Replikasekomplexes an der RNA Replikation beteiligt ist. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, die Funktion von NS5A für die RNA Replikation zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde eine Serie von Phosphorylierungsstellen-Mutanten generiert, die auf Ihre Replikationsfähigkeit und den Phosphorylierungsstatus hin untersucht wurden. Wir fanden, dass bestimmte Serin-Substitutionen im Zentrum von NS5A zu einer gesteigerten RNA Replikation führten, bei gleichzeitig reduzierter NS5A Hyperphosphorylierung. Weiterhin studierten wir den Einfluß von Mutationen in der Amino-terminalen amphipatischen α-Helix von NS5A auf die RNA-Replikation, sowie Phosphorylierung und subzelluläre Lokalisation des Proteins. Wir fanden, dass geringfügige strukturelle Veränderungen der amphipatischen Helix zu einer veränderten subzellulären Lokalisation von NS5A führten, was mit einer reduzierten oder komplett inhibierten RNA Replikation einherging. Zudem interferierten die strukturellen Veränderungen mit der Hyperphosphorylierung des Proteins, was den Schluß nahe legt, dass die amphipatische Helix eine wichtige strukturelle Komponente des Proteins darstellt, die für die korrekte Faltung und Phosphorylierung des Proteins essentiell ist. Als weitere Aspekte wurden die Trans-Komplementationsfähigkeit der verschiedenen viralen Komponenten des HCV Replikasekomplexes untersucht, sowie zelluläre Interaktionspartner von NS5A identifiziert. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit, dass NS5A eine wichtige Rolle bei der RNA-Replikation spielt. Diese Funktion wird wahrscheinlich über den Phosphorylierungszustand des Proteins reguliert.

Identifikation transkriptioneller Alterationen menschlicher Tumoren und Entwicklung eines neuen auf RNA-Transfer basierenden Verfahrens zur Bestimmung der Genfunktion

Zielvorgaben der vorliegenden Arbeit war die Identifikation neuer selektiv in Tumoren aktivierter Gene sowie die Entwicklung eines methodischen Prozesses, um die molekularen Effekte der fehlerhaften Aktivierung solcher Gene zu untersuchen. Für die erste Fragestellung haben wir zwei komplementäre Methoden entwickelt. Zum einen haben wir nach neuen Mitglieder der Cancer/Germline (CG) Familie von Genen gesucht, die bereits attraktive Zielstrukturen laufender Phase I/IIa Studien sind. Zu diesem Zweck wurde ein bioinformatischer Data Mining Ansatz generiert. Dieser führte zur erfolgreichen in silico Klonierung neuer CG Gene. Zur Identifikation von in Tumorzellen überexprimierten Genen nutzten wir einen cDNA Mikroarray mit 1152 ausgewählten Genen mit direkter oder indirekter tumorimmunologischer oder tumorbiologischer Relevanz. Die komparative transkriptionelle Untersuchung von humanen Tumor- und Normalgeweben mit diesem Array führte zur Wiederentdeckung bereits bekannter, aber auch zur Aufdeckung bisher nicht beschriebener tumor-assoziierter Transkriptionsveränderungen. Der zweite große Schwerpunkt dieser Arbeit war die Technologieentwicklung eines versatilen Prozesses zur Untersuchung von molekularen Effekten eines aberrant in Zellen exprimierten Gens. Zur Simulation dieser Situation stellten wir in vitro transkribierte RNA dieses Gens her und elektroporierten diese in Zielzellen. Transkriptionsanalysen solcher Transfektanden mit Affymetrix Oligonukleotid Mikroarray deckten auf gesamt-genomischer Ebene ganze Kaskaden konsekutiver, transkriptioneller Alterationen auf.

RNA-Strukturen im Hepatitis-C-Virus und ihre Bedeutung für Translation und Replikation

Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein umhülltes Virus aus der Familie der Flaviviridae. Es besitzt ein Plusstrang-RNA Genom von ca. 9600 Nukleotiden Länge, das nur ein kodierendes Leseraster besitzt. Das Genom wird am 5’ und 3’ Ende von nicht-translatierten Sequenzen (NTRs) flankiert, welche für die Translation und vermutlich auch Replikation von Bedeutung sind. Die 5’ NTR besitzt eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), die eine cap-unabhängige Translation des ca. 3000 Aminosäure langen viralen Polyproteins erlaubt. Dieses wird ko- und posttranslational von zellulären und viralen Proteasen in 10 funktionelle Komponenten gespalten. Inwieweit die 5’ NTR auch für die Replikation der HCV RNA benötigt wird, war zu Beginn der Arbeit nicht bekannt. Die 3’ NTR besitzt eine dreigeteilte Struktur, bestehend aus einer variablen Region, dem polyU/UC-Bereich und der sogenannten X-Sequenz, eine hochkonservierte 98 Nukleotide lange Region, die vermutlich für die RNA-Replikation und möglicherweise auch für die Translation benötigt wird. Die genuae Rolle der 3’ NTR für diese beiden Prozesse war zu Beginn der Arbeit jedoch nicht bekannt. Ziel der Dissertation war deshalb eine detaillierte genetische Untersuchung der NTRs hinsichtlich ihrer Bedeutung für die RNA-Translation und -Replikation. In die Analyse mit einbezogen wurden auch RNA-Strukturen innerhalb der kodierenden Region, die zwischen verschiedenen HCV-Genotypen hoch konserviert sind und die mit verschiedenen computer-basierten Modellen vorhergesagt wurden. Zur Kartierung der für RNA-Replikation benötigten Minimallänge der 5’ NTR wurde eine Reihe von Chimären hergestellt, in denen unterschiedlich lange Bereiche der HCV 5’ NTR 3’ terminal mit der IRES des Poliovirus fusioniert wurden. Mit diesem Ansatz konnten wir zeigen, dass die ersten 120 Nukleotide der HCV 5’ NTR als Minimaldomäne für Replikation ausreichen. Weiterhin ergab sich eine klare Korrelation zwischen der Länge der HCV 5’ NTR und der Replikationseffizienz. Mit steigender Länge der 5’ NTR nahm auch die Replikationseffizienz zu, die dann maximal war, wenn das vollständige 5’ Element mit der Poliovirus-IRES fusioniert wurde. Die hier gefundene Kopplung von Translation und Replikation in der HCV 5’ NTR könnte auf einen Mechanismus zur Regulation beider Funktionen hindeuten. Es konnte allerdings noch nicht geklärt werden, welche Bereiche innerhalb der Grenzen des IRES-Elements genau für die RNA-Replikation benötigt werden. Untersuchungen im Bereich der 3’ NTR ergaben, dass die variable Region für die Replikation entbehrlich, die X-Sequenz jedoch essentiell ist. Der polyU/UC-Bereich musste eine Länge von mindestens 11-30 Uridinen besitzen, wobei maximale Replikation ab einer Länge von 30-50 Uridinen beobachtet wurde. Die Addition von heterologen Sequenzen an das 3’ Ende der HCV-RNA führte zu einer starken Reduktion der Replikation. In den hier durchgeführten Untersuchungen zeigte keines der Elemente in der 3’ NTR einen signifikanten Einfluss auf die Translation. Ein weiteres cis aktives RNA-Element wurde im 3’ kodierenden Bereich für das NS5B Protein beschrieben. Wir fanden, dass Veränderungen dieser Struktur durch stille Punktmutationen die Replikation hemmten, welche durch die Insertion einer intakten Version dieses RNA-Elements in die variable Region der 3’ NTR wieder hergestellt werden konnte. Dieser Versuchsansatz erlaubte die genaue Untersuchung der für die Replikation kritischen Strukturelemente. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die Struktur und die Primärsequenz der Loopbereiche essentiell sind. Darüber hinaus wurde eine Sequenzkomplementarität zwischen dem Element in der NS5B-kodierenden Region und einem RNA-Bereich in der X-Sequenz der 3’ NTR gefunden, die eine sog. „kissing loop“ Interaktion eingehen kann. Mit Hilfe von gezielten Mutationen konnten wir zeigen, dass diese RNA:RNA Interaktion zumindest transient stattfindet und für die Replikation des HCV essentiell ist.

Strukturelle und funktionelle Untersuchungen zur Bedeutung der endogenen retroviralen Insertion HERV-K(C4) im C4-Gen des Menschen

Der Längenpolymorphismus des C4-Gens beruht auf der An- oder Abwesenheit einer 6.4 kb langen Insertion im Intron 9. Es handelt sich dabei um einen eigenständigen bisher noch nicht beschriebenen Virus-Typ, der alle Sequenzmerkmale der Familie der humanen endogenen Retroviren (HERV) trägt und zu den HERV-K Viren gehört. Der Provirus wurde als HERV-K(C4) bezeichnet. Die Orientierung dieses retroviralen Elements ist entgegengesetzt zu der Transkriptionsrichtung des C4-Gens. Mittels RT-PCR, RNase Protection Assays und Northern-Blot Analysen konnte der Nachweis von HERV-K(C4)-Antisense mRNA-Transkripten in verschiedenen humanen Zellinien und Geweben erbracht werden. Die retroviralen Transkripte schlossen am 5'- und 3'-Ende Sequenzen des C4-Exon 9 und Exon 10 ein, so daß diese wahrscheinlich "readthrough" Transkripte darstellen, die durch einen 5' des LTR2 gelegenen Promotor initiiert oder im Zusammenhang mit der C4-Expression transkribiert und reguliert werden. Weiterhin konnten insgesamt 4 HERV-K(C4)-mRNA Spezies, einschließlich einer Vollängen-RNA detektiert werden. Die drei subgenomischen mRNAs werden vermutlich durch einfaches und mehrfaches Spleißen generiert. Die quantitative Analyse in verschiedenen humanen Zellinien ergab, daß HERV-K(C4) durchschnittlich mit einer Kopienanzahl zwischen ca.1 bis 100 Transkripten in einer Zelle vorkommt, so daß es sich um low abundance mRNAs handelt. Mittels eines Reportergen-System konnte eine Aktivität des LTR2-Promotors in der Sense-Orientierung des Retrovirus nachgewiesen werden, die nach Stimulation mit IFN- signifikant abnahm. Ein humanes Modell-Systems wurde etabliert, um die Theorie einer Antisense-Abwehr gegen exogene Retroviren in HepG2-Zellen zu überprüfen. Die Theorie basiert auf dem Nachweis von HERV-K(C4)-Antisense-Transkripten, die über eine Heteroduplexbildung mit der Sense-mRNA von verwandten, infektiösen Retroviren eine mögliche Blockierung deren Translation erwirken könnten. Es konnte eine signifikante Abnahme der retroviralen Expression von bis zu 45% nach steigenden Dosen an IFN- in HepG2-Zellen nachgewiesen werden. Der funktionell aktive 3'-LTR-Sense Promotor sowie der Nachweis von HERV-K(C4)-Antisense Transkripten sprechen für die bedeutende Rolle von HERV-K(C4) bei der Genregulation und Schutz gegen exogene Retroviren, wodurch eine Selektion stattgefunden hat.

Proteolyse des Amyloid-Vorläufer-Protein-verwandten APLP2 durch alpha-Sekretasen

Die im Laufe der Evolution konservierte Genfamilie des Amyloid-Vorläufer-Proteins APP beinhaltet sowohl bei der Maus als auch beim Menschen die beiden APP-ähnlichen ProteineAPLP1 und APLP2. Ziel dieser Arbeit war es, die proteolytische Prozessierung des APLP2 zu charakterisieren und die beteiligten Proteasen aufzuzeigen. Ausgehend von Stimulations- und Inhibitionsversuchen wurde die Metzincin-Familie der Metalloproteinasen als APLP2-Proteasen identifiziert. Durch Überexpression von ADAM10 und TACE (ADAM17) konnten zwei wichtige Prozessierungs-Enzyme des APLP2 charakterisiert werden. Damit wurde zum ersten Mal eine α-Sekretase-ähnliche Enzymaktivität analog zu der Spaltung des APP an APLP2 beschrieben. Untersuchungen an ADAM10-transgenen Mäusen bestätigten die proteolytische Prozessierung des APLP2 in vivo. Durch die Untersuchung neuronaler Differenzierung mit Retinsäure und Apoptose in Neuroblastoma-Zellen gelang der Nachweis einer funktionellen Koregulation von APLP2 und seiner Protease ADAM10, die zu einer erhöhten Freisetzung des neurotrophen löslichen APLP2 bei der Differenzierung und zu einer Reduktion bei Apoptose führt. In den Gehirnen von Alzheimer-Patienten gibt es sowohl Hinweise auf einen gestörten Vitamin A Metabolismus als auch auf verstärkte apoptotische Vorgänge, so dass hier erstmalig eine Verknüpfung der APLP2-Proteolyse mit zwei pathogenen Prozessen des Morbus Alzheimergezeigt werden konnten. Eine therapeutische Aktivierung der α-Sekretasen hätte die verstärkte Bildung von neurotrophem APPsα und APLP2s zur Folge. Es bestünde jedoch gleichzeitig die Gefahr von Nebenwirkungen durch die Spaltung weiterer Substrate wie der Notch-Rezeptoren oder des Prionenproteins. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Notch-1 prinzipiell ein Substrat für ADAM10 darstellt, die Auswirkungen in vivo jedoch begrenzt und altersabhängig sind. Für das Prionenprotein ergab sich keine direkte Beeinflussung durch eine Spaltung, sondern vielmehr eine Expressionsminderung durch die Überexpression von ADAM10 in Mäusen. Die Inkubationszeit bei der Prionenerkrankung hängt von der Menge des endogenen zellulären Prionenproteins ab. Daher ergibt sich aus einer Steigerung der α-Sekretase-Aktivität eine potentielle Prävention gegenüber einer Infektion mit der pathogenen Scrapie-Form des Prionenproteins.

Funktionelle und morphologische Untersuchungen der Silikataufnahme und Nadelbildung im marinen Schwamm Suberites domuncula

Die für Metazoen einzigartige Fähigkeit, hochdifferenzierte Silikatstrukturen herzustellen und als Gerüstsubstanz zu verwenden, steht bei den Porifera in einem scheinbaren Gegensatz zu der niedrigen Konzentration an Silizium in dem die Schwämme umgebenden Medium. In der zweiten bedeutenden silikatpolymerisierenden Species, den einzelligen Kieselalgen (Diatomeen), konnte bereits ein Silikattransporter identifiziert werden, dessen Sequenzdaten jedoch aufgrund der phylogenetisch geringen Verwandtschaft der Demospongien mit den Diatomeen keine Verwendung finden konnte Im Zuge der Suche nach einem Silikat-Transportsystem im Schwamm Suberites domuncula wurde ein potentielles Kandidatengen mittels molekularbiologischer Techniken aus einer cDNA Bank des Instituts isoliert, vervollständigt und analysiert. Es zeigte sich, dass dieser Transporter durch seine Sequenzdaten der Familie der Bikarbonattransporter angehörte, und somit membranständig war. Seine Transportfunktion zeigte sich mittels spezifischer Inhibitoren hemmbar. Damit der Schwamm in der Lage ist, eine regulierbare und schnelle Anreicherung von Silikat durchführen zu können, lag eine Annahme einer Induzierbarkeit der Transportergene durch das Substrat Silikat nahe. Mittels Northern-Blot Analyse konnte in einem Primmorphensystem des Schwammes eine Hochregulation der Transkription der Transportergene festgestellt werden. Die Lokalisation der Exprimierung des Transporters innerhalb des Schwammgewebes konnte mittels In situ Hybridisierung untersucht werden und zeigte eine direkte Nähe zu den Polysilikatstrukturen des Schwammes. Um Hinweise auf eine Bifunktionalität des Transporters aufgrund der Ähnlichkeit von Carbonat und Silikat zu erhärten, wurden fluoreszenzmikroskopische Studien an isolierten Zellkulturen des Schwammes durchgeführt. Es kam zu einer intensive Reaktion der Zellen auf Silikat als Substrat. Dieser Effekt konnte nicht nur durch einen spezifischen Transportinhibitor (DIDS) gehemmt werden, sondern zeigt auch eine deutliche Temperaturabhängigkeit. Um den potentiellen Silikattransporter in Zusammenhang mit dem Gesamtmechanismus der Silikatnadelherstellung in Schwämmen zu bringen, wurden zusätzliche elektronenmikroskopische Studien angestellt. Hier konnte zunächst gezeigt werden, wie sich das die Polykondensation auslösende und dirigierende Proteinfilament des Schwammes bei der Nadelbildung entwickelt. Mittels einer darauf folgenden Immunogold-Markierung des Hauptaxialfilamentproteins des Schwammes in elektronenmikroskopischen Gewebepräparaten, konnte dessen Vorkommen nicht nur im Zentrum der Silikatnadel, sondern auch in den die Nadel umgebenden Strukturen nachgewiesen werden

Untersuchungen zur Genexpression in Wurzeln der reblausresistenten Unterlagsrebsorte ’Börner’

Die reblausresistente Unterlagsrebsorte ’Börner’ reagiert auf einen Reblausbefall mit einer Hypersensitivitätsreaktion (HR), die sich in Form von Nekrosen an Blättern und Wurzeln zeigt. Im Rahmen dieser Dissertation wurde der Resistenzmechanismus mittels differenzieller Genexpressionsanalysen untersucht. Unter Anwendung der suppressiven subtraktiven Hybridisierung, der DNA-Microarraytechnik sowie der GeneFishingTM-Methode erfolgte ein Vergleich zwischen der Genexpression in hypersensitivem Wurzelgewebe und Normalgewebe der Unterlagsrebe ’Börner’. Neben der Reblaus induzierten HR wurde insbesondere auf die experimentelle Induktion durch das Pflanzenhormon Indol-3-Essigsäure (IES) zurückgegriffen. Damit sollten Kenntnisse über die Rolle der IES als auslösender Faktor der Resistenzreaktion gewonnen werden. Die Ergebnisse bestätigen die Annahme, dass die IES Pathogenabwehrreaktionen in ’Börner’ induziert. So konnten Hinweise auf die transkriptionelle Aktivierung Resistenz und HR assoziierter Proteine gefunden werden, wie z.B. Phytoalexine und pathogen-related (PR)-Proteine sowie Vertreter aus der hypersensitive-induced response-Familie. Es konnten weiterhin wertvolle Informationen im Hinblick auf die Transduktion des IES-Signals im Zusammenhang mit der Aktivierung von Resistenzreaktionen gewonnen werden. So wurden Hinweise auf die Beteiligung der Signalsubstanzen Ethylen, Salicylsäure, Jasmonsäure, Calcium sowie reaktiver Sauerstoffspezies gefunden. Es konnten zudem Anhaltspunkte für die Aktivierung des Auxin induzierten Ubiquitin/26S-Proteolyseweges und weiterer Signalkomponenten, wie z.B. Kinasen und Transkriptionsfaktoren, ermittelt werden. Auch auf die Beteiligung von Auxinrezeptoren konnte aufgrund der Resultate geschlossen werden. Damit war es im Rahmen der Dissertation möglich, potenzielle Signaltransduktionswege zu erarbeiten, die für weiterführende Untersuchungen des Reblausresistenzmechanismus von entscheidender Bedeutung sind.

"Wie eine andere Welt"

„Wie eine andere Welt“ – Eine Grounded Theory-Studie zur Frage der Teilhabe von Eltern an schulischer Kommunikation am Beispiel von RealschülerInnen Autorin: Sabine Rech Die Arbeit geht explizit auf das Verhältnis von Familie und Schule ein, wobei dieses Verhältnis nicht traditionellerweise unter dem Aspekt des Einflusses von Eltern auf die Schule bzw. der Einflussmöglichkeiten und der Zusammenarbeit von Eltern und Schule thematisiert wird, sondern inwiefern Eltern an schulischer Kommunikation teilhaben. Dies schließt unausweichlich die Frage ein, inwiefern das Thema Schule in der familialen Kommunikation aufkommt bzw. ob und welche Irritationen dadurch entstehen. Die Arbeit verfolgt dabei theoretisch einen systemtheoretischen Ansatz, mit dem die Systeme Familie und Schule eingeordnet werden. Methodisch wird mit der Grounded Theory eine eigene Studie an RealschülerInnen und ihren Eltern zur Forschung herangezogen. Nach dem Referat des Forschungsstandes und der theoretischen Rahmung wird die konkrete empirische Studie an zwei Fragen zu entfalten: „Wie gestaltet sich der Lebensalltag im Elternhaus unter dem Einfluss einer komplexen Teilhabe an schulbezogener Kommunikation“ und „Auf welche Weise erfolgt die Inklusion der Kommunikation des formal organisierten Schullebens in den emotional ausgestatteten Familienalltag und damit die Teilhabe der Eltern an der im Elternhaus geführten schulbezogenen Kommunikation?“. Diese Fragen werden in einen empirischen Rahmen gefasst und durch die Auswertung des Datenmaterials der Untersuchungsgruppe (16 RealschülerInnen der achten Klasse und 6 Elternteile) ausgewertet. Die Ergebnisse dieser Analyse, die an dieser Stelle nicht in ihrer Differenziert dargestellt werden können, zeigen als wesentlichen Ertrag das Bild von der Schule als „andere Welt“ für Eltern der RealschülerInnen. Dies lässt sich empirisch durch die Analyse der Kommunikation in der Familie belegen. Die Analyse des Datenmaterials der SchülerInnen weist hingegen darauf hin, dass Jugendliche die Schule nicht als etwas Fremdes und Distanziertes erleben, sondern hier eine Bereicherung ihrer eigenen Lebenswelt definieren.

Molekulare Reaktionsmuster in dendritischen Zellen nach Allergenexposition

Allergische Erkrankungen, wie zum Beispiel die allergische Rhinitis oder das allergische Asthma haben im Verlauf der letzten vier Jahrzehnte stark zugenommen. So leidet heute jeder vierte bis fünfte Mensch an einer Allergie. Ausgelöst wird diese IgE-vermittelte Hypersensibilitätsreaktion des Typs I (Allergie vom Soforttyp) von Allergenen und beruht auf der Aktivierung von Mastzellen durch die Interaktion eines Antigens mit dem an eine Mastzelle über die Fc-Rezeptoren gebundenen IgE-Moleküls. Die degranulierende Mastzelle sezerniert Mediatoren, was zu einem Auftreten von allergischen Symptomen führt. Die Bildung von IgE wird durch das von TH2-Zellen produzierte Zytokin IL-4 induziert. Das von TH1-Zellen produzierte Zytokin IFN- ist in der Lage die Sekretion von IL-4 zu inhibieren, wie auch IL-4 hemmend auf die Produktion von IFN- wirkt. Dieses TH1-/ TH2-Gleichgewicht ist bei allergischen Erkrankungen in Richtung TH2 verschoben. Allergene werden von antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen, prozessiert und auf der Zelloberfläche präsentiert. Die potentesten antigenpräsentierenden Zellen sind die dendritischen Zellen, die nach Kontakt mit einem Allergen in die benachbarten Lymphknoten wandern, ausreifen und kostimulatorische Moleküle exprimieren. Sie sind so in der Lage T-Zellen zu aktivieren und entweder in TH1- oder in TH2-Zellen differenzieren zu lassen. Die zytokinabhängige TH1- beziehungsweise TH2-Differenzierung führt zur Aktivierung der Januskinasen. Im aktiven Zustand phosphorylieren sie STAT-Moleküle, die dimerisieren und in den Zellkern translozieren, wo sie unter anderem als Transkriptionsfaktoren für Zytokingene dienen. Unreife humane dendritische Zellen von Allergikern zeigen nach Stimulation mit Proteinallergenen eine schnelle Phosphorylierung des mit der TH2-Entwicklung assoziierten STAT6. Dahingegen sind TH1-Antwort hervorrufende Kontaktallergene nicht in der Lage STAT6 oder andere STAT-Moleküle in dendritischen Zellen zu induzieren. Die Transkriptionsfaktoren T-bet und GATA3 sind ebenfalls von Bedeutung für die TH1-/TH2-Entwicklung, da T-bet ausschließlich in TH1-Zellen, GATA3 nur in TH2-Zellen exprimiert wird. Die Regulation des JAK/STAT-Weg unterliegt den Molekülen der intrazellulär vorkommenden Familie der SOCS-Proteine. SOCS3 ist in TH2-Zellen höher exprimiert als SOCS1, wohingegen SOCS1 in TH1-Zellen eine erhöhte Expression gegenüber SOCS3 aufweist. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Proteinallergenen auf humane dendritische Zellen untersucht. Zunächst konnte eine morphologische Veränderung der unreifen dendritischen Zellen nach Kontakt mit dem Allergenextrakt beobachtet werden. Die beginnende Ausreifung der Zellen konnte mittels Durchflußzytometrie anhand der kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86, insbesondere aber über den Marker für reife dendritische Zellen CD83, nachgewiesen werden. Die zu beobachtende beginnende Ausreifung scheint ein Effekt des bakteriellen Lipopolysaccharids (LPS) zu sein, das in dem Allergenextrakt vorkommt, da sich durch Zugabe des kationischen Antibiotikums Polymyxin B die beginnende Reifung verhindern ließ. Auf RNA-Ebene war es im Rahmen dieser Arbeit möglich, den Einfluss verschiedener Allergene auf unreifen humanen dendritischen Zellen näher zu charakterisieren. So weisen unreife humane dendritische Zellen nach Kontakt mit Proteinallergenextrakt ein TH2-assoziiertes Genexpressionprofil auf, was sich durch eine erhöhte relative Expression der Gene SOCS3 und GATA3 auszeichnet. Im Gegensatz hierzu zeigen unreife humane dendritische Zellen nach Inkubation mit dem Kontaktallergen MCI/MI eine erhöhte relative Expression des Gens T-bet, was mit einer TH1-Antwort assoziiert ist. Nach Zugabe des „TH1-/ TH2-neutralen“ Tetanustoxoids konnten erhöhte relative Expressionen der Gene GATA3, T-bet und SOCS3 gemessen werden. Die Ergebnisse in dem in dieser Arbeit benutzten humanen in vitro System geben Anlass zur Hypothese, dass die Art der Immunantwort (TH1 versus TH2) sich bereits auf Ebene der dendritischen Zellen anbahnt. GeneChip-Analysen mittels High Density Micro Arrays von unreifen humanen dendritischen Zellen, die entweder mit Proteinallergenextrakt oder mit LPS in Berührung kamen, zeigten statistisch signifikant regulierte Gene, die allerdings keine Gemeinsamkeiten aufwiesen. Es konnten für die mit Alllergenextrakt gepulsten dendritischen Zellen insgesamt 10 Gene identifiziert werden, jedoch gelang es nicht, diese näher zu deuten oder in einen Zusammenhang mit der allergischen Erkrankung oder der dendritischen Zelle zu bringen. Für die mit LPS, dem stärkeren Stimulus, gepulsten dendritischen Zellen konnten 40 Gene identifiziert werden, die unter anderem für die Maturierung der dendritischen Zelle verantwortlich sind. Zudem war es möglich, die Daten der Arrays auf Proteinebene exemplarisch anhand des Chemokins CXCL2 (Gro-β) zu verifizieren.

Kristallisation der Arbutin-Synthase und der Strictosidin Glukosidase - zwei Enzyme aus dem sekundären Glykosidstoffwechsel von Rauvolfia serpentina

Kristallisation der Arbutin-Synthase und der Strictosidin Glukosidase - zwei Enzyme aus dem sekundären Glykosidstoffwechsel von Rauvolfia serpentina Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Kristallisation und der strukturellen Auswertung der Arbutin-Synthase (AS) und der Strictosidin Glukosidase (SG). Beide Enzyme stammen aus der Medizinalpflanze Rauvolfia serpentina. Für die Kristallisation der Arbutin-Synthase wurden ca. 2500 verschiedene Beding-ungen experimentell untersucht. Für einige dieser Experimente wurde das Enzym molekularbiologisch und chemisch verändert. Trotzdem konnten keine Kristalle erhalten werden. Die bei diesen Veränderungen erhaltenen Ergebnisse wurden anhand von Vergleichen mit Strukturen anderer Glykosyltransferasen der gleichen Familie analysiert. Bei der Reinigung der AS konnte mit verschiedenen Trennsystemen nie eine homogene Lösung produziert werden. Der wahrscheinliche Grund für diese schlechte Isolierbarkeit, und damit der wahrscheinliche Grund für die schwierige Kris-tallisation, liegt in der überdurchschnittlich hohen Anzahl an Cysteinen in der Proteinsequenz. Mit den Aminosäuren Cys171, Cys253 und Cys461 wurden drei Cysteine gefunden, die einem Strukturvergleich nach an der Proteinoberfläche liegen und möglicherweise durch Quervernetzungen mit anderen Proteinmolekülen ein heterogenes Gemisch bilden, das nicht geordnet kristallisieren kann. Durch gezielte Mutationen dieser drei Aminosäuren könnte die Kristallisation zukünftig ermöglicht werden. Für die SG waren bereits Bedingungen bekannt bei denen nicht vermessbare Enzymkristalle (Nadeln) wuchsen. In weit gefächerten Versuchen konnten diese Kristalle jedoch nicht zu 3D-Wachstum angeregt werden. Es wurden mit einem HTS-Screening neue Bedingungen zur Kristallisation gefunden. Anschließend konnten die native Struktur und der Strictosidin/Enzym-Komplex vermessen und aufgeklärt werden. Die SG gehört zur Familie 1 der Glukosidasen (GH-1) und besitzt die in dieser Familie konservierte (beta/alpha)8-Barrel-Faltung. Im Vergleich mit 16 bekannten Glykosidasen der Familie GH-1 wurde die Substratbindung untersucht. Dabei wurde die in der Familie konservierte Zuckerbindung vorgefunden, jedoch große Unterschiede in der Aglykonbindung entdeckt. Es wurden Bedingungen für die Konformationsänderung des Trp388 erkannt. Diese Konformationsänderung dirigiert den Aglykonteil des Substrates auf verschiedene Seiten der Substratbindungstasche und teilt so die Familie GH-1 in zwei Gruppen.

Der Einfluss von Apolipoprotein E auf die zellulären Mechanismen der Alzheimer Erkrankung

Die massive Bildung und Ablagerung von aggregiertem Amyloid Beta-Peptid im Gehirn wird allgemein als zentrales Ereignis im Rahmen des Neurodegenerationsprozesses der Alzheimer Demenz betrachtet. Als einer der ursächlichen Risikofaktoren gilt das Vorliegen des ε4-Allels des Apolipoprotein E. Die Alzheimer´sche Krankheit ist dabei in sehr vielfältige Weise mit Apolipoprotein E verknüpft. ApoE begünstigt isoformenabhängig Aβ-Ablagerungen, ApoE-Fragmente kommen im Gehirn und der Cerebrospinalflüssigkeit von Alzheimer Patienten vor und ApoE ist darüber hinaus als Cholesterintransportprotein über den zellulären Cholesterinstoffwechsel mit der Amyloidbildung verknüpft. Mit Hilfe einer Doppeltransfektion von ApoE und ADAM10 in HEK-Zellen und durch Studien mit Inhibitoren der ADAM-Familie an HepG-2-Zellen wurde in vitro gezeigt, dass ApoE nicht durch α-Sekretasen der ADAM-Familie gespalten wird. Weiterhin konnte bewiesen werden, dass ApoE in Astrogliomazellen keinen Einfluss auf die APP-Prozessierung ausübt. Durch in vitro Modulation des Cholesteringehaltes an Astrogliomazellen mit MβCD und seine Cholesterin-Komplexverbindungen ist gezeigt worden, dass die ApoE-Sekretion durch abnehmenden Cholesteringehalt gesenkt wird. Indem Statine alleine oder in Kombination mit Isoprenylierungssubstraten eingesetzt wurden ist der Beweis erbracht worden, dass Statine in vitro die ApoE-Sekretionsinhibition alleine durch Hemmung der Cholesterinbiosynthese bewirken. Bestätigt wurde dies weiterhin durch Experimente mit Isoprenylierungsinhibitoren. Aus dem Wirkmechanismus von Statinen auf die ApoE-Sekretionssenkung leitet sich womöglich der für bestimmte Statine berichtete neuroprotektive Effekt bei Morbus Alzheimer in retrospektiven Humanstudien ab, der sich durch reine Cholesterinsenkung nicht erklären lässt. Im Zusammenhang mit der Cholesterinhomöostase und dem gesteigerten 24(S)-Hydroxycholesterinspiegel bei Morbus Alzheimer, haben die Ergebnisse gezeigt, dass 24(S)-Hydroxycholesterin [24(S)-OH-chol] zur ApoE-Sekretions- und Expressionssteigerung führt. In dieser Arbeit konnte erstmals der Nachweis erbracht werden, dass der stimulatorische Effekt von 24(S)-OH-Chol durch gleichzeitige Lovastatingabe reduziert werden kann. Dies stellt einen möglichen Ansatz im Kampf gegen die Alzheimer Demenz dar. Weiterführend müssen diese Ergebnisse noch in vivo beispielsweise durch Versuche an ApoE-transgenen Mäusen bestätigt werden. Darüber hinaus könnte nach einer Statintherapie der ApoE-Gehalt in humaner, cerebrospinaler Flüssigkeit ermittelt werden.

Die Bedeutung von NFAT-Transkriptionsfaktoren für die Expression von Mastzell-Cytokinen

Zusammenfassung Die Rolle verschiedener Mitglieder der NFAT- Familie in der Entwicklung von T- Zellen und deren Funktion wird intensiv untersucht, wohingegen vergleichbare Untersuchungen in Mastzellen rar sind. Mastzellen exprimieren eine Vielzahl biologisch hochaktiver Mediatoren und sind auf diese Weise sowohl in angeborenen als auch adaptiven Immunantworten beteiligt. Die von Mastzellen produzierten Th2-Cytokine verstärken lokal Th2- Reaktionen und TNF-alpha ist ein wichtiger Initiator antimikrobieller Antworten. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die Transkriptionsfaktoren NFATc1 und NFATc2 eine bedeutende Rolle in der Regulation der Expression von TNF-alpha und IL-13 einnehmen, wohingegen NFATc3 hierbei keine Funktion zukommt. Murine „Bone marrow derived mast cells“ (BMMC) aus NFATc2- defizienten Mäusen, aktiviert entweder durch Kreuzvernetzung des IgE- Rezeptors oder Ionomycin, zeigen eine drastisch reduzierte Expression dieser Cytokine verglichen mit Mastzellen aus Wildtyp- Mäusen. Genauere Untersuchungen zeigen, dass sowohl NFATc2 als auch NFATc1 an der Expression von IL-13 und TNF-alpha beteiligt sind, wohingegen sie auf die Degranulation und die Expression von IL-6 keinen Einfluss nehmen. Zusammenfassend scheint eine hohe Aktivität von NFAT- Faktoren für die Induktion des IL-13 und TNF-alpha Promoters in Mastzellen erforderlich zu sein, unabhängig davon, ob diese durch NFATc2 oder NFATc1 oder eine Kombination beider Transkriptionsfaktoren bewerkstelligt wird.

Expressions- und Funktionsanalysen von "Tetraspan Vesicle Membrane Proteins" in Caenorhabditis elegans

Tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs) sind ubiquitäre Komponenten von Transportvesikeln. Bei den Säugetieren unterscheidet man drei Familien, die Physine, Gyrine und SCAMPs (secretory carrier-associated membrane proteins). Ihre Funktion ist weitgehend unbekannt, es wird jedoch vermutet, dass sie eine Rolle bei der Vesikelbildung und der Vesikelrezirkulierung spielen. In Caenorhabditis elegans existiert von jeder Familie jeweils nur ein einziges Polypeptid: für die Physine Synaptophysin (SPH-1), für die Gyrine Synaptogyrin (SNG-1) und für die SCAMPs SCAMP (SCM-1). Ziel der Arbeit war es die Verteilung der C. elegans TVPs zu untersuchen und ihre Funktion unter besonderer Berücksichtigung der vesikelvermittelten synaptischen Kopplung zu bestimmen. Wenn die C. elegans TVPs in humanen Epithelzellen synthetisiert werden, lokalisieren sie in zytoplasmatischen Vesikeln. In Kotransfektionsexperimenten wurde gezeigt, dass sie größtenteils in den gleichen Strukturen enthalten sind. In C. elegans synthetisierte TVP-Reporterkonstrukte können in unterschiedlichen Geweben nachgewiesen werden. Dabei ist SNG-1 fast ausschließlich in Neuronen zu finden. SPH-1 und SCM-1 hingegen weisen komplexe und teilweise überlappende Verteilungsmuster auf. Während für SPH-1 eine starke Fluoreszenz im Pharynx, auf der apikalen Seite der Darmzellen oberhalb des sog. terminal webs und in adluminalen Regionen von exkretorischen Geweben gefunden wurde, war SCM-1 stark in der Muskulatur und den Coelomozyten vertreten. Die Expression von SCM-1 in Pharynx und Darm war deutlich schwächer. Die C. elegans TVPs werden früh in der Entwicklung ab der Gastrulation (SPH-1 und SCM-1) bzw. ab der Neurulation im sog. Komma-Stadium (SNG-1) produziert. Um die Funktion der TVPs in C. elegans zu untersuchen, wurden TVP-Mutanten analysiert. Durch Kombination aller drei TVP-Gen-Mutanten wurden TVP-Dreifachmutanten generiert. Diese wiesen keinen offensichtlichen Defekt im Bewegungsmuster auf, entwickelten sich normal und bildeten ein normales Nervensystem aus. Auch auf unterschiedliche chemische und physikalische Reize in sensorischen Tests reagierten die TVP-Dreifachmutanten in gleicher Weise wie Wildtyptiere. Ebenso zeigen die TVP-Dreifachmutanten elektrophysiologisch unter normalen Bedingungen keine anormalen Reaktionsmuster. In ultrastrukturellen Untersuchungen wurde lediglich eine signifikant erhöhte Anzahl Clathrin-ummantelter Vesikel in cholinergen Synapsen gefunden. Erst unter Stressbedingungen, hervorgerufen durch den GABA-Antagonisten Pentylentetrazol (PTZ), wiesen sowohl die TVP-Dreifach- als auch die TVP-Einzelmutanten eine deutlich erhöhte Krampfbereitschaft auf. Zusammengenommen zeigen die Analysen, dass TVPs zwar für grundlegende neuronale Prozesse nicht notwendig sind, dass sie aber auf der anderen Seite vermutlich an alternativen redundanten Wegen der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt sind.

Entwicklung molekularbiologischer Methoden zum Nachweis verschiedener Sclerotiniaceae

Botrytis cinerea ist einer der wichtigsten Phytopathogene, der im Bereich der Weinbereitung als Erreger des Edel- bzw. des Grauschimmels von Trauben eine zentrale Stellung einnimmt. Taxonomisch gehört dieser Organismus zur Familie der Sclerotiniaceae, die ausnahmslos Phytopathogene sind und weltweit große Schäden bei verschiedenen Pflanzen verursachen. Die molekularbiologische Identifikation von Vertretern dieser wichtigen Gruppe von Pflanzenpathogenen ist jedoch bis heute ein Problem. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit als Themenschwerpunkt die zweifelsfreie Identifikation einiger Vertreter der Sclerotiniaceae bearbeitet. Hier konnte von neun verschiedenen Organismen die ‚Internal Transcribed Spacer Region’ identifiziert und zusätzlich zur 18S rDNA für eine sichere Identifikation ausgeschlossen werden. Die Unterscheidung der einzelnen Gattungen und verschiedener B. cinerea-Stämme wurde mit Hilfe der neuartigen nSAPD-PCR Technologie erfolgreich überprüft. Hier konnten die drei Gattungen Botrytis, Monilinia sowie Sclerotinia zweifelsfrei differenziert werden. Ferner konnten von Monilinia fructigena, Sclerotinia minor und Sclerotinia sclerotiorum neue Laccase-Gene identifiziert und komplett sequenziert werden, die homolog zur Laccase2 (lcc2) von B. cinerea sind. Auf Basis dieser Sequenzen bzw. Sequenzunterschiede konnte eine Multiplex-PCR zur zweifelsfreien Identifi-kation dieser Spezies etabliert werden. Im Folgenden konnte dieses System auch an Umweltproben aus der Umgebung von Mainz und Wiesbaden, aus Flomborn (Rheinhessen) sowie aus Stollberg (Sachsen) überprüft werden. Anhand dieser Proben konnte gleichzeitig ein konstantes Vorkommen dieses Gens in allen über-prüften Organismen gezeigt werden. Somit ist es zum ersten Mal möglich, ver-schiedene Spezies der Sclerotiniaceae in einer Probe simultan nachzuweisen und zu differenzieren. Anschließend wurde die Laccase-Expression der jeweiligen Sclerotiniaceae überprüft. Für M. fructigena konnte mindestens eine konstitutiv exprimierte Laccase im Kulturüberstand detektiert werden. Im Gegensatz dazu zeigten weder S. minor noch S. sclerotiorum eine derartige Aktivität. Da B. cinerea lcc2 expri-miert, wurde dies auch für M. fructigena angenommen. Die reverse Transkription der codierenden mRNA konnte jedoch nicht erfolgreich durchgeführt werden. Die Analyse des Genoms von B. cinerea und S. sclerotiorum zeigte zudem 13 bzw. 8 mögliche Laccase-Gene. Somit ist es wahrscheinlich, dass M. fructigena mehr als einen codierenden Bereich für ein derartiges Enzym besitzt und somit eine oder mehrere andere Laccasen exprimiert. Auf Basis der codierenden DNA-Sequenzen konnten EDV-gestützte Prote-incharakterisierungen mit allen neu entdeckten Laccase-Sequenzen durchgeführt werden. Die hier ermittelten Eigenschaften legen den Schluss nahe, dass es sich ausnahmslos um Proteine handelt, die extrazellulär lokalisiert sind. So besitzen alle drei eine identisch lange Signalsequenz, die für die Translokation in die extra-zelluläre Matrix nötig ist. Des Weiteren zeigen alle Laccasen eine schwache Hydrophobizität, so dass davon ausgegangen werden kann, dass diese Enzyme keine membranständigen Proteine sind. Auch konnten zahlreiche Glykosylie-rungspositionen ermittelt werden und bei M. fructigena die Glykosylierung der akti-ven Laccase nachgewiesen werden. Des Weiteren konnten alle konservierten Kupferbindepositionen ermittelt werden. Der Vergleich zur mRNA der Lcc2 von B. cinerea offenbarte die lcc2 von M. fructigena drei nicht-codierende Intronse-quenzen, für S. minor und S. sclerotiorum jedoch lediglich die ersten beiden. Somit bleibt für alle neu identifizierten Sequenzen die Frage nach der Expression offen. Es wurden weder Deletionen von Nukleotiden noch frame-shift Mutationen in den einzelnen Genen gefunden. Auch geben die Signalsequenzen bzw. die ent-haltenen Kupferbindepositionen keine Aufschluss über das Ausbleiben der Ex-pression dieser Gene. Da das von B. cinerea synthetisierte ß-1,3-1,6-Glucan in der Kellerwirtschaft große Filtrationsprobleme verursacht, wurde als ein zusätzlicher Themenschwerpunkt die Lyse dieses Polymers mit symbiontischen Mikroorganismen aus Termitendär-men untersucht. Da Termiten auf den Abbau von Polymeren, wie Cellulose und Hemicellulosen spezialisiert sind, lag die Vermutung nahe, dass auch das ß-Glucan von symbiontischen Mikroorganismen hydrolysiert werden kann. In der hier vorliegenden Arbeit konnte zwar das ß-Glucan erfolgreich herge-stellt und in pulverisierter Form 5 verschiedenen Termitenspezies als Futter ange-boten werden, die anschließende Isolierung der Darmflora und die Untersuchung der isolierten Mikroorganismen auf ein mögliche glucanolytische Aktivität erbrach-te jedoch nicht den erhofften Erfolg. Hier wurden acht verschiedene filamentöse Ascomyceten bzw. Zygomyceten isoliert, eine lytische Aktivität konnte jedoch bei keiner dieser Spezies gezeigt werden.

Evolutionary tendencies in flowers of Marantaceae with special reference to the style movement mechanism

One of the quickest plant movements ever known is made by the ´explosive´ style in Marantaceae in the service of secondary pollen presentation – herewith showing a striking apomorphy to the sister Cannaceae that might be of high evolutionary consequence. Though known already since the beginning of the 19th century the underlying mechanism of the movement has hitherto not been clarified. The present study reports about the biomechanics of the style-staminode complex and the hydraulic principles of the movement. For the first time it is shown by experiment that in Maranta noctiflora through longitudinal growth of the maturing style in the ´straitjacket´ of the hooded staminode both the hold of the style prior to its release and its tensioning for the movement are brought about. The longer the style grows in relation to the enclosing hooded staminode the more does its capacity for curling up for pollen transfer increase. Hereby I distinguish between the ´basic tension´ that a growing style builds up anyway, even when the hooded staminode is removed beforehand, and the ´induced tension´ which comes about only under the pressure of a ´too short´ hooded staminode and which enables the movement. The results of these investigations are discussed in view of previous interpretations ranging from possible biomechanical to electrophysiological mechanisms. To understand furthermore by which means the style gives way to the strong bending movement without suffering outwardly visible damage I examined its anatomical structure in several genera for its mechanical and hydraulic properties and for the determination of the entire curvature after release. The actual bending part contains tubulate cells whose walls are extraordinarily porous and large longitudinal intercellular spaces. SEM indicates the starting points of cell-wall loosening in primary walls and lysis of middle lamellae - probably through an intense pectinase activity in the maturing style. Fluorescence pictures of macerated and living style-tissue confirm cell-wall perforations that do apparently connect neighbouring cells, which leads to an extremely permeable parenchyma. The ´water-body´ can be shifted from central to dorsal cell layers to support the bending. The geometrical form of the curvature is determined by the vascular bundles. I conclude that the style in Marantaceae contains no ´antagonistic´ motile tissues as in Mimosa or Dionaea. Instead, through self-maceration it develops to a ´hydraulic tissue´ which carries out an irreversible movement through a sudden reshaping. To ascertain the evolutionary consequence of this apomorphic pollination mechanism the diversity and systematic value of hooded staminodes are examined. For this hooded staminodes of 24 genera are sorted according to a minimalistic selection of shape characters and eight morphological types are abstracted from the resulting groups. These types are mapped onto an already available maximally parsimonious tree comprising five major clades. An amazing correspondence is found between the morphological types and the clades; several sister-relationships are confirmed and in cases of uncertain position possible evolutionary pathways, such as convergence, dispersal or re-migration, are discussed, as well as the great evolutionary tendencies for the entire family in which – at least as regards the shape of hooded staminodes – there is obviously a tendency from complicated to strongly simplified forms. It suggests itself that such simplifying derivations may very likely have taken place as adaptations to pollinating animals about which at present too little is known. The value of morphological characters in relation to modern phylogenetic analysis is discussed and conditions for the selection of morphological characters valuable for a systematic grouping are proposed. Altogether, in view of the evolutionary success of Marantaceae compared with Cannaceae the movement mechanism of the style-staminode complex can safely be considered a key innovation within the order Zingiberales.