In Situ Effect of Dentifrices Associated to CO2 Laser in the Permeability of Eroded Root Dentin

Objective: The aim of this study was to evaluate, through a crossover 2 x 2 in situ trial, the effect of a desensitizing dentifrice associated with CO2 laser irradiation to control the permeability of eroded root dentin. Background data: Facing the increased prevalence of erosive lesion and the need for preventive means to control painful symptoms related to them. Methods: Eighty slabs of bovine root dentin were subjected to initial erosive challenge (citric acid 0.3%, 2 h), followed by a remineralizing period in artificial saliva (24 h). Specimens were then divided according to dentin treatment: desensitizing dentifrice, desensitizing dentifrice + CO2 laser, fluoride anticavity dentifrice. and fluoride anticavity dentifrice + CO2 laser. After a 2-day lead-in period, 10 volunteers wore an intraoral palatal appliance containing four root dentin slabs, in two phases of 5 days each. During the intraoral phase, one side of the appliance was immersed in 0.3% citric acid, and the opposite side was immersed in deionized water, four times a day. One hour after the immersions, all specimens were brushed with dentifrice slurry provided by the researcher. After a 7-day washout period, volunteers were crossed over on the different dentifrice group. Each phase having been completed, the specimens were evaluated for permeability through an optical microscope. Results: Data were analyzed using ANOVA and no significant difference (p = 0.272) was found between the surface treatments performed on bovine root dentin. Conclusions: It can be concluded that fluoride anticavity or desensitizing dentifrice, regardless of the association with the CO2 laser irradiation, was able to control the permeability of eroded root dentin.

Horizontal gene transfer confers fermentative metabolism in the respiratory-deficient plant trypanosomatid Phytomonas serpens

Among trypanosomatids, the genus Phytomonas is the only one specifically adapted to infect plants. These hosts provide a particular habitat with a plentiful supply of carbohydrates. Phytomonas sp. lacks a cytochrome-mediated respiratory chain and Krebs cycle, and ATP production relies predominantly on glycolysis. We have characterised the complete gene encoding a putative pyruvate/indolepyruvate decarboxylase (PDC/IPDC) (548 amino acids) of P. serpens, that displays high amino acid sequence similarity with phytobacteria and Leishmania enzymes. No orthologous PDC/IPDC genes were found in Trypanosoma cruzi or T. brucei. Conservation of the PDC/IPDC gene sequence was verified in 14 Phytomonas isolates. A phylogenetic analysis shows that Phytomonas protein is robustly monophyletic with Leishmania spp. and C. fasciculata enzymes. In the trees this clade appears as a sister group of indolepyruvate decarboxylases of gamma-proteobacteria. This supports the proposition that a horizontal gene transfer event from a donor phytobacteria to a recipient ancestral trypanosome has occurred prior to the separation between Phytomonas. Leishmania and Crithidia. We have measured the PDC activity in P. serpens cell extracts. The enzyme has a Km value for pyruvate of 1.4 mM. The acquisition of a PDC, a key enzyme in alcoholic fermentation, explains earlier observations that ethanol is one of the major end-products of glucose catabolism under aerobic and anaerobic conditions. This represents an alternative and necessary route to reoxidise part of the NADH produced in the highly demanding glycolytic pathway and highlights the importance of this type of event in metabolic adaptation. (C) 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.

Microelectrode array in mixed alkanethiol self-assembled monolayers: Electrochemical studies

We report an efficient alternative to obtain recessed microelectrodes device on gold electrode surface, in which mixed self-assembled monolayer of long and short carbon alkanethiol chains was used for this purpose. Development of the modified electrodes included the chemical adsorption of 11-mercaptoundecanoic acid and 2-mercaptoethanol solution, as well as their mixtures, on gold surface, resulting in the final mixed self-assembled monolayer configuration. For comparison, the electrochemical performance of self-assembled monolayer of 11-mercaptoundecanoic acid. 3-mercaptopropionic acid, 4-mercapto-1-butanol and 6-mercapto-1-hexanol modified electrodes was also investigated. It was verified that, in the mixed self-assembled monolayer, the 11-mercaptoundecanoic acid acts as a barrier for electron transfer while the short alkanethiol chair is deposited in an island-like shape through which electrons can be freely transferred to ions in solution, allowing electrochemical reactions to occur. The performance of the modified electrodes toward microelectrode behavior was investigated via cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy measurements using [Fe(CN)(6)](3-/4-) redox couple as a probe. In this case, sigmoidal voltammetric responses were obtained, very similar to those observed for microelectrodes. Such behavior reinforces the proposition of electron transfer through the short alkanethiol chain layer and surface blockage by the long chain one. Electrochemical impedance results allowed calculated the mean radius value of each microelectrode disks of 3.8 mu m with about 22 mu m interval between them. The microelectrode environment provided by the mixed self-assembled monolayer can be conveniently used to provide an efficient catalytic conversion in biosensing applications. (C) 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.

CHEMICAL DEGRADATION OF ESFENVALERATE AND HPLC-UV-PAD DETECTION OF INTERMEDIATES AND BY-PRODUCTS

The impact of pyretroids, their by-products and degradation products on humans and the environment is recognized as a serious problem. Despite several studies regarding esfenvalerate toxicity and its detection in water and sediments, there is still a lack of information about its degradation intermediates and by-products in water. In this work, an HPLC method was developed to follow up the degradation of esfenvalerate and to detect the intermediates and by-products formed during the chemical degradation process. The chemical degradation was performed using an esfenvalerate suspension and different concentrations of hydrogen peroxide, temperatures, and pH. The reaction was monitored for 24 hr, and during the kinetic experiments, samples were collected at several reaction times and analyzed by HPLC-UV-PAD. In the degradation process, eleven different compounds (intermediate and by-products) were detected, among them the metabolites 3-phenoxybenzoic acid and 3-phenoxybenzaldehyde. HPLC-UV-PAD proved to be a valuable analytical technique for the rapid and reliable separation and determination of esfenvalerate, its degradation intermediates, and by-products.

Endophytic and rhizospheric enterobacteria isolated from sugar cane have different potentials for producing plant growth-promoting substances

Background and aims Endophytic and rhizospheric environments differ in many respects, leading to the presence of different bacterial communities at each site. However, microorganisms such as enterobacteria can be found both within plants and in the surrounding soil. Bacteria must present differences in the traits that affect such environments in order to successfully colonise them. The present study compared the plant growth-promoting potential of diazotrophic enterobacteria isolated from the rhizosphere and from within surface-disinfected plants. Methods A total of 46 diazotrophic enterobacterial strains (21 rhizospheric and 25 putatively endophytic) belonging to the Klebsiella and Enterobacter genera, which are prevalent in sugar cane plantations, were isolated from the rhizosphere and from surface-disinfected plants. Their ability to synthesise amino acids using combined nitrogen obtained from nitrogen fixation, and their ability to synthesise indole-3-acetic acid (IAA) were determined by high performance liquid chromatography. Endogenous ethylene production by the bacteria was measured using gas chromatography, and biocontrol of phytopathogenic fungi was determined qualitatively using a dual culture technique. Results The putative endophytes released significantly higher amounts of amino acids than the rhizospheric bacteria, whilst the latter produced higher quantities of ethylene and were more actively antagonistic to fungi. Both types of bacteria released similar amounts of IAA. Conclusion Endophytic and rhizospheric bacteria differ in their capacity to release plant growth-promoting substances, which may be a reflection of their adaptations and an indication of their potential impact on their natural environment.

Dynamics of adventitious rooting in mini-cuttings of Eucalyptus benthamii x Eucalyptus dunnii

It is possible to determine the optimum time for permanence of vegetative propagules (mini-cuttings) inside a greenhouse for rooting, and this value can be used to optimize the structure of the nursery. The aim of this study was to determine the dynamics of adventitious rooting in mini-cuttings of three clones of Eucalyptus benthamii x Eucalyptus dunnii. Sprouts of H12, H19 and H20 clones were collected from mini-stumps that were planted in gutters containing sand and grown in a semi-hydroponic system. The basal region of the mini-cuttings was immersed in 2,000 mg L-1 indole-3-butyric acid (IBA) solution for 10 seconds. The rooting percentage of the mini-cuttings, the total length of the root system and the rooting rate per mini-cutting were also evaluated at 0 (time of planting), 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 and 56 days. We used logistic and exponential regression to mathematically model the speed of rhizogenesis. The rooting percentage was best represented as a logistic model, and the total length of the root system was best represented as an exponential model. The clones had different speeds of adventitious rooting. The optimum time for permanence of the mini-cuttings inside the greenhouse for rooting was between 35 and 42 days, and varied depending on the genetic material.

Isolation and characterisation of aerobic endospore forming Bacilli from sugarcane rhizosphere for the selection of strains with agriculture potentialities

Eighteen aerobic endospore forming strains were isolated from sugarcane rhizosphere in N-free medium. A phenotypic description and analysis of the 5' end hypervariable region sequences of 16S rRNA revealed a high diversity of Bacillus and related genera. Isolates were identified, and four genera were obtained: seven strains belonged to Bacillus (Bacillaceae family), four belonged to Paenibacillus, six belonged to Brevibacillus and one strain was identified as Cohnella (Paenibacillaceae family). Four Brevibacillus strains showed in vitro inhibitory activity against plant pathogens fungi Curvularia and Fusarium. Seventy-four percent of the isolated bacteria grew on pectin as the only carbon source, showing polygalacturonase activity. Pectate lyase activity was detected for the first time in a Brevibacillus genus strain. All isolates showed endoglucanase activity. Calcium phosphate solubilisation was positive in 83.3% of the isolates, with higher values than those reported for Bacillus inorganic phosphate solubilising strains. High ethylene plant hormone secretion in the culture medium was detected in 22% of the bacteria. This is the first report of ethylene secretion in Paenibacillaceae isolates. Indole-3-acetic acid production was found in a Brevibacillus genus isolate. It was reported for the first time the presence of Cohnella genus strain on sugarcane rhizosphere bearing plant growth promoting traits. The sugarcane isolate Brevibacillus B65 was identified as a plant growth inoculant because it showed wider spectra of plant stimulation capabilities, including an antifungal effect, extracellular hydrolases secretion, inorganic phosphate solubilisation and plant hormone liberation. In this work, sugarcane was shown to be a suitable niche for finding aerobic endospore forming 'Bacilli' with agriculture biotechnological purposes.

Iron(III) porphyrin covalently supported onto magnetic amino-functionalized nanospheres as catalyst for hydrocarbon and herbicide oxidations

This work describes the covalent immobilization of an ironporphyrin, 5,10,15,20- tetrakis(pentafluorophenyl)porphyrin iron(III) chloride (FeTFPP), onto maghemite/silica magnetic nanospheres covered with aminofunctionalized silica. The resulting material (γ-Fe2O3/SiO2-NHFeP) was characterized by diffuse reflectance infrared spectroscopy (DRIFTS) and UV-Vis absorption spectroscopy. The catalytic activity of this magnetic ironporphyrin was investigated in the oxidation of hydrocarbons (styrene, (Z)-cyclooctene and R-(+)-limonene) and an herbicide (simazine) by hydrogen peroxide or 3-chloroperoxybenzoic acid. Hydrocarbon and simazine oxidation reaction products were analyzed by gas chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC), respectively. This catalytic system proved to be efficient and selective for hydrocarbon oxidation, leading to high product yields from styrene (89%), cyclooctene (71%) and R-(+)-limonene (86%). Simazine oxidation was attained with 100% selectivity for a dechlorinated product (OEAT), while several oxidation products were obtained for the same catalyst in homogeneous media. The catalyst can be easily recovered through application of an external magnetic field and washed after reaction. Catalyst reuse experiments for R-(+)-limonene oxidation have shown that the catalytic activity is kept at 90% after 10 consecutive reactions.

Untersuchungen zur Genexpression in Wurzeln der reblausresistenten Unterlagsrebsorte ’Börner’

Die reblausresistente Unterlagsrebsorte ’Börner’ reagiert auf einen Reblausbefall mit einer Hypersensitivitätsreaktion (HR), die sich in Form von Nekrosen an Blättern und Wurzeln zeigt. Im Rahmen dieser Dissertation wurde der Resistenzmechanismus mittels differenzieller Genexpressionsanalysen untersucht. Unter Anwendung der suppressiven subtraktiven Hybridisierung, der DNA-Microarraytechnik sowie der GeneFishingTM-Methode erfolgte ein Vergleich zwischen der Genexpression in hypersensitivem Wurzelgewebe und Normalgewebe der Unterlagsrebe ’Börner’. Neben der Reblaus induzierten HR wurde insbesondere auf die experimentelle Induktion durch das Pflanzenhormon Indol-3-Essigsäure (IES) zurückgegriffen. Damit sollten Kenntnisse über die Rolle der IES als auslösender Faktor der Resistenzreaktion gewonnen werden. Die Ergebnisse bestätigen die Annahme, dass die IES Pathogenabwehrreaktionen in ’Börner’ induziert. So konnten Hinweise auf die transkriptionelle Aktivierung Resistenz und HR assoziierter Proteine gefunden werden, wie z.B. Phytoalexine und pathogen-related (PR)-Proteine sowie Vertreter aus der hypersensitive-induced response-Familie. Es konnten weiterhin wertvolle Informationen im Hinblick auf die Transduktion des IES-Signals im Zusammenhang mit der Aktivierung von Resistenzreaktionen gewonnen werden. So wurden Hinweise auf die Beteiligung der Signalsubstanzen Ethylen, Salicylsäure, Jasmonsäure, Calcium sowie reaktiver Sauerstoffspezies gefunden. Es konnten zudem Anhaltspunkte für die Aktivierung des Auxin induzierten Ubiquitin/26S-Proteolyseweges und weiterer Signalkomponenten, wie z.B. Kinasen und Transkriptionsfaktoren, ermittelt werden. Auch auf die Beteiligung von Auxinrezeptoren konnte aufgrund der Resultate geschlossen werden. Damit war es im Rahmen der Dissertation möglich, potenzielle Signaltransduktionswege zu erarbeiten, die für weiterführende Untersuchungen des Reblausresistenzmechanismus von entscheidender Bedeutung sind.

Photofixierung von Lipidmembranen aus Glykolipopolymeren auf Goldoberflächen

Ziel war Herstellung und Charakterisierung festkörperunterstützter Membransysteme aus Glykolipopolymeren auf Goldoberflächen, mit elektrischen Eigenschaften, die denen der Schwarzfilmmembranen entsprechen. Um diese Eigenschaften mit impedanzspektroskopischen Techniken messen zu können, ist die Präparation der Membranen auf Goldfilmen notwendig. Eine direkte Verankerung der Glykolipopolymermoleküle (GLP) auf der Goldoberfläche ist nicht möglich, daher werden die untersuchten GLP mit Hilfe von photoreaktiven Molekülen kovalent auf der Goldoberfläche immobilisiert. Untersuchten Abstandhalter waren Thio-Polyethylenglykol und eine Mischung zweier Alkanthiole, bestehend aus 1-Thiohexanol und Bis-(Aminododecyl)-disulfid. Thio-PEG-Monoschichten zeigten sehr unterschiedliche Schichtdicken, weil die Moleküle auf der Oberfläche sehr unterschiedliche Konformationen annehmen können, die eine regelmässige Anordnung erschweren. Langmuir-Blodgett Übertrag sowie die durchgeführte photochemische Fixierung der GLP-Moleküle auf Thio-PEG Schichten führte zu Eigenschaften, die auf den Aufbau einer Lipidmonolage hinweisen. Diese stellte jedoch im Bereich der Lipidmoleküle keine geschlossene Schicht dar. Es kommen als Abstandhaltermoleküle für die Photofunktionalisierung nur Moleküle in Frage, die aufgrund ihrer Eigenschaften eine regelmässige Anordnung auf der Goldoberfläche anstreben. Diese Voraussetzung erfüllt am besten die Gruppe der Alkanthiole. Terminal funktionalisierte Alkanthiole müssen jedoch mit nicht oder anderweitig funktionalisierten Alkanthiolen verdünnt assembliert werden, um weitergehende Funktionalisierungen einzugehen. Die untersuchten GLP lassen sich aufgrund ihrer amphiphilen Struktur an der Wasser-Luft Grenzfläche vororientieren. In allen Fällen gelingt auch der Langmuir-Blodgett Übertrag der komprimierten Schicht, sowie, nach der für die Anbindung notwendigen Trocknung, die photochemisch kovalente Fixierung der Monoschicht durch Bestrahlung mit UV-Licht. Damit konnte erstmals die photochemisch kovalente Fixierung von GLPs auf der Goldoberfläche gezeigt werden. Untersuchungen erfolgten an einem Copolymer sowie zwei unterschiedlichen Homopolymermolekülen. Der unterschiedliche molekulare Aufbau der GLP spiegelt sich in ihrem Verhalten an der Wasser-Luft Grenzfläche sowie in den Eigenschaften der gebildeten Monoschichten wieder. Die Copolymer-Schichten zeigten sehr unterschiedliche Schichtdicken. Auch die EIS-Daten sind schlecht reproduzierbar. Dies ist auf die molekulare Struktur des Copolymers zurückzuführen. Gänzlich unterschiedlich verhalten sich die Homopolymere. Aufgrund ihrer Struktur lassen sie sich zu dichten Schichten komprimieren. Messungen der Fluoreszenzerholung nach Photobleichung (FRAP) zeigen homogene aber nicht fluide Schichten. Die photochemisch kovalente Fixierung des Moleküls auf der Goldoberfläche konnte durch SPR- sowie EIS-Messungen nachgewiesen werden. Die EIS-Messungen zeigen Werte, die sich in Bereichen der idealen Modellmembran bewegen. Der erfolgreiche Einbau von Valinomycin konnte bestätigt werden. FRAP Untersuchungen zeigten die Bildung homogener Schichten. Diese sind jedoch im Bereich der proximalen Lipidschicht nicht fluide. Um die Fluidität in Anlehnung an die Eigenschaften der natürlichen Membranen zu erhöhen, wurden die photochemisch kovalent fixierten Anker-Glykolipopolymer-Moleküle durch Mischung mit freien Lipiden lateral verdünnt. Auch die kovalente Fixierung der GLP-Bausteine innerhalb gemischten Schichten konnte erfolgreich demonstriert werden. Die Schichten zeigten sich jedoch, mit Ausnahme der Schichten aus 50mol% Homopolymer und 50mol% Lipid, inhomogen. Nach Photobleichung durch den Laserblitz kam es nur bei den 50mol%:50mol% -Schichten (Ho: Lipid) zur Erholung der Fluoreszenz, was auf das Vorliegen von beweglichen Lipidmolekülen innerhalb der Membran schliessen lässt. Der Versuch der Inkorporation von Valinomycin gelang ebenfalls. Alle genannten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die molekulare Architektur der hergestellten Schichten durch die unterschiedlichen Längendimensionen des Homopolymer-Moleküls einerseits, sowie des Lipids andererseits nicht für alle Mischungsverhältnisse ausreichend stabil ist. Die für die kovalente Fixierung erforderliche Trocknung der Schicht führt zu einer deutlichen Verminderung des Wassergehaltes des Systems und einer daraus resultierenden starken Destabilisierung der aufgebauten Schichten. Insgesamt gesehen stellt somit die photochemische Fixierung der glykosidischen Homopolymer-Membranen ein vielversprechendes Modellsystem dar.

Mechanische Eigenschaften von freitragenden artifiziellen und nativen Membranen

This thesis presents a new method to explore the local mechanical properties such as bending modulus or surface tension of artificial and native pore-spanning membranes. Therefore the elastic response of a free-standing membrane to a local indentation by the means of atomic force microscopy is measured. Starting point are highly hexagonal ordered pores in alumina produced by electrochemical anodization of planar aluminium. The homogeneous pore radius can by tailored in the range of 10 nm up to 200 nm, but radius of 33 nm, 90 nm and 200 nm turned out to be best suited for investigation of the mechanical properties of pore-spanning native or artificial membranes. In this work artificial membrane systems consisting of DODAB as a bilayer in gel phase or DOTAP as a fluide membrane are spreaded by vesicle absorption on hexagonal structured pores after chemisorption of a 3-mercaptopropionic acid monolayer. Centrally indenting these nanodrums with an atomic force microscope tip yields force-indentation curves, which are quantitatively analyzed by solving the corresponding shape equations of continuum curvature elasticity. Since the measured response depends in a known way on the system geometry (pore size, tip radius) and on material parameters (bending modulus, lateral tension, adhesion), this opens the possibility to monitor local elastic properties of lipid membranes in a well-controlled setting. Additionally the locally distributed mechanical properties of pore-spanning artificial membranes are compared to those of native pore-spanning membranes. Therefore the basal membrane of MDCK II cells was prepared on porous alumina assays and their mechanical properties were analyzed by means of atomic force microscopy. Finally the elastic behavior such as the Young modulus of living MDCK II cells under various osmotic pressures is investigated. By changing the osmolarity in the extracellular region of MDCK II cells a volume change is induced according to hydration and dehydration of the cells, respectively. This volume change induces also a change in the elastic behavior of the cell, which is quantified by the means of force spectroscopy.

Aufbau und Kupplung von Schlüsselintermediaten zur enantioselektiven Steroidsynthese

Steroide sind im Organismus weit verbreitete, vielfältig substituierte Naturstoffe mit einem breiten biologischen Wirkungsspektrum. C/D-cis-verknüpfte Steroide kommen in der Natur zwar selten vor, sie sind aber in ihrer pharmakologischen Aktivität nicht weniger interessant. Total- bzw. Partialsynthesen sind bisher in der Literatur kaum beschrieben worden. Die Arbeit beschäftigt sich mit grundlegenden Reaktionen zur enantioselektiven Synthese eines 13,14-cis-verknüpften Steroids. Als Fernziel wurde C/D-cis-verknüpftes Östradiol ausgewählt mit der Option, das Substitutionsmuster dieses Steroids vielfältig variieren zu können. Der Syntheseplan beinhaltet zunächst den Aufbau des Kohlenstoffgerüsts im Sinne einer konvergenten Synthese, abschließende Cyclisierungen sollten dann das vollständige Molekül ergeben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst das C/D-Ringfragment als Allylamin hergestellt. Das Amin ist dabei als chirales Auxiliar ausgelegt. Als A,B-Ringfragment wurden eine Reihe 4-Aryl-2,3-ungesättigte Carbonsäurefluoride synthetisiert. Im Verknüpfungsschritt, einer zwitterionischen Aza-Claisen-Umlagerung, konnten nun beide Fragmente mit hoher simpler, aber mäßiger induzierter Diastereoselektivität gekuppelt werden. Das Entfernen der Doppelbindung im Produkt erwies sich als erhebliche Hürde, die jedoch durch die Verwendung eines Enolethers genommen werden konnte. Das im Rahmen der Arbeit hergestellte Material sollte nun in wenigen Stufen zum C/D- cis-verknüpften Steroid umgesetzt werden können.

Modulation der Genexpression und des neuronalen Zelltods durch das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP)

Das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) spielt eine zentrale Rolle in der Entstehung und Entwicklung von Morbus Alzheimer. Hierbei ist die proteolytische Prozessierung von APP von entscheidender Bedeutung. Das Verhältnis von neurotoxischen und neuroprotektiven Spaltprodukten, die über den amyloidogenen und nicht-amyloidogenen Weg der APP-Prozessierung gebildeten werden, ist für das Überleben von Neuronen und deren Resistenz gegen zytotoxische Stress-Stimuli von hoher Relevanz. Störungen der Calcium-Homöostase sind ein bekanntes Phänomen bei Morbus Alzheimer. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von überexprimiertem APP in der Regulation des neuronalen Zelltods nach Calcium Freisetzung untersucht. Die Calcium Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum wurde durch die Inhibition der sarko- und endoplasmatischen Calcium-ATPasen (SERCA) ausgelöst. Dies führt zur Induktion der sogenannten „unfolded protein response“ (UPR) und zu einer Aktivierung von Effektor-Caspasen. Für APP-überexprimierende PC12 Zellen konnte bereits zuvor eine im Vergleich zur Kontrolle nach der durch Calcium Freisetzung-induzierten Apoptose eine erhöhte intrazelluläre Calcium Konzentration nachgewiesen werden. Über die Messung der Aktivierung von Effektor-Caspasen konnte zudem ein gesteigerter Zelltod in den APP-überexprimierenden Zellen gemessen werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass der pro-apoptotische Transkriptionsfaktor CHOP, nicht aber die klassischen UPR-Zielgene spezifisch hochreguliert wurden. Die APP-modulierte gesteigerte Induktion von Apoptose nach Calcium Freisezung konnte durch Komplexierung der intrazellulären Calcium Ionen und durch Knockdown von CHOP im Vergleich zur Kontrolle gänzlich unterdrückt werden. Ferner bewirkte die Inhibition der Speicher-aktivierten Calcium-Kanälen (SOCC) eine signifikante Unterdrückung der beobachteten erhöhten intrazellulären Calcium Konzentration und der gesteigerten Apoptose in den APP-überexprimierenden PC12 Zellen. In diesem Teil der Arbeit konnte eindeutig gezeigt werden, dass APP in der Lage ist den durch Calcium-Freisetzung-induzierten Zelltod zu potenzieren. Diese Modulation durch APP verläuft in einer UPR-unabhängigen Reaktion über die Aktivierung von SOCC’s, einer erhöhten Aufnahme von extrazellulärem Calcium und durch erhöhte Induktion des pro-apoptotischen Transkriptionsfaktors CHOP. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die sAPPα-vermittelte Neuroprotektion untersucht. Dabei handelt es sich um die N-terminale Ektodomäne von APP, die über die Aktivität der α-Sekretase prozessiert wird und anschließend extrazellulär abgegeben wird. Ziel dieser Versuchsreihe war die neuroprotektive physiologische Funktion von APP im Hinblick auf den Schutz von neuronalen Zellen vor diversen für Morbus Alzheimer relevanten Stress-Stimuli bzw. Apoptose-Stimuli zu untersuchen. Durch die Analyse der Effektor-Caspasen konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist PC12 Zellen potent vor oxidativem Stress, DNA-Schäden, Hypoxie, proteasomalem Stress und Calcium-Freisetzung zu schützen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist den pro-apoptotischen Stress-induzierten JNK/Akt-Signalweg zu inhibieren. Eine Beteiligung des anti-apoptotischen PI3K/Akt-Signalwegs bei der sAPPα-vermittelten Protektion konnte über die Inhibition der PI3-Kinase ebenfalls demonstriert werden, die eine Aufhebung der sAPPα-vermittelten Neuroprotektion bewirkte. Diese Daten zeigen neue molekulare Mechanismen auf, die dem sAPPα-vermittelten Schutz vor pathophysiologisch relevanten Stress-Stimuli in neuronalen Zellen zugrunde liegen. Im letzten Teil der Arbeit wurden verschieden Gruppen von pharmakologischen Substanzen im Hinblick auf ihre neuroprotektive Wirkung untersucht und mit ihren Effekten auf den APP-Metabolismus korreliert. Die Untersuchungen ergaben, dass Galantamin, ein schwacher Acetycholinesterase Inhibitor und allosterisch potenzierender Ligand von nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren in der Lage war, naive, und mit noch höherer Effizienz APP-überexprimierende Zelllinien vor dem Stress-induzierten Zelltod zu schützen. Zudem bewirkte Galantamin in APP-überexprimierenden HEK293 Zellen eine rasche Erhöhung der sAPPα Sekretion, so dass hier von einer Rezeptor-vermittelten Modulation des APP Metabolismus ausgegangen werden kann. Omega-3 Fettsäuren wirken sich positiv auf die Membranfluidität von Zellen aus und es konnte bereits gezeigt werden, dass die Bildung des toxischen Aβ Peptids hierdurch vermindert wird. In Analogie zu Galantamin schützte die Omega-3 Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) neuronale Zellen vor dem Stress-induzierten Zelltod, wobei der Schutz in APP-überexprimierenden Zellen besonders effizient war. Diese Daten legen nahe, dass die Aktivierung des antiamyloidogenen Wegs der APP-Prozessierung ein viel versprechender Ansatz für die Entwicklung neuer Therapien gegen Morbus Alzheimer sein könnte.

Water-soluble organic compounds in air particulate matter analyzed by HPLC-DAD-MS and HPLC-MS/MS: abundance, sources and transformation of carboxylic acids, nitrophenols and nitrated proteins

Wasserlösliche organische Verbindungen (WSOCs) sind Hauptbestandteile atmosphärischer Aerosole, die bis zu ~ 50% und mehr der organischen Aerosolfraktion ausmachen. Sie können die optischen Eigenschaften sowie die Hygroskopizität von Aerosolpartikeln und damit deren Auswirkungen auf das Klima beeinflussen. Darüber hinaus können sie zur Toxizität und Allergenität atmosphärischer Aerosole beitragen.In dieser Studie wurde Hochleistungsflüssigchromatographie gekoppelt mit optischen Diodenarraydetektion und Massenspektrometrie (HPLC-DAD-MS und HPLC-MS/MS) angewandt, um WSOCs zu analysieren, die für verschiedene Aerosolquellen und -prozesse charakteristisch sind. Niedermolekulare Carbonsäuren und Nitrophenole wurden als Indikatoren für die Verbrennung fossiler Brennstoffe und die Entstehung sowie Alterung sekundärer organischer Aerosole (SOA) aus biogenen Vorläufern untersucht. Protein-Makromoleküle wurden mit Blick auf den Einfluss von Luftverschmutzung und Nitrierungsreaktionen auf die Allergenität primärer biologischer Aerosolpartikel – wie Pollen und Pilzsporen – untersucht.rnFilterproben von Grob- und Feinstaubwurden über ein Jahr hinweg gesammelt und auf folgende WSOCs untersucht: die Pinen-Oxidationsprodukte Pinsäure, Pinonsäure und 3-Methyl-1,2,3-Butantricarbonsäure (3-MBTCA) sowie eine Vielzahl anderer Dicarbonsäuren und Nitrophenole. Saisonale Schwankungen und andere charakteristische Merkmale werden mit Blick auf Aerosolquellen und -senken im Vergleich zu Daten anderen Studien und Regionen diskutiert. Die Verhätlnisse von Adipinsäure und Phthalsäure zu Azelainsäure deuten darauf hin, dass die untersuchten Aerosolproben hauptsächlich durch biogene Quellen beeinflusst werden. Eine ausgeprägte Arrhenius-artige Korrelation wurde zwischen der 3-MBTCA-¬Konzentration und der inversen Temperatur beobachtet (R2 = 0.79, Ea = 126±10 kJ mol-1, Temperaturbereich 275–300 K). Modellrechnungen zeigen, dass die Temperaturabhängigkeit auf eine Steigerung der photochemischen Produktionsraten von 3-MBTCA durch erhöhte OH-Radikal-Konzentrationen bei erhöhten Temperaturen zurückgeführt werden kann. Im Vergleich zur chemischen Reaktionskinetik scheint der Einfluss von Gas-Partikel-Partitionierungseffekten nur eine untergeordnete Rolle zu spielen. Die Ergebnisse zeigen, dass die OH-initiierte Oxidation von Pinosäure der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Bildung von 3-MBTCA ist. 3-MBTCA erscheint somit als Indikator für die chemische Alterung von biogener sekundärer organischer Aerosole (SOA) durch OH-Radikale geeignet. Eine Arrhenius-artige Temperaturabhängigkeit wurde auch für Pinäure beobachtet und kann durch die Temperaturabhängigkeit der biogenen Pinen-Emissionen als geschwindigkeitsbestimmender Schritt der Pinsäure-Bildung erklärt werden (R2 = 0.60, Ea = 84±9 kJ mol-1).rn rnFür die Untersuchung von Proteinnitrierungreaktionen wurde nitrierte Protein¬standards durch Flüssigphasenreaktion von Rinderserumalbumin (BSA) und Ovalbumin (OVA) mit Tetranitromethan (TNM) synthetisiert.Proteinnitrierung erfolgt vorrangig an den Resten der aromatischen Aminosäure Tyrosin auf, und mittels UV-Vis-Photometrie wurde der Proteinnnitrierungsgrad (ND) bestimmt. Dieser ist definiert als Verhältnis der mittleren Anzahl von Nitrotyrosinresten zur Tyrosinrest-Gesamtzahl in den Proteinmolekülen. BSA und OVA zeigten verschiedene Relationen zwischen ND und TNM/Tyrosin-Verhältnis im Reaktionsgemisch, was vermutlich auf Unterschiede in den Löslichkeiten und den molekularen Strukturen der beiden Proteine zurück zu führen ist.rnDie Nitrierung von BSA und OVA durch Exposition mit einem Gasgemisch aus Stickstoffdioxid (NO2) und Ozon (O3) wurde mit einer neu entwickelten HPLC-DAD-¬Analysemethode untersucht. Diese einfache und robuste Methode erlaubt die Bestimmung des ND ohne Hydrolyse oder Verdau der untersuchten Proteine und ernöglicht somit eine effiziente Untersuchung der Kinetik von Protein¬nitrierungs-Reaktionen. Für eine detaillierte Produktstudien wurden die nitrierten Proteine enzymatisch verdaut, und die erhaltenen Oligopeptide wurden mittels HPLC-MS/MS und Datenbankabgleich mit hoher Sequenzübereinstimmung analysiert. Die Nitrierungsgrade individueller Nitrotyrosin-Reste (NDY) korrelierten gut mit dem Gesamt-Proteinnitrierungsgrad (ND), und unterschiedliche Verhältnisse von NDY zu ND geben Aufschluss über die Regioselektivität der Reaktion. Die Nitrierungmuster von BSA und OVA nach Beahndlung mit TNM deuten darauf hin, dass die Nachbarschaft eines negativ geladenen Aminosäurerestes die Tyrosinnitrierung fördert. Die Behandlung von BSA durch NO2 und O3 führte zu anderend Nitrierungemustern als die Behandlung mit TNM, was darauf hindeutet, dass die Regioselektivität der Nitrierung vom Nitrierungsmittel abhängt. Es zeigt sich jedoch, dass Tyrosinreste in Loop-Strukturen bevorzugt und unabhängig vom Reagens nitriert werden.Die Methoden und Ergebnisse dieser Studie bilden eine Grundlage für weitere, detaillierte Untersuchungen der Reaktionskinetik sowie der Produkte und Mechanismen von Proteinnitrierungreaktionen. Sie sollen helfen, die Zusammenhänge zwischen verkehrsbedingten Luftschadstoffen wie Stickoxiden und Ozon und der Allergenität von Luftstaub aufzuklären.rn

Enantioselektive Organokatalyse in Epoxidierungen und Cyanhydrinbildungen

In der vorliegenden Arbeit mit dem Titel „Enantioselektive Organokatalyse in Epoxidierungen und Cyanhydrinbildungen“ wurde die Synthese zweier Cyclophan-carbaldimine durchgeführt. Beide Verbindungen bestehen aus einem Glykosyl-Baustein und einem Paracyclophan-Baustein, die über eine Imin-Bindung verbrückt sind. Die Cyclophan-carbaldimine wurden dann als Katalysatoren in einer Reihe von enantioselektiven Reaktionen verwendet. Enantioselektive Reaktionen bilden von zwei spiegelbildlichen Produkten stets eines im Überschuss. Zu diesen Reaktionen zählen die in dieser Arbeit durchgeführten enantioselektiven Epoxidierungen und enantioselektiven Cyanhydrinsynthesen. Die enantioselektiven Epoxidierungen waren dabei als Teil der Totalsynthesen der Naturstoffe Dasyscyphin D und Caripyrin geplant. Diese beiden Naturstoffe zeigten in biologischen Tests am Institut für Biotechnologie und Wirkstoffforschung (IBWF) in Kaiserslautern Aktivität gegen den Reisbrand-Pilz Magnaporthe grisea, der für Ernteverluste in beträchtlichem Ausmaß verantwortlich ist. Das Caripyrin selbst beinhaltet eine Epoxidstruktur. Mittels der oben angeführten Katalysatoren wurde versucht, diese Epoxidstruktur selektiv einzuführen. Dies gelang nicht, aber der Naturstoff konnte mittels Epoxidierung durch m-Chlorperbenzoesäure erstmals dargestellt werden. In mehreren biologischen Vergleichstests am IBWF Kaiserslautern zeigte auch das synthetische Caripyrin mit dem natürlichen Caripyrin vergleichbare biologische Aktivität.rnDas Dasyscyphin D an sich trägt keine Epoxidfunktion. Dennoch spielt sie auch hier eine wichtige Rolle. Innerhalb der geplanten Totalsynthese von Dasyscyphin D sollte die Farnesylseitenkette eines aromatischen Ringes selektiv epoxidiert werden. Durch einen elektrophilen Angriff an dieses Epoxid sollte im Anschluss eine Cyclisierung zum Dasyscyphin-Grundgerüst eingeleitet werden, aus dem dann Dasyscyphin D dargestellt werden sollte. Im Gegensatz zur Caripyrin-Synthese, bei der die selektive Epoxidierung nicht gelang, scheint sie in der Synthese von Dasyscyphin D sattgefunden zu haben, allerdings ist eine Isolierung des Reaktionsproduktes noch nicht gelungen. Folglich konnte das Dasyscyphin D noch nicht erfolgreich synthetisiert werden.rnDie Versuche zur enantioselektiven Cyanhydrin-Synthese waren nicht Bestandteil einer Totalsynthese. Die Cyanhydrine wurden zuerst als Racemate synthetisiert und gaschromatographisch vermessen, um auf diese Weise die exakten Retentionszeiten der einzelnen Enantiomere zu ermitteln. Anschließend wurden die Cyanhydrine dann enantioselektiv dargestellt und ebenfalls gaschromatographisch vermessen. Durch den Vergleich mit den racemischen Cyanhydrinen konnte dabei direkt aus der Reaktionslösung gemessen werden, was erforderlich war, da eine Isolierung der Cyanhydrine unter den gewählten Reaktionsbedingen nicht gelang. Aus den gaschromatographischen Messungen konnten Enantiomerenüberschüsse von bis zu 95 % ermittelt werden. Weiterhin ergaben die Messungen, dass der Arabinosyl-Katalysator im Vergleich mit dem Galactosyl-Katalysator eine geringere Enantioselektivität induziert, was vermutlich auf leichte räumliche Differenzen der beiden Katalysatoren zurückzuführen ist. Ein weiteres wichtiges Ergebnis war, dass beide Katalysatoren, wie geplant, unterschiedliche Enantiomere im Überschuss bilden. Die Glykosyl- und Paracyclophan-Bausteine der beiden Katalysatoren waren so gewählt worden, dass beide Katalysatoren pseudo-Enantiomere bilden. Auf diese Weise sollte eine Einflussnahme auf das gebildete Enantiomer durch die Wahl des entsprechenden Cyclophan-carbaldimin-Katalysators möglich gemacht werden, was, wie bereits erwähnt, gelang.rn