Improving safety and establishing episomal maintenance of Adeno-associated viral vectors

Adeno-associated viral (AAV) vectors are among the most widely used gene transfer systems in basic and pre-clinical research and have been employed in more than 160 clinical trials. AAV vectors are commonly produced in producer cell lines like HEK293 by co-transfection with a so-called vector plasmid and one (in this work) or two so-called helper plasmids. The vector plasmid contains the transgene cassette of interest (TEC) flanked by AAV’s inverted terminal repeats (ITRs) which serve as packaging signals, whereas the helper plasmid provides the required AAV and helper virus functions in trans. A pivotal aspect of AAV vectorology is the manufacturing of AAV vectors free from impurities arising during the production process. These impurities include AAV vector preparations that contain capsids containing prokaryotic sequences, e.g. antibiotic resistance genes originating from the producer plasmids. In the first part of the thesis we aimed at improving the safety of AAV vectors. As we found that encapsidated prokaryotic sequences (using the ampicillin resistance gene as indicator) cannot be re-moved by standard purification methods we investigated whether the producer plasmids could be replaced by Minicircles (MCs). MCs are circular DNA constructs which contain no functional or coding prokaryotic sequences; they only consist of the TEC and a short sequence required for production and purification. MC counterparts of a vector plasmid encoding for enhanced green fluorescent (eGFP) protein and a helper plasmid encoding for AAV serotype 2 (AAV2) and helper Adenovirus (Ad) genes were designed and produced by PlasmidFactory (Bielefeld, Germany). Using all four possible combinations of plasmid and MCs, single-stranded AAV2 vectors (ssAAV) and self-complementary AAV vectors (scAAV) were produced and characterized for vector quantity, quality and functionality. The analyses showed that plasmids can be replaced by MCs without decreasing the efficiency of vector production and vector quality. MC-derived scAAV vector preparations even exceeded plasmid-derived preparations, as they displayed up to 30-fold improved transduction efficiencies. Using MCs as tools, we found that the vector plasmid is the main source of encapsidated prokaryotic sequences. Remarkably, we found that plasmid-derived scAAV vector preparations contained a much higher relative amount of prokaryotic sequences (up to 26.1 %, relative to TEC) compared to ssAAV vector preparations (up to 2.9 %). By replacing both plasmids by MCs the amount of functional prokaryotic sequences could be decreased to below the limit of quantification. Additional analyses for DNA impurities other than prokaryotic sequences showed that scAAV vectors generally contained a higher amount of non-vector DNA (e.g. adenoviral sequences) than ssAAV vectors. For both, ssAAV and scAAV vector preparations, MC-derived vectors tended to contain lower amounts of foreign DNA. None of the vectors tested could be shown to induce immunogenicity. In summary we could demonstrate that the quality of AAV vector preparations could be significantly improved by replacing producer plasmids by MCs. Upon transduction of a target tissue, AAV vector genomes predominantly remain in an episomal state, as duplex DNA circles or concatemers. These episomal forms mediate long-term transgene expression in terminally differentiated cells, but are lost in proliferating cells due to cell division. Therefore, in the second part of the thesis, in cooperation with Claudia Hagedorn and Hans J. Lipps (University Witten/Herdecke) an AAV vector genome was equipped with an autonomous replication element (Scaffold/matrix attachment region (S/MAR)). AAV-S/MAR encoding for eGFP and a blasticidin resistance gene and a control vector with the same TEC but lacking the S/MAR element (AAV-ΔS/MAR) were produced and transduced into highly proliferative HeLa cells. Antibiotic pressure was employed to select for cells stably maintaining the vector genome. AAV-S/MAR transduced cells yielded a higher number of colonies than AAV-ΔS/MAR-transduced cells. Colonies derived from each vector transduction were picked and cultured further. They remained eGFP-positive (up to 70 days, maximum cultivation period) even in the absence of antibiotic selection pressure. Interestingly, the mitotic stability of both AAV-S/MAR and control vector AAV-ΔS/MAR was found to be a result of episomal maintenance of the vector genome. This finding indicates that, under specific conditions such as the mild selection pressure we employed, “common” AAV vectors persist episomally. Thus, the S/MAR element increases the establishment frequency of stable episomes, but is not a prerequisite.

Rôle de SOCS1 dans l’immunogénicité de la tumeur en particulier au niveau du carcinome hépatocellulaire

Résumé : Le carcinome hépatocellulaire (HCC) est la troisième cause commune de décès de cancer et affecte plus les hommes que les femmes. Le HCC résulte d’une dérégulation des voies de signalisation impliquées dans l’initiation de l’inflammation menant ainsi à des répercussions désastreuses. De part la complexité de ce type de cancer, les traitements qui existent à ce jour ne sont pas très prometteurs et ont un faible pourcentage de « rémission ». L’immunothérapie soulève beaucoup d’espoir quant à l’orientation vers un traitement efficace plausible. En effet, plusieurs suppresseurs de tumeur se retrouvent réprimés, parmi lesquels le SOCS1. C’est dans cette optique que nos recherches se sont orientées en mettant la lumière sur le SOCS1 «suppresseur de signalisation des cytokines 1 (SOCS1) » qui est réprimé au niveau du HCC et dont la restauration pourrait contribuer à un pronostic favorable à la rémission. La protéine SOCS1 a beaucoup attisé la curiosité des chercheurs de part son rôle suppresseur de tumeur. Pour comprendre les mécanismes d’action de SOCS1 et son implication dans la neutralisation de la tumeur, nous avons généré trois types stables de la lignée cellulaire du carcinome hépatocellulaire de souris Hepa1-6, une portant un vecteur vide, l’autre exprimant le type sauvage du gène SOCS1 (SOCS1-WT; Hepa-S) et une portant une mutation au niveau du domaine SH2 (SOCS1-R105K; Hepa-R). Le mutant ne peut plus inhiber la signalisation des cytokines. Lors de l'implantation sous-cutanée des cellules Hepa1-6 modifiées, chez des souris C57BL/6 et NOD.scid.gamma (NSG). Nous avons observé que les cellules Hepa1-6 exprimant le vecteur de contrôle (Hepa-V) formaient de grosses tumeurs tandis que les cellules Hepa-S formaient de petites tumeurs chez les deux types de souris. Les cellules Hepa-R quant à elles, formaient de grosses tumeurs seulement chez des souris immunodéficientes (NSG) mais montraient une croissance nettement retardée lorsqu’elles étaient greffées aux souris (C57BL/6) immunocompétentes. Partant de ce constat intrigant, nous avons postulé que SOCS1 favorise l'immunogénicité des cellules tumorales par son domaine SOCS Box. Par conséquent, les cellules Hepa-R offrent une occasion unique de démêler le potentiel pro-immunogène de SOCS1, et ceci dans le but d'élucider les fonctions immunogènes de SOCS1 dans le cancer du foie. Jusqu'à présent aucune précédente recherche ne s’est aventurée à chercher l’implication de SOCS1 dans l’augmentation de l’immunogénicité.

Revisión del uso de los medicamentos biosimilares vs. biológicos: implicaciones para la salud en Colombia.

Este documento tiene como objetivo describir las implicaciones para la salud con el uso de medicamentos biosimilares en comparación con los medicamentos biológicos en Colombia. Así mismo, describir el contexto normativo acerca del uso de medicamentos biosimilares, las recomendaciones y lineamientos sobre seguridad y efectividad del uso de medicamentos Biosimilares y Biológicos, partiendo de sus diferencias biomoleculares. Para esto, se desarrolló una revisión documental electrónica y manual de la literatura en bases de datos, revistas y libros limitada a términos MeSH. La selección de los artículos incluyo documentos completos publicados en revistas indexadas de los últimos 10 años, en español e inglés; la información recolectada se organizó para la construcción del presente documento. Concluyendo, se encontró que las patentes de muchos medicamentos biológicos han vencido o están próximas a caducar y varios biosimilares están desarrollándose y comercializándose incluso en países sin regulaciones estrictas. Los biosimilares nunca podrán ser iguales al original por su complejidad molecular, por ello debemos integrarlos a los sistemas de farmacovigilancia mejorando trazabilidad e identificando su origen mientras se establecen denominaciones comunes distinguibles. La evidencia actual sugiere que la regulación de medicamentos biosimilares debe ser evaluada y armonizada en todo el mundo.

Factores asociados a respuesta de abatacept subcutaneo en artritis reumatoide

INTRODUCCION Dado que la artritis reumatoide es la artropatía inflamatoria más frecuente en el mundo, siendo altamente discapacitante y causando gran impacto de alto costo, se busca ofrecer al paciente opciones terapéuticas y calidad de vida a través del establecimiento de un tratamiento oportuno y eficaz, teniendo presentes aquellos predictores de respuesta previo a instaurar determinada terapia. Existen pocos estudios que permitan establecer aquellos factores de adecuada respuesta para inicio de terapia biológica con abatacept, por lo cual en este estudio se busca determinar cuáles son esos posibles factores. METODOLOGIA Estudio analítico de tipo corte transversal de 94 pacientes con diagnóstico de AR, evaluados para determinar las posibles variables que influyen en la respuesta a terapia biológica con abatacept. Se incluyeron 67 de los 94 pacientes al modelo de regresión logística, que son aquellos pacientes en que fue posible medir la respuesta al tratamiento (respuesta EULAR) a través de la determinación del DAS 28 y así discriminar en dos grupos de comparación (respuesta y no respuesta). DISCUSION DE RESULTADOS La presencia de alta actividad de la enfermedad al inicio de la terapia biológica, aumenta la probabilidad de respuesta al tratamiento respecto al grupo con baja/moderada actividad de la enfermedad; OR 4,19 - IC 95%(1,18 – 14.9), (p 0,027). La ausencia de erosiones óseas aumenta la probabilidad de presentar adecuada respuesta a la terapia biológica respecto aquellos con erosiones, con un OR 3,1 (1,01-9,55), (p 0,048). Niveles de VSG y presencia de manifestaciones extra-articulares son otros datos de interés encontrados en el análisis bivariado. Respecto a las variables o características como predictores de respuesta al tratamiento con abatacept, se encuentran estudios que corroboran los hallazgos de este estudio, respecto al alto puntaje del DAS 28 al inicio de la terapia (9, 12). CONCLUSIONES Existen distintas variables que determinan la respuesta a los diferentes biológicos para manejo de AR. Es imprescindible evaluar dichos factores de manera individual con el fin de lograr de manera efectiva el control de la enfermedad y así mejorar la calidad de vida del individuo (medicina personalizada). Existen variables tales como la alta actividad de la enfermedad y la ausencia de erosiones como predictores de respuesta en la terapia con abatacept.

Estudio de las modificaciones conformacionales y su influencia en la actividad inmunológica de péptidos derivados de las familias de las proteínas spect-1 y -2, siap-1 y -2 de plasmodium falciparum

SPECT-1 y -2 y SIAP-1 y -2 son proteínas pertenecientes al esporozoíto de Plasmodium falciparum causante de la malaria más agresiva en los humanos. Estas proteínas están involucradas en el paso del parásito a través de las células del hospedero humano y en la invasión del hepatocito, haciéndolas blancos atractivos para ser estudiadas. Péptidos conservados de alta capacidad de unión (cHABPs) a células HeLa y HepG2 derivados de estas moléculas son no inmunogénicos porque son incapaces de generar una respuesta inmunitaria, pero son claves para el parásito porque cumplen una función importante durante la infección del hospedero humano. En este trabajo se encontró que algunos cHABPs pertenecientes a las proteínas SPECT-1 y -2, están posiblemente involucrados con la unión y formación de poros sobre la membrana de las células hospederas, ayudando al esporozoíto a abrirse paso través de las células del hospedero. Por otro lado, con el fin de cambiar el comportamiento inmunológico de cHABPs derivados de SPECT-1 y -2 y SIAP-1 y -2, se obtuvieron nuevos péptidos mediante el reemplazo de aminoácidos críticos por otros residuos cuya masa molecular sea similar, pero diferente en su polaridad. En este trabajo se reporta que dichas modificaciones promovieron cambios en la estructura secundaria (determinada por DC o 1H-RMN) de los péptidos modificados (mHABPs) cuando se comparó con la estructura de los cHABPs nativos; adicionalmente, estos mHABPs invirtieron su comportamiento inmunológico convirtiéndose en péptidos inmunogénicos inductores de anticuerpos. Lo que permite establecer la existencia de una relación entre la estructura que adoptan estos mHABPs con su actividad inmunológica. Además, algunos de los mHABPs estudiados aquí, pueden ser candidatos a ser incluidos en la vacuna contra la malaria químicamente sintetizada multi-epitope y multi-estadio que se está desarrollando en la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia (FIDIC).

Estudio conformacional de péptidos modificados de las proteínas STARP, CelTOS, TRSP y SERA 5 de Plasmodium falciparum y su relación con una respuesta inmune en malaria

El desarrollo de una vacuna contra malaria es un área de exploración activa pero con enormes retos debido especialmente a la complejidad del ciclo del parásito. Así, es necesario bloquear las diferentes etapas de la invasión que tiene el Plasmodium falciparum y extraer de ellas la mayor información posible de la artillería que utiliza para su ataque. Para esto, péptidos de las proteínas STARP, CelTOS y TRSP (del esporozoito) y SERA 5 (del merozoito) que tienen alta afinidad de unión a células HepG2 y a glóbulos rojos respectivamente (conocidos como cHABPs), han sido modificados (conocidos como mHABPs), sintetizados y evaluados a nivel de respuesta inmune en monos Aotus así como estudiados en su conformación estructural por RMN de 1H. Los resultados muestran que los péptidos nativos no son inmunogénicos, pero pueden inducir altos títulos de anticuerpos cuando sus residuos críticos o sus vecinos son reemplazados por otro con un volumen y masa similar, pero diferente polaridad. El estudio conformacional pone de manifiesto que las estructuras de los péptidos nativos son diferentes de sus péptidos modificados ya sea que muestren regiones estructuradas más cortas o más largas o que no presenten ninguna, en comparación con sus análogos modificados altamente inmunogénicos. Las características estereoquímicas particulares en las cadenas laterales de algunos residuos de aminoácidos de estos péptidos modificados así como los rasgos fisicoquímicos parecen jugar un rol importante en la respuesta inmune apropiada cuando estos fueron inmunizados en grupos de monos Aotus confiriendo un avance al diseño de una vacuna contra malaria totalmente eficaz.