青蒿素生物合成相关基因的功能分析及遗传转化研究

从中国传统药用植物青蒿（Artemisia annua L.）中提取的青蒿素及其半合成衍生物如蒿甲醚等是一类新型的抗疟特效药，特别是对抗氯喹的恶性疟疾和脑型疟疾有很好的疗效。由于青蒿素在植物中的含量极低，使得其价格很高，特别是对于亚非拉等第三世界国家来说。因此如何提高青蒿素的产量成为近年来研究的热点。各种传统的育种、生理生化手段和细胞培养技术均未取得较好的结果，因此，利用植物基因工程技术提高青蒿素产量已成为研究的重点之一。 本论文围绕青蒿素的生物合成途径开展了以下的工作： 一、中药青蒿紫穗槐二烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定 利用RT-PCR方法，从中药青蒿高产株系001中克隆到的中药青蒿紫穗槐二烯合酶(ADS) cDNA, 其推测编码蛋白与前人报道的有两个位点的突变。将其开放阅读框插入到原核表达载体pET30a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建N端携带有HIS6表达标签的紫穗槐二烯合酶重组表达载体pETADS。将pETADS转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta -D-thiogalactoside)诱导重组紫穗槐二烯合酶的表达。表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（含FPP），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示重组紫穗槐二烯合酶可以催化FPP向紫穗槐二烯的转化。体外酶促动力学分析表明，两个位点的氨基酸突变，并没有影响到青蒿紫穗槐二烯合酶的催化活性。基因组DNA杂交表明，紫穗槐二烯合酶基因在001株系基因组中至少有4个拷贝。 二、中药青蒿鲨烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定 将经RACE方法克隆到的中药青蒿鲨烯合酶cDNA(AF302464) 开放阅读框的3'末端截短99 bp，插入到原核表达载体pET30a(+)的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的鲨烯合酶重组表达载体pETSSA。将pETSSA转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta-D-thio galactoside)诱导重组鲨烯合酶的表达。表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（含FPP和NADPH），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示重组鲨烯合酶可以催化FPP向鲨烯的转化。青蒿鲨烯合酶的功能鉴定，为进一步利用反义或RNAi技术限制甾类生物合成，从而提高青蒿中的青蒿素含量提供了基础。 三、中药青蒿法呢醇合酶原核表达、纯化与功能鉴定 将经RACE方法克隆到的中药青蒿倍半萜合酶cDNA ( AF304444) 开放阅读框插入到原核表达载体pET30a(+)的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的重组表达载体pET30SESQ。将pET30SESQ转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta-D-thioga lactoside)诱导蛋白表达，表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（FPP），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示此重组酶可以催化FPP向法呢醇的转化。 四、中药青蒿FPS、ADS双功能酶基因的构建、表达与功能鉴定 将青蒿素生物合成途径中催化两步连续反应的酶：法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶的基因进行融合，经大肠杆菌表达后鉴定融合蛋白的功能，结果表明融合蛋白具有了双功能酶活性。进一步将融合酶基因转入酿酒酵母中，发酵后检测紫穗槐二烯的含量，并与同时转入法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶单个基因的酵母、单独转入紫穗槐二烯合酶基因的酵母进行了比较，结果表明，转入双功能酶的酵母发酵获得的紫穗槐二烯含量要比两个对照酵母高，这表明，获得的双功能酶的催化效率要比两个单独酶的催化效率高。 五、过量表达青蒿紫穗槐二烯合酶对青蒿中青蒿素及其前体物含量的影响 利用根癌农杆菌介导，将青蒿紫穗槐二烯合酶转入青蒿株系001，分子检测证明，紫穗槐二烯合酶整合到了青蒿基因组中并在mRNA水平得到了高效表达。部分转基因青蒿的青蒿素含量有明显增加，最多的比001株系提高了41%。青蒿酸和二氢青蒿酸含量测定表明，转基因青蒿株系的青蒿酸和二氢青蒿酸含量最多的比对照分别提高了47%和79%。这些结果表明，紫穗槐二烯合成在青蒿素生物合成途径中是一个限速步骤，同时，也显示青蒿酸或二氢青蒿酸的进一步转化也可能是青蒿素生物合成中下游的限速步骤。

水稻减数分裂基因OsDMC1的功能研究

减数分裂是有性生殖物种世代交替的转折点;减数分裂不仅维持了基因组的稳定性，而且通过重组创造了遗传多样性。在减数分裂过程中，DNA复制一次后进行两次连续的细胞分裂。第二次减数分裂与有丝分裂类似，涉及到姊妹染色单体的分离;而第一次减数分裂是独一无二的，在这次分裂中同源染色体分离。为保证同源染色体的准确分离，同源染色体在减数分裂前期I通过一系列复杂的过程结合在一起形成稳定的二价体。这些复杂的前期I事件包括同源配对、联会和重组。分子遗传学、细胞学和生物化学研究已经表明酵母DMC1基因在减数分裂重组、配对和联会过程中起了重要作用。OsDMC1基因是酵母DMC1基因在水稻中的同源基因。本课题应用RNA干扰技术分析了该基因在水稻生长发育过程中的功能。利用本实验室设计的RNAi工具载体pWTC605构建OsDMC1-RNAi载体;并通过农杆菌介导的水稻愈伤组织转化法获得了转基因株系;进而通过PCR和Southern杂交鉴定筛选出阳性的OsDMC1-RNAi株系。OsDMC1-RNAi株系的营养生长正常，但结实率显著降低;成熟花粉的Alexander染色显示这些OsDMC1-RNAi株系的花粉是败育的。通过内源OsDMC1基因表达量的半定量RT-PCR、Western杂交分析以及OsDMC1特异性small RNA的Northern杂交鉴定，证实OsDMC1-RNAi株系的不育表型与RNA干扰介导的内源OsDMC1 mRNA和蛋白水平的降低是相关的。进一步深入的细胞学观察显示，OsDMC1基因的knockdown导致OsDMC1-RNAi株系的雄性减数分裂异常，表现为二价体形成缺陷、染色体不等分分离和异常四分体的产生;OsDMC1基因的knockdown同时还诱导了雄性减数分裂进程的改变。荧光原位杂交实验揭示OsDMC1-RNAi株系的减数分裂同源配对过程是缺陷的。这些研究结果表明OsDMC1基因是水稻减数分裂的必需基因，该基因在减数分裂同源配对过程中起了重要作用。

太行花TrMADS3基因的结构、功能和进化研究

休眠是温带多年生植物的特性之一。为了适应温带地区寒冷的冬季，多年生植物的分生组织通常在秋末冬初进入休眠状态，这样有利于它们在低温下的存活。因此，温带多年生植物的生长和开花具有季节性。植物的生长发育需要与季节的交替变化同步，才能适应环境，保证繁殖成功。多年生植物通过“生长－休眠－生长”的循环过程适应温带地区寒冷的冬季。休眠既有利于植物存活又可调节开花时间。因此，探索温带多年生植物休眠过程的分子调控机理具有重要的应用价值。 太行花（Taihangia rupestris）是蔷薇科仙女木族的一种多年生草本。它生长在海拔1000到1200米的温带山区。太行花需要两个生长季节才能开花，这一点与模式植物拟南芥、水稻不同。在第一个生长季节花芽诱导，花序发育到秋末冬初时进入休眠状态;过冬花序包裹在叶柄基部，接近土壤表面;到了第二个生长季节，花进一步发育完全，开花结果。休眠过程对太行花花序的存活以及来年的开花时间控制非常关键，对这个过程的调控基因的研究不仅有助于理解太行花休眠的分子机制，还将为其它经济植物在这个方面的研究提供资料。 本研究以太行花为研究材料，从它的过冬花序中分离得到了一个MADS-box基因，分析了它的序列结构、系统发育关系、表达式样和功能，探讨了FLC亚家族基因在太行花这种多年生植物和一年生、两年生植物之间发生的表达功能分化。主要研究结果包括： 1. 从太行花的过冬花序中分离出了TrMADS3基因。氨基酸序列分析结果表明它是MIKCc型MADS-box基因，系统发育分析结果表明TrMADS3与FLC类基因聚在一起。 2. 实时定量PCR和RT-PCR实验显示TrMADS3在冬季休眠期太行花的花序、根、叶中广泛表达。从十月底到一月底的冬季低温期户外太行花植株中TrMADS3表达量比同期温室植株的表达量高，也比夏季户外植株的表达量高。对温室植株进行低温处理能明显上调TrMADS3的表达量，而短光照、干旱、高盐和脱落酸（ABA）处理对TrMADS3的表达影响不明显。 3. 用原位杂交的方法分析了TrMADS3的表达式样。营养器官中，TrMADS3在营养顶端分生组织、叶原基、幼叶边缘细胞中表达量高;生殖器官中，TrMADS3在侧生分生组织、花序原基、花原基、幼苞片、萼片原基、花瓣原基、雄蕊原基、心皮原基、发育中的雄蕊、心皮中表达量高。TrMADS3的表达模式反映了TrMADS3调控营养生长和不同阶段的花序、花发育过程。 4. TrMADS3在拟南芥中异位表达不影响拟南芥开花时间。在高盐和干旱胁迫条件下，TrMADS3异位表达能够明显提高转基因拟南芥后熟种子的萌发率。 5. 建立了太行花的组培体系。 综上所述，TrMADS3属于FLC进化支，这一亚家族基因还未在多年生植物中报道。TrMADS3在太行花休眠期表达量很高。在实验控制条件下，一至两周低温能够明显促进TrMADS3表达量的上调。低温处理后回到生长温度的太行花在一月内依然保持较高的TrMADS3的表达。原位杂交实验显示TrMADS3在营养和生殖分生组织中表达量高。TrMADS3在拟南芥中异位表达促进后熟种子在高盐和干旱胁迫下萌发。因此，我们推测TrMADS3具有响应低温调节太行花休眠期营养和生殖分生组织活性的功能。在一、二年生植物中分离的FLC-like基因响应春化作用，具有抑制花芽诱导的保守功能，这些基因在营养器官中表达，受春化作用调节，对应一、二年生植物的成花诱导受春化作用促进的过程，但TrMADS3在太行花营养和生殖器官中均表达，对应太行花花芽诱导后营养和生殖器官均进入休眠状态的生理特性，因此，我们推测FLC-like基因有可能在太行花这种温带多年生植物和一、二年生植物之间发生功能分化。

水稻AP2/EREBP转录因子基因OsDRE和OsRAF的功能分析

AP2是一个大的转录因子家族，因其成员含有一个60-70 个氨基酸残基的保守结构域即AP2结构域而得名，它们的功能涉及植物花的发育以及植物对生物或非生物逆境的应答反应。根据它们所含的AP2 结构域的数目，这个家族可分为AP2亚家族和EREBP 亚家族。 AP2亚家族成员含两个AP2结构域，EREBP 亚家族成员含一个AP2结构域。一般来说，AP2 亚家族的成员主要参与植物发育过程的调控;EREBP 亚家族成员则主要参与对逆境的应答反应。按照它们响应外界刺激的类型和AP2结构域中结合顺式作用元件的核心氨基酸的不同，EREBP亚家族又可分为ERF和CBF/DREB两大类群，ERF 类主要响应生物类逆境的诱导，CBF/DREB类则响应干旱、低温等非生物胁迫的刺激。 根据AP2保守结构域搜索，水稻基因组中一共有147个AP2/EREBP成员，但其中功能得到证实的还非常有限。为了解更多AP2基因在植物生长发育过程中的功能，我们先从水稻基因组数据库中搜索到含有AP2/EREBP 结构域的推测基因序列，选择其中40个扩增并成功扩增出31个，将这些DNA片段点在尼龙膜上，然后用水稻叶片cDNA 作模板标记探针，与固定在膜上的推测基因杂交。杂交结果作为选择基因进行功能分析的重要依据。 OsDRE就是我们选择进行研究的一个表达较强的基因。首先，通过RACE 克隆得到OsDRE 的cDNA全长 1589bp，它编码318个氨基酸。Blast 搜索和保守结构域序列比对分析以及进化树分析显示它是一个新的ERF 基因。RT-PCR分析表明该基因在水稻各种组织中表达量比较一致，而且，OsDRE 既不对植物生长物质如乙烯，水杨酸（SA），茉莉酸甲酯（MJ），脱落酸（ABA），赤霉素（GA3），油菜素内酯（BR）的诱导起反应，同样也不响应环境因子如低温、干旱条件的处理。这些结果说明OsDRE是一个不响应胁迫相关因素的诱导的、组成型表达的水稻基因。用OsDRE的非保守区域构建的RNAi 载体转入水稻后未能使转基因水稻产生异常表型，然而，OsDRE在水稻和拟南芥中的过量表达都导致转基因植物出现植株矮小、开花延迟、生长周期延长以及育性降低等表型，说明OsDRE对生长和发育的影响在水稻和拟南芥中是一致的。 基于以上原因，我们选择在遗传分析方面有明显优势的拟南芥作为材料，对OsDRE基因功能进行研究并得出以下结论：（1）瞬时表达和随后的过量表达证明OsDRE定位于细胞核中，过量表达OsDRE引起转基因植株的生长周期变长、抽苔时间延迟和抽苔时莲座叶的数量增多;（2）过量表达OsDRE通过一种不影响细胞数量的方式抑制了细胞的膨胀从而导致植物器官以致整个植株变小，而且，在此过程中部分器官的形态也受到了影响;（3）OsDRE过量表达能激活已知位于乙烯信号途径下游的基因表达并且转基因植株幼苗在黑暗中出现下胚轴及根缩短变粗的现象，提示OsDRE 可能部分参与了乙烯信号途径下游的反应。 除此之外，我们还初步分析了另一个EREBP基因，并将其命名为OsRAF。氨基酸序列分析表明该基因与大麦的RAF 基因在蛋白水平上相似性最高。Northern 杂交结果进一步显示，与RAF 一样，OsRAF 也是根中优势表达的基因，并且它的表达量在乙烯或低温的诱导下增加。对转基因植株的观察和瞬时表达表明OsRAF 定位于细胞核中。 综上所述，对水稻基因OsDRE 和OsRAF的分析表明， OsDRE是一个新的ERF基因，它不受乙烯等因素的诱导并且过量表达该基因导致转基因植株出现细胞膨胀受到抑制等一系列的表型。另外，OsRAF在水稻根中优势表达并受乙烯和低温的诱导，目前，与之相关的功能研究正在进行。

水稻RAD21/REC8家族基因OsRAD21-3的功能研究

有丝分裂和减数分裂包含一系列协同作用的事件，姊妹染色体的黏着是其中非常重要的一个环节。通过对芽殖酵母的研究发现姊妹染色体的黏着是由一个多亚基的蛋白复合体——黏着素介导的，在有丝分裂过程中，黏着素由Scc1（裂殖酵母中为Rad21）、Scc3、Smc1和Smc3四个亚基组成，而在减数分裂中Scc1被其同源蛋白Rec8所取代。通过对其它真核生物包括线虫、果蝇、爪蟾、鼠、人以及拟南芥等进行的研究显示，黏着素介导的姊妹染色体黏着的基本机制在真核生物中具有保守性，但在不同的物种中，其具体的分子机制还存在着差异。开花植物的有性生殖过程包含了一个非常特殊的花粉发育阶段，其间发生了两次花粉的有丝分裂，对其我们还知之甚少。Rad21/Rec8作为黏着素的重要组分，对水稻中它的同源蛋白进行深入研究可以帮助我们对植物有丝分裂和减数分裂的染色体黏着机制有进一步的了解。 我们发现在水稻基因组中存在4个编码Rad21/Rec8家族蛋白的基因，其中OsRAD21-3位于水稻第8号染色体上，其编码的蛋白与其它的Rad21/Rec8家族蛋白一样，具有保守的N-和C-末端结构域。序列比对和进化分析的结果表明OsRad21-3蛋白属于Rad21亚家族，而免疫荧光定位分析显示OsRad21-3可以特异地定位于有丝分裂的染色体上，由此说明OsRAD21-3应当是酵母RAD21的直系同源基因。对OsRAD21-3进行半定量RT-PCR，Western杂交以及原位杂交的结果显示它在生殖器官花中优势表达，在营养器官中也能检测到表达。在花中它在从雌雄蕊形成期到成熟花粉期都有表达，其表达的位置主要位于减数分裂时期的小孢子母细胞以及减数分裂后的小孢子和花粉中。在水稻四个RAD21/REC8基因中，OsRAD21-3是唯一一个在花粉发育过程中表达的基因，说明它可能在减数分裂后的雄配子体发育过程中发挥了功能。 采用RNAi手段对OsRAD21-3的功能进行研究发现OsRAD21-3 RNAi转基因水稻植株的育性显著下降，进一步的分析表明其花粉活性受到严重影响。对OsRAD21-3i株系的雄性减数分裂过程及减数分裂后的小孢子和花粉发育过程进行观察发现，减数分裂过程中有少量细胞存在染色体的异常行为，但总体上没有对雄性减数分裂造成严重影响，而减数分裂后的小孢子和花粉发育过程则出现了显著异常，表现为花粉有丝分裂的停滞或有丝分裂染色体分离的扰乱，因此，OsRAD21-3应当主要是通过在花粉的有丝分裂过程中发挥功能而参与减数分裂后的雄配子体发育过程，而它在雄性减数分裂过程中可能也有一定作用。 利用原位杂交技术分析了水稻另外三个RAD21/REC8基因的表达特性，结果表明OsRAD21-1、OsRAD21-2和OsRAD21-4都在减数分裂前及减数分裂期的小孢子母细胞中表达，但在减数分裂后较晚时期的小孢子中则没有检测到表达。OsRAD21-4在小孢子母细胞中的表达为其参与减数分裂过程染色体的黏着提供了证据，而OsRAD21-1和OsRAD21-2在此过程中的功能还有待进一步研究。此外，OsRAD21-1和OsRAD21-2还在营养器官有丝分裂旺盛的区域表达，OsRAD21-1作为RAD21的同源基因可能与OsRAD21-3在参与有丝分裂染色体黏着方面存在功能上的冗余性，但OsRAD21-3参与花粉的发育过程则是其所特有的，这可能也在一定程度上说明了为什么水稻中会存在4个RAD21/REC8基因，并帮助我们更好地了解了它们在功能上的分化。

油菜素内酯信号转导相关基因的克隆、鉴定和功能分析

油菜素甾醇类(Brassinosteroids，BRs)是一类新的植物内源激素，在植物整个生长发育周期中发挥着很重要的作用。拟南芥中BR信号转导途径基本清晰，从膜受体BRI1到细胞质中的负调控因子BIN2，再到核内的转录因子BZR1和BES1。但是从BR信号感知到细胞质内的传递，再到细胞核内的调控特异基因的表达都还有很多问题有待于进一步的探索。 本研究运用激活标签pDSK15-11对大约5000株拟南芥bzr1-1D进行了转化, 得到抗性植株约50000株，构建了一个拟南芥激活标签突变体库，从中筛选到和BR相关的突变体七个，并对其中的B26和B16突变体进行了详细的分析。此外还筛选到若干个和BR没有关系的突变体，并对其中的一个表皮毛缺陷的突变体B11进行了分析。 B26是一株恢复了bzr1-1D茎叶处打弯表型的突变体，并且具有矮化、叶色深绿、晚花等特点。B26部分抑制了bzr1-1D对BR合成抑制剂BRZ的不敏感性，但仍然对BR超敏感。BR上调的基因SAUR-AC1在bzr1-1D中表达上升，而在B26突变体中SAUR-AC1的表达量比bzr1-1D中有所下降。B26突变体显示的表型是依赖于bzr1-1D突变的。我们通过T-DNA侧翼序列，RT-PCR，以及重现实验证实造成突变表型的基因，并命名为BZS1。BZS1编码一个B类锌指蛋白，在植物发育的各个时期各个器官中都有表达。亚细胞定位分析显示BZS1定位于细胞质和细胞核中，以上这些结果说明BZS1可能在BR信号途径中是位于BZR1的下游，作为一个负的调节因子调控下游BR反应基因的表达。 B16是从突变体库中筛选得到的一个叶柄明显增长，营养生长期延长，开花晚，结实率比较低的突变体。T-DNA侧翼序列和基因表达分析显示B16突变体中T-DNA插入点附近的一个基因表达量升高，这一基因被命名为BZE1。BZE1编码一个含有bHLH结构域的蛋白。BZE1 RNAi转基因植株的叶柄比对照明显变短，说明BZE1调控叶柄的伸长。在B16突变体中，CPD和DWF4的表达较bzr1-1D中增强了，而SAUR-AC1的表达减弱了，这一结果说明BZE1过表达减弱了BZR1对CPD的反馈抑制。Pro35S:BZE1 /bzr1-1D转基因植株对BRZ的敏感度与bzr1-1D相似。BR不调节BZE1的转录水平，却可以促进BZE1蛋白在核内积累。这些结果都说明BR处理不改变BZE1的转录水平，只是通过促进BZE1在核内的积累增加，从而参与调控下游基因的表达，如CPD。随着这些突变体研究的进一步深入，将有助于我们更好的理解BR信号转导途径。 B11是一个叶片（包括莲座叶和茎生叶）和茎表皮毛缺失，但根毛发育正常的突变体，T-DNA侧翼序列和基因表达分析显示B11突变体表型是由于ETL1的过量表达造成的。ETL1可能是一个表皮毛特异表达的基因，对根毛的发育影响不大。功能缺失突变体etl1-1和野生型拟南芥具有相似的表皮毛数量和分布，根毛的数量和分布也没有明显的变化，这就说明ETL1可能与其他同源基因功能冗余。ETL1在gl1中表达量增加，由此推测ETL1在表皮毛的发育中可能起负调控的作用。

青蒿素生物合成相关基因对烟草遗传转化的研究

　　青蒿素是存在于中药青蒿(Artemisia annua L.)中的一种含有过氧桥的倍半萜内酯化合物，是中国科学家研发出的当今最有潜力的抗疟药剂，较传统抗疟药很少或无毒副作用，因此青蒿素的生产备受人们关注。目前，青蒿素的生产主要以植物提取为主，但由于青蒿植株中青蒿素的含量很低（约占干重的0.01%～0.8%），从而导致青蒿素价格昂贵，使许多贫困地区的疟疾患者无法得到医治，故提高青蒿植株中青蒿素的含量或扩大青蒿素的来源，降低生产青蒿素的成本具有重要的意义。　　 　　本论文基于扩大青蒿素的来源和提高青蒿植株中青蒿素含量的目的，开展了以下两方面的工作： 一、紫穗槐二烯在烟草中组合生物合成的研究 　　紫穗槐二烯合酶（amorpha-4,11-diene synthase，ADS）是青蒿素生物合成的关键酶之一，为了能在烟草中合成青蒿素的前体，本研究将青蒿的紫穗槐二烯合酶基因置于CaMV 35S启动子控制下，通过根癌农杆菌介导转入烟草（Nicotiana tobacum L.），并获得了转ADS基因烟草植株。经PCR及Southern杂交分析表明，ADS基因已经整合到转基因烟草基因组中；RT-PCR及对转基因烟草中ADS酶活性和产物中紫穗槐二烯和植物甾醇的测定分析，进一步证明整合的ADS基因在转录、翻译水平上均已经表达。上述结果表明，利用基因工程将青蒿素生物合成途径的关键酶基因导入植物，转基因植物中能够合成青蒿素的前体，这一研究结果为利用转基因植物生产青蒿素或其前体奠定了基础。 二、青蒿鲨烯合酶双链干涉基因对烟草的遗传转化研究 　　鲨烯合酶（squalene synthase, SQS）是甾醇类生物合成分支途径的关键酶之一，利用RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)抑制目标基因表达的技术已日趋成熟。本文根据植物中hpRNA(hairpin RNA)的原理，在与烟草SQS同源性高达80％的青蒿ASQS序列的5/端保守区选择622 bp作为构建RNAi的序列，借助中间克隆载体，经过三次亚克隆，最后形成含ASQS－RNAi表达盒的双元表达载体pART27－ASQS，并转入农杆菌EHA105。采用农杆菌介导的烟草叶盘转化法，共获得了12棵转基因植株。转基因植株经过PCR和PCR-Southern blotting 检测，证实外源ASQS基因已经导入烟草中，并已经成功整合到烟草基因组中；通过RT-PCR分析说明，转基因烟草中SQS基因的表达已被成功抑制，部分转基因植株中内源SQS的干扰效果高达90％以上。对SQS的直接产物鲨烯和最终产物植物甾醇的检测显示，转基因烟草的植物甾醇和鲨烯的含量明显低于对照。本实验的结果为下一步将此RNA干扰载体导入青蒿，抑制青蒿中ASQS基因的表达，从而提高青蒿素的含量提供了可能。

水稻OsMYB3R-2 基因对逆境响应的功能研究

低温威胁水稻的生产，其中苗期和生殖阶段对寒害是最敏感的时期。在苗期，阶段性冷害使水稻幼苗生长延迟，甚至造成烂秧现象；在生殖阶段，无法预测的突然降温会导致水稻花粉不育，并致使水稻大幅减产。因此，对水稻逆境胁迫调控的分子机制的深入研究在理论和实践上具有重要的意义。本研究从东乡野生稻、栽培稻及其杂交后代的低温芯片中筛选对低温响应基因的分析着手，对其中一个受低温诱导上调的基因OsMYB3R-2 作进一步研究。生物信息学的分析表明OsMYB3R-2 编码一个R1R2R3 MYB 蛋白，利用基因枪瞬时转化法、酵母GAL4 系统和电泳迁移率变动分析发现OsMYB3R-2 蛋白能够定位在细胞核中、具有转录激活和DNA 结合特性，表现为MYB 转录因子的典型特征。 超表达OsMYB3R-2 的转基因水稻呈现幼苗的矮化和生长相对滞后的表型，对低温胁迫具有耐受性。盐抑制水稻种子的萌发，与野生型和反义的株系相比，OsMYB3R-2 超表达株系的萌发对盐敏感，表现为萌发过程及萌发之后幼苗的生长更加滞后。而OsMYB3R-2 转基因株系对干旱处理敏感。为了进一步寻找OsMYB3R-2 蛋白的靶序列及其调控的靶基因，我们利用电泳迁移率变动分析发现OsMYB3R-2 能够与有丝分裂特异的激活子（mitosis-specific activator）元件特异结合。在低温条件下，OsMYB3R-2 超表达能够激活水稻G2/M 期特异基因的表达，主要包括OsCycB1;1、OsCycB2;1、OsCycB2;2 和OsCDC20.1 等。另一方面，OsMYB3R-2 超表达能够增加根尖细胞的有丝分裂指数，这进一步说明OsMYB3R-2 参与了水稻细胞周期调控。EMSA、RT-PCR 和流式细胞仪分析的结果表明OsMYB3R-2 通过激活其靶基因OsCycB1;1 的表达参与水稻对低温胁迫的调控，该过程由细胞周期介导。 为了研究OsMYB3R-2 与水稻DREB/CBF 途径的关系，我们分析了转基因水稻中DREB/CBF 类基因及其可能调控的下游基因与OsMYB3R-2 的关系，RT-PCR 的结果表明超表达转基因植物中DREB 表达未见明显变化，而其下游基因OsCPT1 在低温条件下被激活表达。同时，转基因植物在低温条件下脯氨酸水平显著提高。这说明OsMYB3R-2 可能在水稻DREB/CBF 途径的下游参与调控。 总之，OsMYB3R-2 基因的超表达赋予转基因水稻在苗期对低温胁迫具有耐受性，并呈现矮化和生长滞后的表型。OsMYB3R-2 蛋白行使R1R2R3 MYB 转录因子的功能，在体外能够结合OsCycB1;1 和OsKNOLLE2 基因启动子中有丝分裂特异的激活子元件，在低温条件下激活了G2/M 期特异基因的表达，这些基因包括OsCycB1;1、OsCycB2;1、OsCycB2;2 和OsCDC20.1。低温条件下，在OsMYB3R-2 转基因超表达株系中OsCPT1 基因的转录被激活，细胞的游离脯氨酸的含量也显著增高。这些结果都表明OsMYB3R-2 基因在水稻的冷胁迫信号途径中起重要的作用，该过程受细胞周期及DREB/CBF 途径介导。 我们的实验结果暗示水稻对低温的耐受是通过分生组织细胞周期调控完成的，这个过程由OsMYB3R-2 等关键基因控制。

拟南芥砷酸还原酶基因AtACR2的表达调控及其功能分析

将砷酸盐还原为亚砷酸盐是植物砷代谢途径中的关键步骤，其中砷酸还原酶是催化砷酸盐还原的关键酶。目前，对植物中砷酸还原酶基因的表达调控机制及该基因的功能了解得还不是很清楚。因此研究拟南芥砷酸还原酶基因的表达调控及其功能对于探讨植物对砷吸收、代谢、转运和富集的分子机制有重要意义。 本论文利用拟南芥砷酸还原酶基因（AtACR2）的启动表达调控序列的不同组合驱动GUS基因转录表达，对AtACR2启动表达调控序列的功能进行了分析；同时利用过表达、AtACR2基因T-DNA插入缺失突变体和地上部特异表达对拟南芥和蜈蚣草砷酸还原酶的基因功能进行了初步分析，主要结果如下： 1．对拟南芥AtACR2基因在不同砷酸盐处理浓度(0、100 yM、200 yM) 下的RT-PCR分析初步表明：在未用Na3As04处理的拟南芥幼苗中，AtACR2基因在根和茎叶中均有表达，且其在根中的转录水平高于茎叶中。同时该基因的表达在转录水平上受砷酸盐的负调控，即随着外界砷酸盐浓度的升高，AtACR2基因的转录水平降低。 2．将AtACR2基因不同启动调控序列组合驱动GUS基因转录表达，结果表 明：①由AtACR2基因上游1250 bp及其5’端非编码医构成的启动调控序列不足以启动AtACR2基因的转录表达和砷酸盐胁迫的应答；②在第一外显子和第一内含子中存在启动AtACR2基因起始转录表达的关键序列元件，它们的存在决定了该基因能否得以转录表达；⑧第一外显子和第一内含子序列中不仅存在起始基因转录的必需元件，还存在砷胁迫相关的应答元件，参与砷酸盐抑制AtACR2基因的转录表达调控；④在第二外显子和第二内含子中可能存在增强基因表达的调控元件序列，进一步影响该基因转录表达强度的调控。 3． 拟南芥AtA CR2基因和砷超富集植物蜈蚣草PvA CR2基因在拟南芥中过表达后的功能分析初步表明：①转基因植株能够通过减少体内As含量增强对砷酸盐的抗性；②两种植物的砷酸还原酶作用能力存在一定差异，其中超表达蜈蚣草PvA CR2能够使转基因植株根中As含量更少，但其对砷酸盐胁迫的抗性并没有AtACR2超表达植株强，这可能与转 PvA CR2基因植株地上部积累相对较高的砷含量有关。 4．将AtA CR2和PvA CR2在拟南芥中地上部特异表达后，抗性实验初步表明：①以野生型拟南芥为背景材料进行地上部特异超表达AtACR2或PvA CR2基因，不能增强转基因植株对砷酸盐抗性；②以AtA CR2基因的T-DNA插入缺失突变体为背景材料地上部特异表达AtACR2或PvA CR2基因，却能够明显增强转基因植株对砷酸盐的抗性。综上所述，植物砷酸还原酶基因在植物对砷酸盐胁迫的响应和调控中起着重要作用。

中药青蒿紫穗槐二烯合酶基因表达及调控的研究

青蒿素是从我国传统药用植物中药青蒿（Artemisia annua L.）中提取的新型抗疟特效药，其生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径。目前，青蒿素生物合成的组织部位及其调控机制仍不完全清楚。紫穗槐二烯合酶（amorpha-4， 11-diene synthase, ADS）作为青蒿素生物合成分支途径的第一个关键酶，催化倍半萜化合物的通用前体法呢基焦磷酸环化，生成紫穗槐二烯。本论文通过对ADS 表达特性的分析，研究了青蒿素生物合成的组织特异性及其调控机制，主要研究结果如下： 一．紫穗槐二烯合酶基因启动子功能的研究 从青蒿高产株系001 中克隆得到了2850 bp 的ADS 启动子调控区。通过比较5’RACE 的测序结果与启动子序列，确定转录起始位点位于翻译起始位点上游44 bp，TATA 盒下游27 bp。该启动子序列包含的顺式作用元件有脱落酸应答元件(ABRE )、乙烯应答元件(ERE)、生长素应答元件(AUXRE）等植物激素反应元件，以及低温应答元件（LTRE）、高温应答元件（HSE）等与逆境有关的反应元件，还有与真菌诱导有关的W-box 元件等。将不同长度ADS 启动子与报告基因GUS 融合，构建了植物表达载体，通过农杆菌介导的方法获得稳定整合的转基因烟草。经过组织化学、GUS 荧光活性检测及RT-PCR 分析，发现该启动子的转录活性很低，无法通过GUS 染色进行观察。GUS 荧光活性检测及RT-PCR 结果表明，转录起始位点上游346 bp 是ADS 基础表达所必需的。高温、低温、干旱、水杨酸、茉莉酸甲酯等处理均能促进青蒿中ADS 的表达，而脱落酸和乙烯的作用效果较小，与启动子序列分析的结果并不完全一致。 二．紫穗槐二烯合酶基因表达特性的研究 以青蒿高产株系001 为材料，在基因和蛋白水平揭示了ADS 的表达特性。RT-PCR 和Western 分析结果表明，ADS 在幼叶和花蕾中大量表达，在老叶和完全开放的花中表达量很低，而在青蒿的根和茎中几乎检测不到ADS 的表达。石蜡切片和整体原位杂交的结果表明，ADS 在顶端分生组织、叶原基及分泌腺毛中表达，在非分泌的T 型腺毛中不表达。当叶片完全展开后，ADS 只在分泌腺毛中表达，而且随着叶片的生长和老化，ADS 的表达量逐渐减少。另一个非常有趣的发现是同一叶片上的分泌腺毛，有些有ADS 的表达，有些则没有。用强光、低温、高温和水杨酸等因素处理后，有ADS 表达的分泌腺毛的比例没有明显的变化。 三．外源水杨酸促进青蒿素的生物合成 研究了外源水杨酸对青蒿素生物合成的影响，结果表明：1 mM 水杨酸处理后，青蒿叶片中的游离态水杨酸含量快速增加，处理后4 h 达到 0.79 μg g-1 FW，是对照的3.5 倍。外源水杨酸能够抑制青蒿中过氧化氢酶活性，提高抗坏血酸过氧化物酶活性，并通过对抗氧化酶活性的抑制引起青蒿体内活性氧水平的迅速升高。在处理后4 h，青蒿中H2O2 和O2-的含量分别达到对照的2.1 倍和2.4 倍。青蒿素含量在水杨酸处理后的前8 h 缓慢升高，随后升高的速度增加。外源水杨酸处理后8 h 和96 h，青蒿素含量分别达到9.1 mg g-1DW 和13.9 mg g-1DW，比对照高21.7%和75.8%。处理后8 h，青蒿酸的含量没有明显变化，随后开始增加。处理后16 h，青蒿酸的含量达到3.6 mg g-1DW，比对照高90%， 随后继续升高，至96 h 达到4.98 mg g-1 DW，比对照高127%。二氢青蒿酸的含量在处理后的8 h 内有所下降，随后缓慢升高。处理后8 h，二氢青蒿酸的含量降低了23.3%，随后二氢青蒿酸的含量开始升高，在处理后96 h，达到7.4 mg g-1DW，比对照高72.1%。外源SA 处理提高了青蒿素及其前体的总含量，在处理后1、2、4 天分别比对照提高了1.3、1.5 和1.8 倍。Northern 结果表明，水杨酸强烈诱导了青蒿素生物合成基因HMGR、ADS 的表达，但是对FPS、CYP71AV1 的诱导作用较小。这些研究结果表明，外源水杨酸至少通过两条途径诱导青蒿素的生物合成：一是通过诱导活性氧的产生促进二氢青蒿酸向青蒿素的转化；二是上调部分青蒿素生物合成相关基因的表达。根据这一研究成果，在青蒿田间栽培中，可以在收获前通过喷施水杨酸来快速、有效和低成本地提高青蒿素产量。

参与调控拟南芥叶绿体发育基因的初步功能研究

绿色植物的光合作用是地球上唯一大规模地把无机物转变为有机物，把光能转变为化学能的过程。叶绿体是植物进行光合作用的场所。因而，高等植物叶绿体发育与叶绿体功能维持的研究一直倍受人们关注。然而，目前参与高等植物中调控叶绿体发育过程的基因克隆以及这些基因在叶绿体发育过程中的分子机制知之甚少。本论文克隆并初步探讨了2个参与调控拟南芥叶绿体发育基因AtECB1和AtECB2。AtECB1基因编码一个高等植物所特有的，具有类似硫氧还蛋白结构的叶绿体蛋白质。该基因主要在地上部分表达，尤其在14天的幼苗中表达较强，且该基因的表达是受光诱导的。该基因的敲除导致了拟南芥叶绿体中仅有少数片层结构。这些片层不能进一步形成类囊体结构。蛋白质免疫实验表明，突变体中多数光合作用蛋白质复合物的组分缺失。该基因的突变影响了质体转录，翻译和光合作用相关的基因的表达。基于这些结果我们推测，AtECB1可能是叶绿体发育过程中所必需的。而AtECB2基因则编码一个PPR家族的叶绿体蛋白质。该蛋白质具有11个PPR基序；此外，该蛋白质含有E/E+和DYW结构域。因而，AtECB2属于PPR家族中的DYW群。AtECB2敲除突变体表现为白化表型，该突变体中的叶绿体没有正常的类囊体结构，仅存在少量的膜结构。与电镜的结果相一致，蛋白质免疫实验表明突变体中多数光合作用蛋白质复合物的组分缺失。定量RT-PCR结果表明，AtECB2的缺失影响了叶绿体基因的表达。另外，我们对该突变体中的已经报道的34个RNA编辑位点分析发现其中的一个位点accD没有发生编辑。AccD编码异质型乙酰辅酶A羧化酶的羧基转移酶β亚基。而前人的实验表明，该位点的RNA编辑为其所编码的蛋白质活性所必需，且accD的缺失直接影响到植物叶绿体的发育。综合这些数据和本论文的结果表明，AtECB2是质体转录本accD的RNA编辑所必需的特异因子；accD RNA编辑的缺陷可能导致了叶绿体发育的缺陷。

复苏植物牛耳草Boea hygrometrica干旱诱导基因的筛选和功能分析

干旱对植物的影响和植物对干旱的反应是十分复杂的，涉及到植物的各种生理活动，由胁迫强度及时间、植物本身的遗传特性、发育阶段和生理状况以及其他环境因子共同决定。现代分子生物学和生物技术的发展深化了对植物逆境反应的研究，对植物抗旱分子反应的研究成为这个领域的热点，也引发了抗逆基因资源的争夺战。 以拟南芥等植物为实验材料的研究对深入了解植物对干旱胁迫感知和反应机制提供了重要信息, 但对植物抗旱机制的了解仍然十分匮乏。其中， 限制人们对抗旱机制深入了解的一个重要因素就是植物抗旱机制的复杂性和多样性，这种抗旱机制的复杂性决定了不是所有的机制都可通过拟南芥等植物来加以揭示。因此利用特殊生境植物来研究相关基因的表达对揭示植物对环境适应机制有着极为重要的价值。 我们实验室以复苏被子植物旋蒴苣苔（Boea hygrometrica (Bunge) R Br.，牛耳草）为实验材料，开展了多方面的工作，以期从复苏植物的角度加深人们对抗旱机制的了解。目前我们实验室已成功地建立了利用cDNA微阵列技术研究牛耳草基因表达谱的体系，并比较了4562个cDNA克隆在干旱前后的表达差异, 发现434个cDNA在干旱条件下表达水平增加一倍以上。 本工作是在上述工作的基础上，对这些表达差异的cDNA克隆并测序，利用Northern blot进一步验证这些基因。序列分析表明，这434个cDNA片段实际上代表着42个基因。根据序列同源性分析表明其中36个克隆与已知功能的基因具有同源性，它们分别是细胞壁相关基因、LEA基因和糖类、抗氧化酶类的编码基因等。另外，4个克隆未能找到同源序列，这可能意味着它们是一些新基因；2个克隆虽找到同源基因但功能未知。36个克隆中有3个编码的是细胞壁相关基因，它们在干旱早期就被诱导，而编码LEA蛋白的基因在干旱中期或后期大量诱导，这说明牛耳草耐旱反应的启动是程序化的，随干旱时间的延长和程度的加强，一步步地启动相应的基因来发挥作用，多方面地对植物细胞进行保护和修复。 本实验室的前期工作表明牛耳草脱水复水过程中细胞超微结构分发生了明显变化，其中细胞壁脱水时发生折叠复水时恢复原状。鉴于细胞壁如此显著的变化及其重要作用，我们以两个细胞壁相关的基因BhGRP1和BhGLP1为对象，对其表达的时间空间特点和对不同胁迫信号的应答、编码产物的理化性质、过量表达或抑制表达的转基因植物的表现型及转基因植物对不同逆境胁迫的抗/感性状等方面的进行研究，综合分析其在耐旱反应中可能参与的代谢途径或信号途径，以期为揭示牛耳草耐旱复苏机制提供有力的佐证。 我们利用Northern blot和半定量RT-PCR对两基因进行了表达模式分析，发现BhGRP1在干旱早期被诱导，干旱后期其转录本水平下降。而BhGLP1在早期诱导后一直保持高的表达。两者在不同胁迫、激素等处理下都有不同的响应。经PSORT分析两基因编码的蛋白都具有N-端信号肽，意味着两蛋白定位于胞外基质。构建BhGRP1-GFP和BhGLP1-GFP融合蛋白进行亚细胞定位分析，质壁分离后BhGRP1-GFP的信号仅保留在细胞壁，而BhGLP1-GFP则在胞壁胞膜上都存在。过量表达BhGRP1后发现它能赋予植物更强的耐旱复苏能力及机械强度，而抑制GLP表达的植株的抗旱性明显弱于野生型，表明BhGRP1和BhGLP1与牛耳草的耐旱复苏有密切的关系。

酵母拮抗菌和外源水杨酸对核果类果实抗病相关基因的诱导表达

在果实采后贮藏过程中，病原真菌的侵染会引起果实腐烂，造成巨大的经济损失。利用生物和非生物因子诱导果实抗病性，已经成为采后病害防治领域的一个研究热点。本文主要利用RT-PCR和RACE技术克隆果实抗病相关基因，通过分子杂交和蛋白羰基化免疫检测技术，研究了外源SA和酵母拮抗菌诱导果实抗病性机理，结果表明： 1. 通过优化RNA提取方法，能从含有多糖的冬枣、葡萄、甜樱桃、桃、番茄等果实中提取到质量较好的RNA，用于RT-PCR和Northern杂交。 2. 采用RT-PCR和RACE方法，从甜樱桃果实克隆了两个抗氧化相关基因CAT2（Genbank：EF165590）和GPX（Genbank：EF165591）和两个PR基因GLU-1（Genbank：EF177487）和GLU-3（Genbank：EF177488)。其中CAT2全长cDNA序列为1479 bp，编码492个氨基酸；GPX全长cDNA序列为513 bp，编码170个氨基酸；GLU-1全长cDNA序列为1050 bp，编码349个氨基酸；GLU-3部分cDNA序列为454 bp，编码141个氨基酸。 3. 酵母拮抗菌Pichia membranaefaciens处理不同成熟度的甜樱桃果实，能显著降低果实贮藏期间青霉病（Penicillium expansum）的发生，并且对低成熟度果实的病害防治效果更为明显。酵母拮抗菌的抑病机理与减轻了甜樱桃果实蛋白羰基化程度，诱导了果实抗氧化酶基因（CAT和GPX）和PR基因（GLU-1）的表达和提高了抗氧化酶（CAT和GPX）和β-1,3-葡聚糖酶的活性有关。 4. 四种酵母拮抗菌P. membranaefaciens, Cryptococcus laurentii, Candida guilliermondii和Rhodotorula glutinis处理桃果实，可显著降低贮藏期间的褐腐病（Monilinia fructicola）。这是由于酵母拮抗菌能抑制病原菌侵染造成的氧化胁迫和蛋白羰基化。此外，酵母拮抗菌处理还能显著诱导CAT、POD、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性及相应基因的表达。 5. 水杨酸（SA，2 mM）处理采后不同成熟度的甜樱桃果实，能显著降低青霉病的危害。其抑病机理与SA处理能减轻P. expansum侵染引起的果实蛋白羰基化程度，显著提高CAT、GPX和β-1,3-葡聚糖酶基因的表达和相关的酶的活性有关。而2 mM的SA处理对P. expansum的生长没有直接抑制作用。 6. 水杨酸（SA，2 mM）与P. membranaefaciens（1×108 CFU/ml）配合处理能显著降低低温贮藏期间桃果实的褐腐病，并能提高几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和POD的活性和相关基因的表达。另外，2 mM的SA对拮抗菌P. membranaefaciens的生长没有影响，但能够抑制病原菌M. fructicola的孢子萌发和菌丝扩展。

豌豆Lhcb2 基因的克隆、表达、功能分析及其克隆化蛋白与色素体外重组系统的建立

Lhcb2基因是LHCII基因家族中的一个重要成员。目前，对于其特性、结构和功能还不清楚。本文对豌豆Lhcb2基因的克隆、表达、功能及其在大肠杆菌中的表达产物与色素在体外的重组进行了比较系统的探讨，主要的结果如下： 1．采用RT-PCR技术，从豌豆幼叶中克隆了一个约800 bp的Lhcb2 cDNA。以特异探针进行Southern杂交的结果初步证明，Lhcb2基因以单拷贝形式存在于豌豆基因组中，这在文献中尚未见报道。 2．不同光照时间和温度对豌豆幼苗进行处理的RT-PCR，Northem blotting分析表明，Lhcb2基因转录水平上的表达受光照的控制，且明显地表现出对光照时间的依赖性。用400 μmolm-2.s-1的白光照射0～1.5小时Lhcb2基因未见表达，而在光照2小时以上则大量表达，推测该基因的表达可能要求某种(或某些)需光中间物的合成和积累。温度对Lhcb2基因的表达亦有显著的影响，相同的光照处理，4 ℃下Lhcb2基因的表达量比25℃下的表达量低一倍左右。 3．将豌豆Lhcb2基因反向插入植物表达载体pBIl21中，构建CaMV 35S启动子控制下反义Lhcb2基因的植物表达载体pBIantiLhcb2，通过农杆菌LBA4404介导，在Kan浓度为100 mg／L的筛选培养基上，获得120个抗Kan阳性植株。PCR检测表明至少有80个抗性植株为PCR阳性反应。Southern blotting分析表明，外源反义Lhcb2基因已整合到烟草基因组中。转基因植株在表型上主要表现为三大类型：叶色类似于未转基因的绿色植株、叶色发黄的植株、叶色发白甚至枯死的植株。这几类转基因植株光谱特性的分析表明，Lhcb2基因不仅影响光能的捕获，而且还可能参与激发能分配的调节作用。 4．将豌豆的Lhcb2基因亚克隆至原核表达载体pET-3d上，通过定点突变使其在大肠杆菌BL2l(DE3)中得到高效表达，其表达量约占大肠杆菌总蛋白的40％，并经纯化后获得了电泳纯的Lhcb2蛋白。应用改进的液氮／室温冻融重组方法将纯化的蛋白与色素进行体外重组，建立了高效的重组系统。实验结果表明重组后所获得的LHCB2单体与用生化方法从菠菜类囊体膜中分离纯化的天然LHC II单体相比较，其在部分变性胶的电泳行为，低温荧光发射光谱和激发光谱，以及室温吸收光谱和CD光谱的特征等方面都非常相似，说明大量表达的Lhcb2蛋白与色素已成功地重组，并具有与天然的LHCII单体相类似的组成和结构，这在国际上尚属首次。在此基础上又构建了N端和C端氨基酸残基缺失的突变体，并对这些缺失的氨基酸残基在LHCB2中的可能作用进行了初步的研究。结果表明，N端的前12个氨基酸残基、C端的前10个氨基酸残基和第11位的色氨基酸残基对LHCB2单体的形成不是必需的。 此外，从菠菜中纯化了LHCII，并对其多肽和色素组成及其光谱特性进行了比较系统的研究。同时对用不同浓度OGP和Mg2+处理所获得的不同聚集程度的LHCII的光谱特性进行了研究，并对Mg2+在其中的可能作用进行了初步的探讨。

高亲和力PO4(3-)转运子编码基因的cDNA克隆及特性分析

以简并引物，利用RT -PCR，克隆了普通小麦和黑麦根系的PO 43-转运子( Trans-porter)基因长约1.2kb的部分cDNA序列。对其与GenBank中的已知序列进行同源性比较，结果表明：(1)小麦与拟南芥、番茄等高等植物的氨基酸水平的同源性为60%～78%; (2)与酵母较低为40%左右，而与丝状真菌和细菌的同源性则<27%; (3)小麦与黑麦的同源性为75%。对其表达特性的研究表明：(1)该基因在根系和茎叶组织中均有表达，但在根系组织中转录产物的累积量显著高于茎叶;(2)磷饥饿条件下，茎叶和根系组织中该基因的表达均增强，但根系组织中增强幅度较大，由此认为该基因产物的功能不只是根系从生长环境中吸收PO 43-，而与PO 43-在植物体内的转运密切相关;(3)磷饥饿5天 后的植株重新供给充足的PO 43-，则该基因的表达在24小时内即显著减弱;(4)分根试验中同株的部分根系生长于磷饥饿(OuM)环境中，而另一部分根系生长于PO 43-充足(250uM)的环境中，这两部分根系中该基因转录产物的积累水平并无显著差异。因此认为植物感受磷饥饿胁迫的信号可能来自植物体内部POi-库的耗竭。此外，用磷讥饿条件下的普通小麦根系mRNA构建了cDNA文库，以克隆的部分序列为探针，从cDNA文库中分离了全长序列。