水稻RAD21/REC8家族基因OsRAD21-3的功能研究

有丝分裂和减数分裂包含一系列协同作用的事件，姊妹染色体的黏着是其中非常重要的一个环节。通过对芽殖酵母的研究发现姊妹染色体的黏着是由一个多亚基的蛋白复合体——黏着素介导的，在有丝分裂过程中，黏着素由Scc1（裂殖酵母中为Rad21）、Scc3、Smc1和Smc3四个亚基组成，而在减数分裂中Scc1被其同源蛋白Rec8所取代。通过对其它真核生物包括线虫、果蝇、爪蟾、鼠、人以及拟南芥等进行的研究显示，黏着素介导的姊妹染色体黏着的基本机制在真核生物中具有保守性，但在不同的物种中，其具体的分子机制还存在着差异。开花植物的有性生殖过程包含了一个非常特殊的花粉发育阶段，其间发生了两次花粉的有丝分裂，对其我们还知之甚少。Rad21/Rec8作为黏着素的重要组分，对水稻中它的同源蛋白进行深入研究可以帮助我们对植物有丝分裂和减数分裂的染色体黏着机制有进一步的了解。 我们发现在水稻基因组中存在4个编码Rad21/Rec8家族蛋白的基因，其中OsRAD21-3位于水稻第8号染色体上，其编码的蛋白与其它的Rad21/Rec8家族蛋白一样，具有保守的N-和C-末端结构域。序列比对和进化分析的结果表明OsRad21-3蛋白属于Rad21亚家族，而免疫荧光定位分析显示OsRad21-3可以特异地定位于有丝分裂的染色体上，由此说明OsRAD21-3应当是酵母RAD21的直系同源基因。对OsRAD21-3进行半定量RT-PCR，Western杂交以及原位杂交的结果显示它在生殖器官花中优势表达，在营养器官中也能检测到表达。在花中它在从雌雄蕊形成期到成熟花粉期都有表达，其表达的位置主要位于减数分裂时期的小孢子母细胞以及减数分裂后的小孢子和花粉中。在水稻四个RAD21/REC8基因中，OsRAD21-3是唯一一个在花粉发育过程中表达的基因，说明它可能在减数分裂后的雄配子体发育过程中发挥了功能。 采用RNAi手段对OsRAD21-3的功能进行研究发现OsRAD21-3 RNAi转基因水稻植株的育性显著下降，进一步的分析表明其花粉活性受到严重影响。对OsRAD21-3i株系的雄性减数分裂过程及减数分裂后的小孢子和花粉发育过程进行观察发现，减数分裂过程中有少量细胞存在染色体的异常行为，但总体上没有对雄性减数分裂造成严重影响，而减数分裂后的小孢子和花粉发育过程则出现了显著异常，表现为花粉有丝分裂的停滞或有丝分裂染色体分离的扰乱，因此，OsRAD21-3应当主要是通过在花粉的有丝分裂过程中发挥功能而参与减数分裂后的雄配子体发育过程，而它在雄性减数分裂过程中可能也有一定作用。 利用原位杂交技术分析了水稻另外三个RAD21/REC8基因的表达特性，结果表明OsRAD21-1、OsRAD21-2和OsRAD21-4都在减数分裂前及减数分裂期的小孢子母细胞中表达，但在减数分裂后较晚时期的小孢子中则没有检测到表达。OsRAD21-4在小孢子母细胞中的表达为其参与减数分裂过程染色体的黏着提供了证据，而OsRAD21-1和OsRAD21-2在此过程中的功能还有待进一步研究。此外，OsRAD21-1和OsRAD21-2还在营养器官有丝分裂旺盛的区域表达，OsRAD21-1作为RAD21的同源基因可能与OsRAD21-3在参与有丝分裂染色体黏着方面存在功能上的冗余性，但OsRAD21-3参与花粉的发育过程则是其所特有的，这可能也在一定程度上说明了为什么水稻中会存在4个RAD21/REC8基因，并帮助我们更好地了解了它们在功能上的分化。