Intrinsic fractal dynamics in the respiratory system by means of pressure-volume loops

This contribution presents novel concepts for analysis of pressure–volume curves, which offer information about the time domain dynamics of the respiratory system. The aim is to verify whether a mapping of the respiratory diseases can be obtained, allowing analysis of (dis)similarities between the dynamical pattern in the breathing in children. The groups investigated here are children, diagnosed as healthy, asthmatic, and cystic fibrosis. The pressure–volume curves have been measured by means of the noninvasive forced oscillation technique during breathing at rest. The geometrical fractal dimension is extracted from the pressure–volume curves and a power-law behavior is observed in the data. The power-law model coefficients are identified from the three sets and the results show that significant differences are present between the groups. This conclusion supports the idea that the respiratory system changes with disease in terms of airway geometry, tissue parameters, leading in turn to variations in the fractal dimension of the respiratory tree and its dynamics.

Programa de controlo de acessos com configuração de regras em XML: Volume 1

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Electrotécnica e de Computadores

Sensitive bi-enzymatic biosensor based on polyphenoloxidases–gold nanoparticles–chitosan hybrid film–graphene doped carbon paste electrode for carbamates detection

A bi-enzymatic biosensor (LACC–TYR–AuNPs–CS/GPE) for carbamates was prepared in a single step by electrodeposition of a hybrid film onto a graphene doped carbon paste electrode (GPE). Graphene and the gold nanoparticles (AuNPs) were morphologically characterized by transmission electron microscopy, X-ray photoelectron spectroscopy, dynamic light scattering and laser Doppler velocimetry. The electrodeposited hybrid film was composed of laccase (LACC), tyrosinase (TYR) and AuNPs entrapped in a chitosan (CS) polymeric matrix. Experimental parameters, namely graphene redox state, AuNPs:CS ratio, enzymes concentration, pH and inhibition time were evaluated. LACC–TYR–AuNPs–CS/GPE exhibited an improved Michaelis–Menten kinetic constant (26.9 ± 0.5 M) when compared with LACC–AuNPs–CS/GPE (37.8 ± 0.2 M) and TYR–AuNPs–CS/GPE (52.3 ± 0.4 M). Using 4-aminophenol as substrate at pH 5.5, the device presented wide linear ranges, low detection limits (1.68×10− 9 ± 1.18×10− 10 – 2.15×10− 7 ± 3.41×10− 9 M), high accuracy, sensitivity (1.13×106 ± 8.11×104 – 2.19×108 ± 2.51×107 %inhibition M− 1), repeatability (1.2–5.8% RSD), reproducibility (3.2–6.5% RSD) and stability (ca. twenty days) to determine carbaryl, formetanate hydrochloride, propoxur and ziram in citrus fruits based on their inhibitory capacity on the polyphenoloxidases activity. Recoveries at two fortified levels ranged from 93.8 ± 0.3% (lemon) to 97.8 ± 0.3% (orange). Glucose, citric acid and ascorbic acid do not interfere significantly in the electroanalysis. The proposed electroanalytical procedure can be a promising tool for food safety control.

Modification of cell volume and proliferative capacity of Pseudokirchneriella subcapitata cells exposed to metal stress

The impact of metals (Cd, Cr, Cu and Zn) on growth, cell volume and cell division of the freshwateralga Pseudokirchneriella subcapitata exposed over a period of 72 h was investigated. The algal cells wereexposed to three nominal concentrations of each metal: low (closed to 72 h-EC10values), intermediate(closed to 72 h-EC50values) and high (upper than 72 h-EC90values). The exposure to low metal concen-trations resulted in a decrease of cell volume. On the contrary, for the highest metal concentrations anincrease of cell volume was observed; this effect was particularly notorious for Cd and less pronouncedfor Zn. Two behaviours were found when algal cells were exposed to intermediate concentrations ofmetals: Cu(II) and Cr(VI) induced a reduction of cell volume, while Cd(II) and Zn(II) provoked an oppositeeffect. The simultaneous nucleus staining and cell image analysis, allowed distinguishing three phases inP. subcapitata cell cycle: growth of mother cell; cell division, which includes two divisions of the nucleus;and, release of four autospores. The exposure of P. subcapitata cells to the highest metal concentrationsresulted in the arrest of cell growth before the first nucleus division [for Cr(VI) and Cu(II)] or after thesecond nucleus division but before the cytokinesis (release of autospores) when exposed to Cd(II). Thedifferent impact of metals on algal cell volume and cell-cycle progression, suggests that different toxic-ity mechanisms underlie the action of different metals studied. The simultaneous nucleus staining andcell image analysis, used in the present work, can be a useful tool in the analysis of the toxicity of thepollutants, in P. subcapitata, and help in the elucidation of their different modes of action.

Functional significance of adenosine in carotid body chemosensory activity in control and chronically hypoxic animals

ABSTRACT: Carotid bodies (CB) are peripheral chemoreceptor organs sensing changes in arterial blood O2, CO2 and pH levels. Hypoxia and acidosis or hypercapnia activates CB chemoreceptor cells, which respond by releasing neurotransmitters in order to increase the action potential frequency in their sensory nerve, the carotid sinus nerve (CSN). CSN activity is integrated in the brainstem to induce a fan of cardiorespiratory reflex responses, aimed at normalising the altered blood gases. Exogenously applied adenosine (Ado) increases CSN chemosensory activity inducing hyperventilation through activation of A2 receptors. The importance of the effects of adenosine in chemoreception was reinforced by data obtained in humans, in which the intravenous infusion of Ado causes hyperventilation and dyspnoea, an effect that has been attributed to the activation of CB because Ado does not cross blood-brain barrier and because the ventilatory effects are higher the closer to the CB it is injected. The present work was performed in order to establish the functional significance of adenosine in chemoreception at the carotid body in control and chronically hypoxic rats. To achieve this objective we investigated: 1) The release of adenosine from a rat carotid body in vitro preparation in response to moderate hypoxia and the specificity of this release. We also investigated the metabolic pathways of adenosine production and release in the organ in normoxia and hypoxia; 2) The modulation of adenosine/ATP release from rat carotid body chemoreceptor cells by nicotinic ACh receptors; 3) The effects of caffeine on peripheral control of breathing and the identity of the adenosine receptors involved in adenosine and caffeine effects on carotid body chemoreceptors; 4) The interactions between dopamine D2 receptors and adenosine A2B receptors that modulate the release of catecholamines (CA) from the rat carotid body; 5) The effect of chronic caffeine intake i.e. the continuous blockage of adenosine receptors thereby simulating a caffeine dependence, on the carotid body function in control and chronically hypoxic rats. The methodologies used in this work included: molecular biology techniques (e.g. immunocytochemistry and western-blot), biochemical techniques (e.g. neurotransmitter quantification by HPLC, bioluminescence and radioisotopic methods), electrophysiological techniques (e.g. action potential recordings) and ventilatory recordings using whole-body plethysmography. It was observed that: 1) CB chemoreceptor sensitivity to hypoxia could be related to its low threshold for the release of adenosine because moderate acute hypoxia (10% O2) increased adenosine concentrations released from the CB by 44% but was not a strong enough stimulus to evoke adenosine release from superior cervical ganglia and arterial tissue; 2) Acetylcholine (ACh) modulates the release of adenosine/5’-adenosine triphosphate (ATP) from CB in moderate hypoxia through the activation of nicotinic receptors with α4 and ß2 receptor subunits, suggesting that the excitatory role of ACh in chemosensory activity includes indirect activation of purinergic receptors by adenosine and ATP, which strongly supports the hypothesis that ATP/adenosine are important mediators in chemotransduction; 3) adenosine increases the release of CA from rat CB chemoreceptor cells via A2B receptors; 4) the inhibitory effects of caffeine on CB chemoreceptors are mediated by antagonism of postsynaptic A2A and presynaptic A2B adenosine receptors indicating that chemosensory activity elicited by hypoxia is controlled by adenosine; 5) The release of CA from rat CB chemoreceptor cells is modulated by adenosine through an antagonistic interaction between A2B and D2 receptors, for the first time herein described; 6) chronic caffeine treatment did not significantly alter the basal function of CB in normoxic rats assessed as the dynamics of their neurotransmitters, dopamine, ATP and adenosine, and the CSN chemosensory activity. In contrast, the responses to hypoxia in these animals were facilitated by chronic caffeine intake because it increased the ventilatory response, slightly increased CSN chemosensory activity and increased dopamine (DA) and ATP release; 7) In comparison with normoxic rats, chronically hypoxic rats exhibited an increase in several parameters: ventilatory hypoxic response; basal and hypoxic CSN activity; tyrosine hydroxylase expression, CA content, synthesis and release; basal and hypoxic adenosine release; and in contrast a normal basal release and diminished hypoxia-induced ATP release; 8) Finally, in contrast to chronically hypoxic rats, chronic caffeine treatment did not alter the basal CSN chemosensory activity. Nevertheless, the responses to mild and intense hypoxia, and hypercapnia, were diminished. This inhibitory effect of chronic caffeine in CB output is compensated by central mechanisms, as the minute ventilation parameter in basal conditions and in response to acute hypoxic challenges remained unaltered in rats exposed to chronic hypoxia. We can conclude that adenosine both in acute and chronically hypoxic conditions have an excitatory role in the CB chemosensory activity, acting directly on adenosine A2A receptors present postsynaptically in CSN, and acting presynaptically via A2B receptors controlling the release of dopamine in chemoreceptor cells. We suggest that A2B -D2 adenosine / dopamine interactions at the CB could explain the increase in CA metabolism caused by chronic ingestion of caffeine during chronic hypoxia. It was also concluded that adenosine facilitates CB sensitisation to chronic hypoxia although this effect is further compensated at the central nervous system.-------- RESUMO: Os corpos carotídeos (CB) são pequenos orgãos emparelhados localizados na bifurcação da artéria carótida comum. Estes órgãos são sensíveis a variações na PaO2, PaCO2, pH e temperatura sendo responsáveis pela hiperventilação que ocorre em resposta à hipóxia, contribuindo também para a hiperventilação que acompanha a acidose metabólica e respiratória. As células quimiorreceptoras (tipo I ou glómicas) do corpo carotídeo respondem às variações de gases arteriais libertando neurotransmissores que activam as terminações sensitivas do nervo do seio carotídeo (CSN) conduzindo a informação ao centro respiratório central. Está ainda por esclarecer qual o neurotransmissor (ou os neurotransmissores) responsável pela sinalização hipóxica no corpo carotídeo. A adenosina é um neurotransmissor excitatório no CB que aumenta a actividade eléctrica do CSN induzindo a hiperventilação através da activação de receptores A2. A importância destes efeitos da adenosina na quimiorrecepção, descritos em ratos e gatos, foi reforçada por resultados obtidos em voluntários saudáveis onde a infusão intravenosa de adenosina em induz hiperventilação e dispneia, efeito atribuído a uma activação do CB uma vez que a adenosina não atravessa a barreira hemato-encefálica e o efeito é quanto maior quanto mais perto do CB for a administração de adenosina. O presente trabalho foi realizado com o objectivo de esclarecer qual o significado funcional da adenosina na quimiorrecepção no CB em animais controlo e em animais submetidos a hipoxia crónica mantida. Para alcançar este objectivo investigou-se: 1) o efeito da hipóxia moderada sobre a libertação de adenosina numa preparação in vitro de CB e a especificidade desta mesma libertação comparativamente com outros tecidos não quimiossensitivos, assim como as vias metabólicas de produção e libertação de adenosina no CB em normoxia e hipóxia; 2) a modulação da libertação de adenosina/ATP das células quimiorreceptoras do CB por receptores nicotínicos de ACh; 3) os efeitos da cafeína no controlo periférico da ventilação e a identidade dos receptores de adenosina envolvidos nos efeitos da adenosina e da cafeína nos quimiorreceptores do CB; 4) as interacções entre os receptores D2 de dopamina e os receptores A2B de adenosina que modulam a libertação de catecolaminas (CA) no CB de rato e; 5) o efeito da ingestão crónica de cafeína, isto é, o contínuo bloqueio e dos receptores de adenosina, simulando assim o consumo crónico da cafeína, tal como ocorre na população humana mundial e principalmente no ocidente, na função do corpo carotídeo em ratos controlo e em ratos submetidos a hipoxia crónica. Os métodos utilizados neste trabalho incluíram: técnicas de biologia molecular como imunocitoquímica e western-blot; técnicas bioquímicas, tais como a quantificação de neurotransmissores por HPLC, bioluminescência e métodos radioisotópicos; técnicas electrofisiológicas como o registro de potenciais eléctricos do nervo do seio carotídeo in vitro; e registros ventilatórios in vivo em animais não anestesiados e em livre movimento (pletismografia). Observou-se que: 1) a especificidade dos quimiorreceptores do CB como sensores de O2 está correlacionada com o baixo limiar de libertação de adenosina em resposta à hipóxia dado que a libertação de adenosina do CB aumenta 44% em resposta a uma hipóxia moderada (10% O2), que no entanto não é um estímulo suficientemente intenso para evocar a libertação de adenosina do gânglio cervical superior ou do tecido arterial. Observou-se também que aproximadamente 40% da adenosina libertada pelo CB provém do catabolismo extracelular do ATP quer em normóxia quer em hipóxia moderada, sendo que PO2 reduzidas induzem a libertação de adenosina via activação do sistema de transporte equilibrativo ENT1. 2) a ACh modula a libertação de adenosina /ATP do CB em resposta à hipoxia moderada sugerindo que o papel excitatório da ACh na actividade quimiossensora inclui a activação indirecta de receptores purinérgicos pela adenosina e ATP, indicando que a adenosina e o ATP poderiam actuar como mediadores importantes no processo de quimiotransducção uma vez que: a) a activação dos receptores nicotínicos de ACh no CB em normóxia estimula a libertação de adenosina (max 36%) provindo aparentemente da degradação extracelular do ATP. b) a caracterização farmacológica dos receptores nicotínicos de ACh envolvidos na estimulação da libertação de adenosina do CB revelou que os receptores nicotínicos de ACh envolvidos são constituídos por subunidades α4ß2. 3) a adenosina modula a libertação de catecolaminas das células quimiorreceptoras do CB através de receptores de adenosina A2B dado que: a)a cafeína, um antagonista não selectivo dos receptores de adenosina, inibiu a libertação de CA quer em normóxia quer em resposta a estímulos de baixa intensidade sendo ineficaz na libertação induzida por estímulos de intensidade superior; b) o DPCPX e do MRS1754 mimetizaram os efeitos da cafeína no CB sendo o SCH58621 incapaz de induzir a libertação de CA indicando que os efeitos da cafeína seriam mediados por receptores A2B de adenosina cuja presença nas células quimiorreceptoras do CB demonstramos por imunocitoquímica. 4) a aplicação aguda de cafeína inibiu em 52% a actividade quimiossensora do CSN induzida pela hipóxia sendo este efeito mediado respectivamente por receptores de adenosina A2A pós-sinápticos e A2B pré-sinápticos indicando que a actividade quimiossensora induzida pela hipóxia é controlada pela adenosina. 5) existe uma interacção entre os receptores A2B e D2 que controla a libertação de CA do corpo carotídeo de rato uma vez que: a) os antagonistas dos receptores D2, domperidona e haloperidol, aumentaram a libertação basal e evocada de CA das células quimiorreceptoras confirmando a presença de autorreceptores D2 no CB de rato que controlam a libertação de CA através de um mecanismo de feed-back negativo. b) o sulpiride, um antagonista dos receptores D2, aumentou a libertação de CA das células quimiorreceptoras revertendo o efeito inibitório da cafeína sobre esta mesma libertação; c) a propilnorapomorfina, um agonista D2 inibiu a libertação basal e evocada de CA sendo este efeito revertido pela NECA, um agonista dos receptores A2B. O facto de a NECA potenciar o efeito do haloperidol na libertação de CA sugere que a interacção entre os receptores D2 e A2B poderia também ocorrer ao nível de segundos mensageiros, como o cAMP. 6) a ingestão crónica de cafeína em ratos controlo (normóxicos) não alterou significativamente a função basal do CB medida como a dinâmica dos seus neurotransmissores, dopamina, ATP e adenosina e como actividade quimiossensora do CSN. Contrariamente aos efeitos basais, a ingestão crónica de cafeína facilitou a resposta à hipóxia, dado que aumentou o efeito no volume minuto respiratórioapresentando-se também uma clara tendência para aumentar a actividade quimiossensora do CSN e aumentar a libertação de ATP e dopamina.7) após um período de 15 dias de hipóxia crónica era evidente o fenómeno de aclimatização dado que as respostas ventilatórias à hipóxia se encontram aumentadas, assim como a actividade quimiossensora do CSN basal e induzida pela hipóxia. As alterações observadas no metabolismo da dopamina, assim como na libertação basal de dopamina e de adenosina poderiam contribuir para a aclimatização durante a hipoxia crónica. A libertação aumentada de adenosina em resposta à hipóxia aguda em ratos hipóxicos crónicos sugere um papel da adenosina na manutenção/aumento das respostas ventilatórias à hipóxia aguda durante a hipóxia crónica. Observou-se também que a libertação de ATP induzida pela hipóxia aguda se encontra diminuída em hipóxia crónica, contudo a ingestão crónica de cafeína reverteu este efeito para valores similares aos valores controlo, sugerindo que a adenosina possa modular a libertação de ATP em hipóxia crónica. 8) a ingestão crónica de cafeína em ratos hipóxicos crónicos induziu o aumento do metabolismo de CA no CB, medido como expressão de tirosina hidroxilase, conteúdo, síntese e libertação de CA. 9) a ingestão crónica de cafeína não provocou quaisquer alterações na actividade quimiossensora do CSN em ratos hipóxicos crónicos no entanto, as respostas do CSN à hipóxia aguda intensa e moderada e à hipercapnia encontram-se diminuídas. Este efeito inibitório que provém da ingestão crónica de cafeína parece ser compensado ao nível dos quimiorreceptores centrais dado que os parâmetros ventilatórios em condições basais e em resposta à hipoxia aguda não se encontram modificados em ratos expostos durante 15 dias a uma atmosfera hipóxica. Resumindo podemos assim concluir que a adenosina quer em situações de hipoxia aguda quer em condições de hipoxia crónica tem um papel excitatório na actividade quimiossensora do CB actuando directamente nos receptores A2A presentes pós-sinapticamente no CSN, assim como facilitando a libertação de dopamina pré-sinapticamente via receptores A2B presentes nas células quimiorreceptoras. A interacção negativa entre os receptores A2B e D2 observadas nas células quimiorreceptoras do CB poderia explicar o aumento do metabolismo de CA observado após a ingestão crónica de cafeína em animais hipóxicos. Conclui-se ainda que durante a aclimatização à hipóxia a acção inibitória da cafeína, em termos de resposta ventilatória, mediada pelos quimiorreceptores periféricos é compensada pelos efeitos excitatórios desta xantina ao nível do quimiorreceptores centrais.------- RESUMEN Los cuerpos carotídeos (CB) son órganos emparejados que están localizados en la bifurcación de la arteria carótida común. Estos órganos son sensibles a variaciones en la PaO2, en la PaCO2, pH y temperatura siendo responsables de la hiperventilación que ocurre en respuesta a la hipoxia, contribuyendo también a la hiperventilación que acompaña a la acidosis metabólica y respiratoria. Las células quimiorreceptoras (tipo I o glómicas) del cuerpo carotídeo responden a las variaciones de gases arteriales liberando neurotransmissores que activan las terminaciones sensitivas del nervio del seno carotídeo (CSN) llevando la información al centro respiratorio central. Todavía esta por clarificar cual el neurotransmisor (o neurotransmisores) responsable por la señalización hipóxica en el CB. La adenosina es un neurotransmisor excitatório en el CB ya que aumenta la actividad del CSN e induce la hiperventilación a través de la activación de receptores de adenosina del subtipo A2. La importancia de estos efectos de la adenosina en la quimiorrecepción, descritos en ratas y gatos, ha sido fuertemente reforzada por resultados obtenidos en voluntarios sanos en los que la infusión intravenosa de adenosina induce hiperventilación y dispnea, efectos estés que han sido atribuidos a una activación del CB ya que la adenosina no cruza la barrera hemato-encefalica y el efecto es tanto más grande cuanto más cercana del CB es la administración. Este trabajo ha sido realizado con el objetivo de investigar cual el significado funcional de la adenosina en la quimiorrecepción en el CB en animales controlo y en animales sometidos a hipoxia crónica sostenida. Para alcanzar este objetivo se ha estudiado: 1) el efecto de la hipoxia moderada en la liberación de adenosina en una preparación in vitro de CB y la especificidad de esta liberación en comparación con otros tejidos no-quimiosensitivos, así como las vías metabólicas de producción y liberación de adenosina del órgano en normoxia y hipoxia; 2) la modulación de la liberación de adenosina/ATP de las células quimiorreceptoras del CB por receptores nicotínicos de ACh; 3) los efectos de la cafeína en el controlo periférico de la ventilación y la identidad de los receptores de adenosina involucrados en los efectos de la adenosina y cafeína en los quimiorreceptores del CB; 4) las interacciones entre los receptores D2 de dopamina y los receptores A2B de adenosina que modulan la liberación de catecolaminas (CA) en el CB de rata y; 5) el efecto de la ingestión crónica de cafeína, es decir, el bloqueo sostenido de los receptores de adenosina, simulando la dependencia de cafeína observada en la populación mundial del occidente, en la función del CB en ratas controlo y sometidas a hipoxia crónica sostenida. Los métodos utilizados en este trabajo incluirán: técnicas de biología molecular como imunocitoquímica y western-blot; técnicas bioquímicas, tales como la cuantificación de neurotransmissores por HPLC, bioluminescencia y métodos radioisotópicos; técnicas electrofisiológicas como el registro de potenciales eléctricos del nervio do seno carotídeo in vitro; y registros ventilatórios in vivo en animales no anestesiados y en libre movimiento (pletismografia). Se observó que: 1) la sensibilidad de los quimiorreceptores de CB esta correlacionada con un bajo umbral de liberación de adenosina en respuesta a la hipoxia ya que en respuesta a una hipoxia moderada (10% O2) la liberación de adenosina en el CB aumenta un 44%, sin embargo esta PaO2 no es un estimulo suficientemente fuerte para inducir la liberación de adenosina del ganglio cervical superior o del tejido arterial; se observó también que aproximadamente 40% de la adenosina liberada del CB proviene del catabolismo extracelular del ATP en normoxia y en hipoxia moderada, y que bajas PO2 inducen la liberación de adenosina vía activación del sistema de transporte equilibrativo ENT1. 2) la ACh modula la liberación de adenosina /ATP del CB en respuesta a la hipóxia moderada lo que sugiere que el papel excitatório de la ACh en la actividad quimiosensora incluye la activación indirecta de receptores purinérgicos por la adenosina y el ATP, indicando que la adenosina y el ATP pueden actuar como mediadores importantes en el proceso de quimiotransducción ya que: a) la activación de los receptores nicotínicos de ACh en el CB en normoxia estimula la liberación de adenosina (max 36%) que aparentemente proviene de la degradación extracelular del ATP. Se observó también que este aumento de adenosina en el CB en hipoxia ha sido antagonizado parcialmente por antagonistas de estos mismos receptores; b) la caracterización farmacológica de los receptores nicotínicos de ACh involucrados en la estimulación de la liberación de adenosina del CB ha revelado que los receptores nicotínicos de ACh involucrados son constituidos por sub-unidades α4ß2. 3) la adenosina modula la liberación de CA de las células quimiorreceptoras del CB a través de receptores de adenosina A2B ya que: a) la cafeína, un antagonista no selectivo de los receptores de adenosina, ha inhibido la liberación de CA en normoxia y en respuesta a estímulos de baja intensidad siendo ineficaz en la liberación inducida por estímulos de intensidad superior; b) el DPCPX y el MRS1754 ha mimetizado los efectos de la cafeína en el CB y el SCH58621 ha sido incapaz de inducir la liberación de CA lo que sugiere que los efectos de la cafeína son mediados por receptores A2B de adenosina que están localizados pré-sinapticamente en las células quimiorreceptoras del CB. 4) la aplicación aguda de cafeína ha inhibido en 52% la actividad quimiosensora del CSN inducida por la hipoxia siendo este efecto mediado respectivamente por receptores de adenosina A2A pós-sinápticos y A2B pré-sinápticos lo que indica que la actividad quimiosensora inducida por la hipoxia es controlada por la adenosina. 5) existe una interacción entre los receptores A2B y D2 que controla la liberación de CA del CB de rata ya que: a) el sulpiride, un antagonista de los receptores D2, ha aumentado la liberación de CA de las células quimiorreceptoras revertiendo el efecto inhibitorio de la cafeína sobre esta misma liberación; b) los antagonistas de los receptores D2, domperidona y haloperidol, han aumentado la liberación basal e evocada de CA de las células quimiorreceptoras confirmando la presencia de autorreceptores D2 en el CB de rata que controlan la liberación de CA a través de un mecanismo de feed-back negativo; c) la propilnorapomorfina, un agonista D2, ha inhibido la liberación basal e evocada de CA sendo este efecto revertido por la NECA, un agonista de los receptores A2B. Ya que la NECA potencia el efecto del haloperidol en la liberación de CA la interacción entre los D2 y A2B puede también ocurrir al nivel de segundos mensajeros, como el cAMP. 6) la ingestión crónica de cafeína en ratas controlo (normóxicas) no ha cambiado significativamente la función basal del CB medida como la dinámica de sus neurotransmisores, dopamina, ATP y adenosina y como actividad quimiosensora del CSN. Al revés de lo que pasa con los efectos básales, la ingestión crónica de cafeína facilitó la respuesta a la hipóxia, ya que ha aumentado la respuesta ventilatória medida como volumen minuto presentando también una clara tendencia para aumentar la actividad quimiosensora del CSN y aumentar la liberación de ATP y dopamina. 7. Después de un período de 15 días de hipoxia crónica se puede observar el fenómeno de climatización ya que las respuestas ventilatórias a la hipoxia están aumentadas, así como la actividad quimiosensora del CSN basal e inducida por la hipoxia. Los cambios observados en el metabolismo de la dopamina, así como en la liberación basal de dopamina y de adenosina podrían contribuir para la climatización en hipoxia crónica. El aumento en la liberación de adenosina en respuesta a la hipoxia aguda en ratas sometidas a hipoxia crónica sugiere un papel para la adenosina en el mantenimiento/aumento de las respuestas ventilatórias a la hipoxia aguda en hipoxia crónica sostenida. Se ha observado también que la liberación de ATP inducida por la hipoxia aguda está disminuida en hipoxia crónica y que la ingestión crónica de cafeína reverte este efecto para valores similares a los valores controlo, sugiriendo que la adenosina podría modular la liberación de ATP en hipoxia crónica. 8. la ingestión crónica de cafeína ha inducido el aumento del metabolismo de CA en el CB en ratas hipóxicas crónicas, medido como expresión de la tirosina hidroxilase, contenido, síntesis y liberación de CA. 9. la ingestión crónica de cafeína no ha inducido cambios en la actividad quimiosensora del CSN en ratas hipóxicas crónicas sin embargo las respuestas do CSN a una hipoxia intensa y moderada y a la hipercapnia están disminuidas. Este efecto inhibitorio que es debido a la ingestión crónica de cafeína es compensado al nivel de los quimiorreceptores centrales ya que los parámetros ventilatórios en condiciones básales y en respuesta a la hipoxia aguda no están modificados en ratas expuestas durante 15 días a una atmósfera hipóxica. Resumiendo se puede concluir que la adenosina en situaciones de hipoxia aguda así como en hipoxia crónica tiene un papel excitatório en la actividad quimiosensora del CB actuando directamente en los receptores A2A localizados pós-sinapticamente en el CSN, así como controlando la liberación de dopamina pré-sinaptica vía receptores A2B localizados en las células quimiorreceptoras. Las interacciones entre los receptores A2B y D2 observadas en las células quimiorreceptoras del CB podrían explicar el aumento del metabolismo de CA observado después de la ingestión crónica de cafeína en animales hipóxicos. Por fin, pero no menos importante se puede concluir que durante la climatización a la hipoxia la acción inhibitoria de la cafeína, medida como respuesta ventilatória, mediada por los quimiorreceptores periféricos es compensada por los efectos excitatórios de esta xantina al nivel de los quimiorreceptores centrales.

Desenvolvimento de um método potenciométrico para deteção de salmonella typhimurium

A Salmonella é um microrganismo responsável por grande parte das doenças alimentares, podendo por em causa a saúde pública da área contaminada. Uma deteção rápida, eficiente e altamente sensível e extremamente importante, sendo um campo em franco desenvolvimento e alvo de variados e múltiplos estudos na comunidade cientifica atual. Foi desenvolvido um método potenciométrico para a deteção de Salmonellas, com elétrodos seletivos de iões, construídos em laboratório com pontas de micropipetas, fios de prata e sensores com composição otimizada. O elétrodo indicador escolhido foi um ESI seletivo a cadmio, para redução da probabilidade de interferências no método, devido a pouca abundancia do cadmio em amostras alimentares. Elétrodos seletivos a sódio, elétrodos de Ag/AgCl de simples e de dupla juncão foram também construídos e caracterizados para serem aplicados como elétrodos de referência. Adicionalmente otimizaram-se as condições operacionais para a analise potenciométrica, nomeadamente o elétrodo de referencia utilizado, condicionamento dos elétrodos, efeito do pH e volume da solução amostra. A capacidade de realizar leituras em volumes muito pequenos com limites de deteção na ordem dos micromolares por parte dos ESI de membrana polimérica, foi integrada num ensaio com um formato nao competitivo ELISA tipo sanduiche, utilizando um anticorpo primário ligado a nanopartículas de Fe@Au, permitindo a separação dos complexos anticorpo-antigénio formados dos restantes componentes em cada etapa do ensaio, pela simples aplicação de um campo magnético. O anticorpo secundário foi marcado com nanocristais de CdS, que são bastante estáveis e é fácil a transformação em Cd2+ livre, permitindo a leitura potenciométrica. Foram testadas várias concentrações de peroxido de hidrogénio e o efeito da luz para otimizar a dissolução de CdS. O método desenvolvido permitiu traçar curvas de calibração com soluções de Salmonellas incubadas em PBS (pH 4,4) em que o limite de deteção foi de 1100 CFU/mL e de 20 CFU/mL, utilizando volumes de amostra de 10 ƒÊL e 100 ƒÊL, respetivamente para o intervalo de linearidade de 10 a 108 CFU/mL. O método foi aplicado a uma amostra de leite bovino. A taxa de recuperação media obtida foi de 93,7% } 2,8 (media } desvio padrão), tendo em conta dois ensaios de recuperação efetuados (com duas replicas cada), utilizando um volume de amostra de 100 ƒÊL e concentrações de 100 e 1000 CFU/mL de Salmonella incubada.

Electrospun Polyaniline-Reduced Graphene Oxide Composite Nanofibers Based High Sensitive Ammonia Gas Sensor

Ammonia is an important gas in many power plants and industrial processes so its detection is of extreme importance in environmental monitoring and process control due to its high toxicity. Ammonia’s threshold limit is 25 ppm and the exposure time limit is 8 h, however exposure to 35 ppm is only secure for 10 min. In this work a brief introduction to ammonia aspects are presented, like its physical and chemical properties, the dangers in its manipulation, its ways of production and its sources. The application areas in which ammonia gas detection is important and needed are also referred: environmental gas analysis (e.g. intense farming), automotive-, chemical- and medical industries. In order to monitor ammonia gas in these different areas there are some requirements that must be attended. These requirements determine the choice of sensor and, therefore, several types of sensors with different characteristics were developed, like metal oxides, surface acoustic wave-, catalytic-, and optical sensors, indirect gas analyzers, and conducting polymers. All the sensors types are described, but more attention will be given to polyaniline (PANI), particularly to its characteristics, syntheses, chemical doping processes, deposition methods, transduction modes, and its adhesion to inorganic materials. Besides this, short descriptions of PANI nanostructures, the use of electrospinning in the formation of nanofibers/microfibers, and graphene and its characteristics are included. The created sensor is an instrument that tries to achieve a goal of the medical community in the control of the breath’s ammonia levels being an easy and non-invasive method for diagnostic of kidney malfunction and/or gastric ulcers. For that the device should be capable to detect different levels of ammonia gas concentrations. So, in the present work an ammonia gas sensor was developed using a conductive polymer composite which was immobilized on a carbon transducer surface. The experiments were targeted to ammonia measurements at ppb level. Ammonia gas measurements were carried out in the concentration range from 1 ppb to 500 ppb. A commercial substrate was used; screen-printed carbon electrodes. After adequate surface pre-treatment of the substrate, its electrodes were covered by a nanofibrous polymeric composite. The conducting polyaniline doped with sulfuric acid (H2SO4) was blended with reduced graphene oxide (RGO) obtained by wet chemical synthesis. This composite formed the basis for the formation of nanofibers by electrospinning. Nanofibers will increase the sensitivity of the sensing material. The electrospun PANI-RGO fibers were placed on the substrate and then dried at ambient temperature. Amperometric measurements were performed at different ammonia gas concentrations (1 to 500 ppb). The I-V characteristics were registered and some interfering gases were studied (NO2, ethanol, and acetone). The gas samples were prepared in a custom setup and were diluted with dry nitrogen gas. Electrospun nanofibers of PANI-RGO composite demonstrated an enhancement in NH3 gas detection when comparing with only electrospun PANI nanofibers. Was visible higher range of resistance at concentrations from 1 to 500 ppb. It was also observed that the sensor had stable, reproducible and recoverable properties. Moreover, it had better response and recovery times. The new sensing material of the developed sensor demonstrated to be a good candidate for ammonia gas determination.

A molecularly imprinted sensor for sensitive detection of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG) oxidative stress biomarker

6th Graduate Student Symposium on Molecular Imprinting

Volume da Aurícula Esquerda: um "Velho" Cálculo Ecocardiográfico com uma Importância Prognóstica Renovada. Um Estudo em Doentes com Miocardiopatia Dilatada

Recentemente, surgiram alguns trabalhos que ressaltaram a importância do cálculo do volume da aurícula esquerda (VAE) como um marcador de eventos cardíacos adversos. Foi objectivo deste estudo avaliar a importância prognóstica deste parâmetro em doentes (dts) com deficiente função ventricular esquerda e correlacioná-lo com outros parâmetros clássicos de prognóstico – consumo de O2 (VO2 max) e pro-BNP (pBNP). Métodos: Analisou-se o volume da aurícula esquerda (VAE) por método de Simpson, numa população de 35 dts com cardiopatia dilatada (idiopática e isquémica) com fracção de ejecção (FE) 31±9,6% doentes (dts) eram de sexo masculino e a média de idades foi de 50,5±10,5 anos. Toda a população efectuou estudos de ecocardiografia convencional (incluindo avaliação por M-mode, bidimensional e Doppler), prova cardiorespiratória (VO2max) e doseamento de pro-BNP. O tempo médio de seguimento foi de 24 ± 4 meses, tendo-se considerado como eventos cardíacos (EC): internamento por insuficiência cardíaca, transplante e morte. Resultados: Dos parâmetros da ecocardiografia - o diâmetro da AE foi de 46,6±5,7mm, as dimensões do VE em diástole – 73,5±10mm e em sístole -58,9±11mm, a média da fracção de ejecção foi de 31±9,6%, o VAE foi de 78,6±33 ml, os volumes do VE foram de 214±82ml em diástole e de 153±75ml em sístole, 15 dts tinham padrão restritivo de enchimento ventricular (E/A>2), a média da área (Doppler cor) da insuficiência mitral foi de 4±3,3cm2, 14 dts tinham E/E’>15. O VO2 max médio foi de 20±5,8ml/kg/min e o pro-BNP de 3146±4629pg/mL. Para além da correlação de outros parâmetros clássicos ecocardiográficos com o prognóstico (volumes VE, FE e E/E’), o VAE e o volume indexado da AE (VAE/SC) mostraram uma correlação com o prognóstico (EC) com r=0,4 (p=0,02) que não se verificou para o diâmetro da AE (p=ns). Em relação à tolerância ao esforço, houve uma correlação inversa entre o diâmetro, o volume e o volume indexado da AE e o VO2max, com maior significado estatístico para o VAE e VAE/SC com r=-0,48, p=0,008. Quanto ao pro-BNP, quer o diâmetro, quer o VAE (ou volume indexado) tiverem o mesmo nível de significado estatístico (r=0,43; p=0,02). O valor predictivo de eventos (curvas ROC) para o VAE foi de 70ml e de 37ml/m2 para o VAE/m2. Conclusão: O volume da aurícula esquerda/volume indexado é um parâmetro ecocardiográfico com significado prognóstico em dts com deficiente função ventricular esquerda, correlacionando-se com a tolerância ao esforço e pro-BNP.

Calcium signaling and the novel anti-proliferative effect of the UTP-sensitive P2Y11 receptor in rat cardiac myofibroblasts

During myocardial ischemia and reperfusion both purines and pyrimidines are released into the extracellular milieu, thus creating a signaling wave that propagates to neighboring cells via membrane-bound P2 purinoceptors activation. Cardiac fibroblasts (CF) are important players in heart remodeling, electrophysiological changes and hemodynamic alterations following myocardial infarction. Here, we investigated the role UTP on calcium signaling and proliferation of CF cultured from ventricles of adult rats. Co-expression of discoidin domain receptor 2 and -smooth muscle actin indicate that cultured CF are activated myofibroblasts. Intracellular calcium ([Ca2+]i) signals were monitored in cells loaded with Fluo-4 NW. CF proliferation was evaluated by the MTT assay. UTP and the selective P2Y4 agonist, MRS4062, caused a fast desensitizing [Ca2+]i rise originated from thapsigargin-sensitive internal stores, which partially declined to a plateau providing the existence of Ca2+ in the extracellular fluid. The biphasic [Ca2+]i response to UTP was attenuated respectively by P2Y4 blockers, like reactive blue-2 and suramin, and by the P2Y11 antagonist, NF340. UTP and the P2Y2 receptor agonist MRS2768 increased, whereas the selective P2Y11 agonist NF546 decreased, CF growth; MRS4062 was ineffective. Blockage of the P2Y11receptor or its coupling to adenylate cyclase boosted UTP-induced CF proliferation. Confocal microscopy and Western blot analysis confirmed the presence of P2Y2, P2Y4 and P2Y11 receptors. Data indicate that besides P2Y4 and P2Y2 receptors which are responsible for UTP-induced [Ca2+]i transients and growth of CF, respectively, synchronous activation of the previously unrecognized P2Y11 receptor may represent an important target for anti-fibrotic intervention in cardiac remodeling.

O Volume da Aurícula Esquerda como Marcador Ecocardiográfico de Prognóstico em Doentes com Miocardiopatia Dilatada

Introdução: O aumento da aurícula esquerda (AE) é um marcador de mortalidade na população geral. Os doentes com miocardiopatia dilatada (MCD) têm um amplo espetro de tamanhos deAE, mas a importância clínica desta observação tem sido pouco estudada. Objectivo: Avaliar a importância prognóstica a longo prazo do volume da AE (VAE) em doentes com MCD. Métodos: Estudo prospetivo de doentes admitidos durante o ano de 2004 com o diagnóstico deMCD, em ritmo sinusal. Foi realizado estudo ecocardiográfico completo em repouso e após stress farmacológico. O endpoint composto considerou a assistência ventricular mecânica (AVM), a transplantação cardíaca ou a morte. Resultados: Foram incluídos 35 doentes (68,6% sexo masculino, idade média 52,0), 82,9% etiologia não isquémica. Fração ejeção em repouso 31,1 ± 9,4%.Durante o seguimento, oito doentes morreram, um foi colocado em AVM e um foi transplantado. A análise de Cox univariável revelou potenciais marcadores ecocardiográficos de prognóstico na amostra tais como a dimensão da AE em modo M (HR-1,12; IC: 0,99-1,26;p = 0,067); VAE (HR-1,02; IC: 1,00-1,04; p = 0,046); VAE ajustado à superfície corporal (HR-1,03;IC: 1,00-1,07; p = 0,049); E/A (HR-0,99; IC: 0,99-1,81; p = 0,060); E/A > 2 (HR-7,00; IC:1,48-32,43; p = 0,014) e E/E’ mitral (HR-1,04; IC: 1,00-1,09; p = 0,074). Na análise multivariável a única variável que permaneceu no modelo foi o VAE com o ponto de corte de 63 ml (HR-7,7, IC:0,97-60,61, p = 0,05).Conclusão: Nesta amostra, o VAE foi o único parâmetro ecocardiográfico determinante de AVM,transplantação cardíaca ou morte. Os parâmetros ecocardiográficos habitualmente utilizadospara estratificação de risco, tais como a fração ejeção do ventrículo esquerdo, a dimensão do ventrículo esquerdo e a reserva contrátil não tiveram valor prognóstico na nossa amostra.

HIGH SENSITIVE PCR METHOD FOR DETECTION OF PATHOGENIC Leptospira spp. IN PARAFFIN-EMBEDDED TISSUES

This study describes the development and application of a new PCR assay for the specific detection of pathogenic leptospires and its comparison with a previously reported PCR protocol. New primers were designed for PCR optimization and evaluation in artificially-infected paraffin-embedded tissues. PCR was then applied to post-mortem, paraffin-embedded samples, followed by amplicon sequencing. The PCR was more efficient than the reported protocol, allowing the amplification of expected DNA fragment from the artificially infected samples and from 44% of the post-mortem samples. The sequences of PCR amplicons from different patients showed >99% homology with pathogenic leptospires DNA sequences. The applicability of a highly sensitive and specific tool to screen histological specimens for the detection of pathogenic Leptospira spp. would facilitate a better assessment of the prevalence and epidemiology of leptospirosis, which constitutes a health problem in many countries.

Projeto de uma ETAR de 3200 habitantes equivalentes

A atividade humana e industrial usa a água para as suas atividades do quotidiano. A água é um recurso natural escasso cuja qualidade deve ser protegida, defendida, gerida e tratada em conformidade com o seu uso. Nesse âmbito, a gestão das águas prossegue objetivos de proteção da saúde humana e de preservação, proteção e melhoria da qualidade do ambiente[1]. Desde o final do seculo XIX até aos dias de hoje, verificou-se uma forte evolução nos sistemas de tratamento de águas residuais. Esta evolução foi fundamental para dar resposta às maiores exigências de qualidade do efluente tratado. O sistema de lamas ativadas é um dos processos de tratamento biológico das águas residuais mais usados em todo o mundo. Este trabalho consiste no desenvolvimento do projeto de conceção e dimensionamento de uma Estação de Tratamento de Águas Residuais (ETAR) para servir um pequeno aglomerado de cerca de 3200 habitantes equivalentes (hab.eq.), tendo como objetivo o dimensionamento de todas as etapas de tratamento necessárias ao cumprimento da legislação em vigor para a descarga das águas residuais urbanas no meio recetor. O Decreto-lei nº 152/97[2], relativo ao tratamento de águas residuais urbanas, juntamente com o Decreto-lei nº 149/2004[3] que identifica as zonas sensíveis e de zonas menos sensíveis, permitem que as entidades licenciadoras definam o grau de tratamento que a instalação deve possuir tendo em consideração a classificação do meio onde o efluente tratado é descarregado. O Decreto-Lei n.º 135/2009[1] estabelece o regime de identificação, gestão, monitorização e classificação da qualidade das águas balneares, impondo a qualidade microbiológica da água residual tratada mediante o meio recetor, e portanto conseguindo-se assim definir o tratamento de desinfeção a adotar. Resumidamente, a conceção do tratamento focou as seguintes etapas: tratamento preliminar formado por uma unidade compacta de tamisação, desarenador e desengordurador, tratamento secundário por lamas ativadas em regime de arejamento prolongado constituído por dois reatores com cerca de 400 m3 de volume seguido de um decantador com um diâmetro de 9.5 m, tratamento terciário de desinfeção composto por uma microtamisação seguido de desinfeção UV, e a utilização das operações comuns de espessamento e desidratação das lamas produzidas em excesso pelo tratamento, constituída por com um espessador gravítico com 4.6 m de diâmetro, e um filtro banda para a desidratação.