Extração e análise eletroforética em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de proteínas totais de folhas e raízes de Piper tuberculatum

O Estado do Pará é o principal produtor brasileiro de pimenta-do-reino (Piper nigrum Link), entretanto a sua produção tem sido bastante afetada pela doença conhecida como fusariose. O Fusarium solani f. sp. piperis é o agente causador desta doença que afeta o sistema radicular da planta, causando o apodrecimento das raízes e a queda das folhas levando à morte da planta. Algumas piperáceas nativas da região amazônica, entre elas a espécie Piper tuberculatum Jacq., têm se mostrado resistentes à infecção pelo F. solani f. sp. piperis, e desta forma têm sido utilizadas em estudos de interação planta-patógeno. Neste trabalho foram avaliadas cinco condições de extração de proteínas com o objetivo de selecionar tampões adequados para a extração de proteínas totais de folhas e raízes de P. tuberculatum. Os tampões utilizados para a extração de proteínas de raízes e folhas foram: tampão salino, tampão sacarose, tampão glicerol, tampão uréia e tampão fosfato de sódio. As análises quantitativas mostraram que os tampões sacarose, glicerol e uréia foram mais eficientes na extração de proteínas de folhas e raízes. Análises de SDS-PAGE mostraram padrões diferenciados de bandas em extratos protéicos de folhas e raízes obtidos com os diferentes tampões. Os resultados obtidos neste trabalho contribuem para a identificação de tampões de extração adequados para a obtenção de amostras de proteínas totais em estudos de interação P. tuberculatum - F. solani f. sp. piperis.

Determinação de vitamina A no leite de mães doadoras do banco de leite humano (BLH) de Manaus/AM: efeito do processamento

Esse estudo teve como objetivo determinar os teores de vitamina A no Leite Humano Materno (LHM), de 50 mães doadoras do Banco de Leite Humano (BLH), da Maternidade Ana Braga, em Manaus-AM. As amostras foram coletadas semanalmente e mantidas congeladas até a pasteurização. As análises de retinol e β-caroteno no leite humano foram realizadas antes e após o tratamento (pasteurização), mediante o método cromatográfico. Foram retiradas alíquotas de 5 mL aproximadamente de leite de cada amostra. Os pesos dos bebês ao nascer das mães doadoras de leite incluídos no estudo foram > 2500g. A concentração de vitamina A no leite tanto antes quanto após o processamento, não foram suficientes para suprir o requerimento (46,75 ± 6,28 μg/dL e 31,55 ± 8,29 μg/dL, respectivamente), de crianças que se alimentam exclusivamente do leite do BLH, notadamente as pré-termo, cujos requerimentos de vitamina A são maiores e a capacidade de ingerir leite é menor do que os nascidos a termo. A perda de vitamina A pelo processamento, em nosso estudo foi de 32,51%. Para garantir a formação de reservas hepáticas e a proteção contra deficiência de vitamina A, seriam necessárias concentrações dessa vitamina no leite superiores a 80 μg/dL.

Avaliação da concentração de proteínas e da atividade de α-galactosidases nos cotilédones e no eixo embrionário de sementes de Dalbergia nigra durante a germinação

Este trabalho teve como objetivos a quantificação de proteínas e da atividade da enzima α-galactosidase, no eixo embrionário e nos cotilédones, de sementes de Dalbergia nigra (jacarandá-da-bahia) durante a germinação. As sementes foram colocadas para embeber em água por sete dias, sendo retiradas amostras para a avaliação bioquímica e cinética da enzima. A atividade da enzima α-galactosidase aumenta com a embebição das sementes nos dois compartimentos, embora não esteja presente no eixo embrionário de sementes secas. A diferença na atividade da enzima entre os cotilédones e o eixo embrionário foi significativa. O pH 5,5 foi o de máxima atividade para as enzimas de ambos os compartimentos. A temperatura que mais estimulou a atividade da enzima nos cotilédones foi 50 ºC e de 50 a 60 ºC no eixo embrionário. A atividade da α-galactosidase foi inibida por β-mercaptoetanol e cobre, em ambos os compartimentos, enquanto a lactose e o cloreto de sódio estimularam a atividade tanto nos cotilédones como no eixo embrionário. Os valores de K M para enzimas do eixo embrionário e dos cotilédones foram de 0,239 e 0,228 mM, respectivamente.

Avaliação da distribuição de cobre associado a compostos de diferentes massas moleculares na polpa de açaí

Neste estudo, cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) com detecção por UV e detecção off-line por espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GF AAS) foi usada para investigar a associação de cobre a espécies de alta massa molecular (HMW) e baixa massa molecular (LMW) presentes na polpa de açaí (Euterpe oleracea Mart.). A concentração total de cobre obtida nos digeridos da polpa de açaí foi 10,5 µg g-1. Cobre foi encontrado associado às frações de HMW e LMW, correspondentes às massas moleculares de 28,7, 2,6 e 0,43 kDa.

Effect of fetal bovine serum on Candida glabrata cultures

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biomédica (área de especialização em Engenharia Clínica)

Development of a novel aptamer-based multi-sensor device for the detection of osteopontin

Doctoral Dissertation for PhD degree in Chemical and Biological Engineering

Development of nanohydrogels as a vehicle for the release of bioactive compounds in food matrices

PhD in Chemical and Biological Engineering

Métodos estadístico-computacionales para la caracterización de patrones de expresión de proteínas en 2D-DIGE

El volumen de datos provenientes de experimentos basados en genómica y poteómica es grande y de estructura compleja. Solo a través de un análisis bioinformático/bioestadístico eficiente es posible identificar y caracterizar perfiles de expresión de genes y proteínas que se expresan en forma diferencial bajo distintas condiciones experimentales (CE). El objetivo principal es extender las capacidades computacionales y analíticos de los softwares disponibles de análisis de este tipo de datos, en especial para aquellos aplicables a datos de electroforésis bidimensional diferencial (2D-DIGE). En DIGE el método estadístico más usado es la prueba t de Student cuya aplicación presupone una única fuente de variación y el cumplimiento de ciertos supuestos distribucionales de los datos (como independencia y homogeneidad de varianzas), los cuales no siempre se cumplen en la práctica, pudiendo conllevar a errores en las estimaciones e inferencias de los efectos de interés. Los modelos Generalizados lineales mixtos (GLMM) permiten no solo incorporar los efectos que, se asume, afectan la variación de la respuesta sino que también modelan estructuras de covarianzas y de correlaciones más afines a las que se presentan en la realidad, liberando del supuesto de independencia y de normalidad. Estos modelos, más complejos en esencia, simplificará el análisis debido a la modelización directa de los datos crudos sin la aplicación de transformaciones para lograr distribuciones más simétricas. Produciendo también a una estimación estadísticamente más eficiente de los efectos presentes y por tanto a una detección más certera de los genes/ proteínas involucrados en procesos biológicos de interés. La característica relevante de esta tecnología es que no se conoce a priori cuáles son las proteínas presentes. Estas son identificadas mediante otras técnicas más costosas una vez que se detectó un conjunto de manchas diferenciales sobre los geles 2DE. Por ende disminuir los falsos positivos es fundamental en la identificación de tales manchas ya que inducen a resultados erróneas y asociaciones biológica ficticias. Esto no solo se logrará mediante el desarrollo de técnicas de normalización que incorporen explícitamente las CE, sino también con el desarrollo de métodos que permitan salirse del supuesto de gaussianidad y evaluar otros supuestos distribucionales más adecuados para este tipo de datos. También, se desarrollarán técnicas de aprendizaje automática que mediante optimización de funciones de costo específicas nos permitan identificar el subconjunto de proteínas con mayor potencialidad diagnóstica. Este proyecto tiene una alta componente estadístico/bioinformática, pero creemos que es el campo de aplicación, es decir la genómica y la proteómica, los que mas se beneficiarán con los resultados esperados. Para tal fin se utilizarán diversas bases de datos de distintos experimentos provistos por distintos centros de investigación nacionales e internacionales

Estudios sobre aspectos bioquímicos, moleculares y funcionales de proteínas del citoesqueleto

Los microtúbulos son elementos del citoesqueleto celular y están constituidos por tubulina, la proteína cuantitativamente más importante y proteínas asociadas a microtúbulos (MAPs) conocidas como HMW y tau. En la célula los microtúbulos participan en numerosas funciones. En el caso de la enfermedad de Alzheimer, la red de microtúbulos se encuentra disminuida y se observa un acúmulo de manojos de filamentos de tau hiperfosforilada. En este proyecto se estudiará de qué manera el grado de fosforilación de tau influye sobre la formación de microtúbulos y sobre la interacción con tubulina, tau normal, MAP 1 Y MAP 2. Se espera tener un mayor conocimiento acerca de las causas por las cuales, en la enfermedad de Alzheimer, hay una alteración en la formación de microtúbulos y un acúmulo de filamentos helicoidales de tau hiperfosforilada. Otros aspectos de nuestros estudios están dirigidos a conocer la función post-traducción de detirosinación-tirosinación de la tubulina. En esta reacción participan dos enzimas: una carboxipeptidasa que remueve la tirosina del terminal COOH de la tubulina alfa y una ligasa que es capaz de reincorporar la tirosina removida. En este proyecto está programado obtener el cDNA de la ligasa de rata y analizar la secuencia y la expresión de la enzima, "in vivo", en diferentes tejidos. El rol funcional de la ligasa será analizado en líneas celulares y en cultivos primarios de células neuronales y no neuronales. Por último, otro aspecto en estudio está relacionado al reciente hallazgo en nuestro laboratorio, de que la tubulina hidrofóbica de membrana no es, como se venía sosteniendo desde hacía varios años, una proteína integral de membrana sino una proteína periférica. De acuerdo a nuestros resultados esta proteína contiene una alta proporción de la isoespecie acetilada. Aparentemente nuestros resultados indican que la proteína hidrofóbica proviene de microtúbulos que interaccionan con membranas. Nuestro objetivo es establecer si el carácter hidrofóbico constituye una propiedad intrínseca de la tubulina (que parece poco probable) o a la interacción con un componente de membrana. Los objetivos generales correspondientes al presente proyecto comprenden: a) Estudios acerca del rol que cumplen las MAPs en el mecanismo de la degeneración neurofibrilar en la Enfermedad de Alzheimer. b) Estudios moleculares acerca de la reacción de tirosinación/detirosinación de la tubulina: Rol funcional de la tubulina tirosina ligasa. c) Estudios acerca de las propiedades de la tubulina de membrana.

Estudios de proteínas y glicoconjugados en diferentes estados patológicos: Procesos demielinizantes y diarreas provocadas por bacterias toxigénicas

1) Estudios bioquímicos, inmunológicos e histológicos en encefalomielitis alérgica experimental (EAE): comprende el análisis de las diferentes alteraciones que ocurren en SNC durante el desarrollo de esta patología experimental. Se tratará de acotar los diferentes procesos que participan en la inducción activa de la enfermedad por inyección de antígenos de mielina, pasiva por sensibilización con diferentes poblaciones linfocitarias provenientes de animales enfermos, posterior recuperación o supresión de las diferentes alteraciones neuropatológicas por inducción de procesos de tolerancia inmunológica con antígenos mielínicos o sinaptosomales. Teniendo en cuenta la reacción inmunológica cruzada previamente descripta entre la proteína básica de mielina y sinapsina, se continuará con la caracterización de las poblaciones de linfocitos T que reconocen ambas proteínas por ensayos in vitro e in vivo. 2) Mecanismos de acción de enterotoxinas bacterianas: se estudia la posible participación de glicoconjugados (glicolípidos, mucinas y glicoproteínas de membrana) con actividad de grupo sanguíneo ABO (H) en relación al mecanismo de acción de algunas enterotoxinas bacterianas como toxina colérica y toxinas lábiles al calor producidas por E. coli aisladas de cepas que colonizan intestino humano (LTh) o porcino (LTp). Los objetivos específicos son extender nuestros estudios previos al intestino humano porque estas patologías afectan al hombre y además las estructuras químicas de los glicoconjugados en estudio son más variadas y están mejor dilucidades que en las especies animales anteriormente estudiadas (cerdo, conejo). Además, se planea realizar ensayos in vitro mediante la técnica de segmentos ligados de intestino de conejo con el objeto de estudiar si los glicolópidos y glicoproteínas de membrana con actividad de grupo sanguíneo ABH se comportan como receptores funcionales de alguna de las toxinas.

Interaccion de proteínas en estados intermediarios de plegamiento con membranas lipídicas

Comprender cómo una proteína adquiere su conformación tridimensional específica es un problema clave para la biología celular y molecular. Es un entretenido desafío intelectual y un problema de considerable importancia tecnológica debido al interés de expresar proteínas recombinantes biológicamente activas. Un fuerte incentivo es poder describir cómo ocurre el plegamiento en el medio celular, acoplado a la biosíntesis de la proteína y probablemente codificado por la secuencia primaria. La mayor parte de la información que disponemos, sin embargo, proviene de estudios estructurales, cinéticos, bioquímicos y termodinámicos in vitro de proteínas maduras. Particularmente importante pata la comprensión del problema del plegamiento ha sido la descripción de las rutas seguidas y de los estados intermedios de este proceso. Uno de estos estados intermedios es el glóbulo fundido: es un estado conformacional en el cual la proteína conserva su estructura terciaria. La proteína se encuentra parcialmente desplegada pero su grado de compactación es similar al del estado nativo. Aunque solo algunas proteínas pueden ser asimiladas en esa conformación, es aceptado que el glóbulo fundido es intermedio cinético entre la estructura nativa y la desplegada existencia universal. El estudio de proteínas en el estado de glóbulo fundido no sólo es relevante para comprender los procesos de plegamiento, sino también la inserción y translocación de proteínas solubles e intrínsecas en membranas lipídicas. (...) El objetivo general de este proyecto es estudiar las interacciones de proteínas en estados conformacionales intermedios con membranas lipídicas. El propósito es contribuir al conocimiento de los mecanismos por los cuales una proteína soluble puede, en ciertas circunstancias, penetrar y atravesar una membrana lipídica y estudiar de que manera el ambiente lipídico participa en el procesos de plegamiento de una proteína de membrana. Como modelo experimental se utilizará inicialmente a-lactoalbúmina, cuyo intermediario de plegamiento estable es el más estudiado y con la cual este grupo de trabajo posee experiencia. Se explorará también la posibilidad de utilizar otras proteínas, como anhidrasa carbónica, cuyos intermediarios de plegamiento pueden ser aislados. Se estudiarán particularmente los siguientes aspectos: 1. Estabilidad del intermediario en membrana 2. Estructura de intermediarios en membranas lipídicas. (...)

Estrategias estadístico-computacionales avanzadas para análisis de expresión de proteínas/genes en cáncer. Advanced statistical and computational strategies for protein/gene expression analysis in cancer.

El objetivo de este proyecto, enmarcado en el área de metodología de análisis en bioingeniería-biotecnología aplicadas al estudio del cancer, es el análisis y caracterización a través modelos estadísticos con efectos mixtos y técnicas de aprendizaje automático, de perfiles de expresión de proteínas y genes de las vías metabolicas asociadas a progresión tumoral. Dicho estudio se llevará a cabo mediante la utilización de tecnologías de alto rendimiento. Las mismas permiten evaluar miles de genes/proteínas en forma simultánea, generando así una gran cantidad de datos de expresión. Se hipotetiza que para un análisis e interpretación de la información subyacente, caracterizada por su abundancia y complejidad, podría realizarse mediante técnicas estadístico-computacionales eficientes en el contexto de modelos mixtos y técnias de aprendizaje automático. Para que el análisis sea efectivo es necesario contemplar los efectos ocasionados por los diferentes factores experimentales ajenos al fenómeno biológico bajo estudio. Estos efectos pueden enmascarar la información subycente y así perder informacion relavante en el contexto de progresión tumoral. La identificación de estos efectos permitirá obtener, eficientemente, los perfiles de expresión molecular que podrían permitir el desarrollo de métodos de diagnóstico basados en ellos. Con este trabajo se espera poner a disposición de investigadores de nuestro medio, herramientas y procedimientos de análisis que maximicen la eficiencia en el uso de los recursos asignados a la masiva captura de datos genómicos/proteómicos que permitan extraer información biológica relevante pertinente al análisis, clasificación o predicción de cáncer, el diseño de tratamientos y terapias específicos y el mejoramiento de los métodos de detección como así tambien aportar al entendimieto de la progresión tumoral mediante análisis computacional intensivo.

Importancia del Ca2+ en la fisiología espermática: modulación de su actividad por progesterona y proteínas del plasma seminal. Importance of calcium in sperm physiology: its regulation by progesterone and proteins from the seminal plasma.

El objetivo general del proyecto es estudiar el efecto de la progesterona y de algunas proteínas del plasma seminal sobre la actividad del Ca2+ en diferentes procesos fisiológicos que ocurren en el espermatozoide, los cuales están estrechamente relacionados con la capacidad fertilizante de esta célula. La progesterona, principal esteroide secretado por las células del cumulus oophorus, ejerce su efecto a través de un receptor no-genómico provocando aumento en el calcio intracelular de los espermatozoides y, consecuentemente, promoviendo la capacitación, la respuesta quimiotáctica y la exocitosis acrosomal. Pese a estas observaciones, los mecanismos a través de los cuales la progesterona estimula fenómenos tan diversos en el espermatozoide son aún desconocidos. Tampoco se conoce con exactitud el papel funcional y los mecanismos de acción de algunas proteínas del plasma seminal que interaccionan y se unen a los espermatozoides, con alta especificidad, durante la eyaculación. Por lo tanto, resulta altamente interesante profundizar los estudios sobre las propiedades funcionales de las proteínas caltrin (calcium transport inhibitor) y ß-microseminoprotein (MSP) del plasma seminal de mamíferos, las cuales responden a las características mencionadas. Los estudios hasta ahora realizados han dado cuenta de que caltrin inhibe la incorporación de Ca2+ extracelular, previene la exocitosis acrosomal espontánea y promueve la unión espermatozoide-zona pelúcida. También hay datos preliminares que sugieren un efecto inhibitorio sobre la movilidad hiperactivada de los espermatozoides. Respecto a MSP, sólo se sabe que inhibe la exocitosis acrosomal espontánea y que su contenido, en el plasma seminal, guarda una relación inversa con la fertilidad. Por todo lo expuesto, se propone estudiar los mecanismos de acción de la progesterona y las proteínas caltrin y MSP sobre los procesos fisiológicos antes indicados. Para ello, se estudiarán las variaciones de Ca2+ intracelular en espermatozoides individuales sometidos a diferentes tratamientos (gradientes de progesterona, capacitación en presencia y ausencia de caltrin y/o MSP, etc.), usando video microscopía de fluorescencia y análisis computarizado de imágenes. También se examinará la influencia de estas moléculas sobre la interacción de gametas y la fertilización.

Efecto de la incorporación de proteínas de origen vegetal sobre sistemas alimenticios basados en almidón. Effect of vegetal protein addition to gelled-starch food.

La soja y el maní son cultivos de gran importancia en la provincia de Córdoba y en la Argentina. La utilización de proteínas vegetales se ha incrementado notablemente debido a su alto valor nutricional y a sus atributos funcionales deseables. Las harinas de soja y de maní, subproductos de la extracción de aceite, presentan un alto contenido de proteínas vegetales de excelente calidad nutricional, de bajo precio y con escaso nivel de aprovechamiento en la industria alimenticia. Los concentrados de proteínas de soja son poco utilizados en la elaboración de alimentos, además el desarrollo de concentrados de proteínas de maní puede proveer a la industria de un nuevo ingrediente con alto contenido de proteínas para la formulación y fortificación de alimentos tradicionales. Los postres listos para consumir disponibles en el mercado, están formados por mezclas de almidón gelificado y derivados lácteos, sobre los que se agregan diversos aditivos alimentarios (como sacarosa, aromatizantes, espesantes, etc.). La incorporación de proteínas vegetales puede ser una eficaz forma de incrementar el nivel de proteínas y, en consecuencia, el valor nutricional de estos productos. Además de ser una alternativa a los alimentos elaborados con proteínas animales. Pese a que Córdoba es un gran productor de soja y maní, sus derivados no son empleados actualmente como ingredientes en este tipo de alimentos.El objetivo general de este proyecto es estudiar el efecto de la incorporación de proteínas de origen vegetal sobre las propiedades físico-químicas y funcionales de sistemas alimenticios basados en almidón gelatinizado, prestando fundamental atención a las interacciones que se establecen entre las diferentes moléculas. Se planifica obtener concentrados de proteínas a partir de harina desgrasada de soja y de maní y estudiar su composición y sus propiedades funcionales. Se elaborarán mezclas de los concentrados con almidones de maíz, mandioca y trigo. Se estudiará el comportamiento termo-mecánico de las mezclas y la calidad de los geles mediante la cantidad de agua liberada, el perfil reológico y el color. También se realizarán análisis sensoriales para la selección de los parámetros de calidad de los geles y se estudiarán la digestibilidad de las proteínas y del almidón. Al mismo tiempo se estudiarán las interacciones químicas y físicas entre los distintos componentes. Los resultados servirán para generar y difundir conocimientos sobre la relación entre las interacciones y la calidad de los productos, lo que facilitará la optimización de formulaciones y procesos.