Development of nanohydrogels as a vehicle for the release of bioactive compounds in food matrices

PhD in Chemical and Biological Engineering

One of the challenges of the food industry is to develop innovative systems that can produce high quality and safe foods while being efficient, environmentally acceptable and sustainable. To address this set of challenges, nanotechnology research is being focused in developing new structures that can be used to manipulate or assemble materials providing commercial, technological and scientific opportunities for the food industry. Protein-based nanohydrogels are hydrophilic three-dimensional polymer networks that are able to take up large amounts of water, while maintaining their internal network structure. Their interior network, the ability to encapsulate diverse classes of bioactive compounds and their capacity to response to the alteration of certain environmental stimuli, make of protein-based nanohydrogels a useful carrier of bioactive compounds. Due to these attractive characteristics protein-based nanohydrogels are potentially materials to be used in food industry. However, designing these nanostructures using natural biopolymers such as proteins and guarantee their stability preservation, and behavior within the human gastrointestinal system was a challenge yet to be addressed. Having this in mind, this thesis aims at evaluating the optimal conditions to obtain a stable nanohydrogel composed by two milk proteins (lactoferrina-Lf and glycomacropeptide-GMP) and analysing its stability when submitted to different environmental conditions, in order to predict its behaviour when used in different conditions. Results showed that spherical nanohydrogels with a hydrodynamic diameter around 170 nm and a PdI of 0.1 were obtained by gelation of the mixture of Lf and GMP solutions (molar ratio 1:7) at pH 5.0, heated at 80 °C, during 20 min. Nanohydrogels’ size and PdI revealed to be influenced when submitted at different conditions of pH, ionic strength and temperature. Toxicity measurements were performed to understand the ability of these protein nanohydrogels to be used e.g. in a food product and a negligible toxicity of nanohydrogels was observed when these were put in contact with Caco-2 cells. One of the limitations of using protein-based systems is their high sensitivity to physicochemical stresses during processing and storage. Two drying processes nano spray-drying and freeze-drying were tested to compare their effect on nanohydrogels´ properties. It was observed that spray-drying did not affect protein structure stability when compared to freeze-dried nanohydrogels, however the former were more sensitive to thermal degradation and agglomerates were formed upon rehydration. Curcumin and caffeine (used as lipophilic and hydrophilic model compounds, respectively) were successfully encapsulated in Lf-GMP nanohydrogels by thermal gelation showing high encapsulation efficiencies (> 90 %). It was also observed that loaded nanohydrogels maintained their spherical shape with sizes of 112 nm and 126 nm for curcumin and caffeine encapsulated in Lf-GMP nanohydrogels, respectively. The release mechanisms of bioactive compounds through Lf-GMP nanohydrogels were evaluated at pH 2 and pH 7, by fitting the Linear Superimposition Model to the experimental data. The bioactive compounds release was found to be pH-dependent: at pH 2, Fick’s diffusion was the governing mechanism while at pH 7 polymer was governing, instead (in the case of caffeine).At pH 7 curcumin was not released from Lf-GMP nanohydrogels. The degradation of the protein matrix in the gastro intestinal tract is an obstacle to the delivery of the encapsulated compounds at a specific target (e.g. mouth, stomach, small intestine or colon). A chitosan coating was thus applied by a layer-by-layer coating process in order to help reducing the degradation of the nanostructures. In vitro digestion was performed in a dynamic gastro intestinal model and results showed that the chitosan coating improved the stability of Lf and GMP (proteins were hydrolysed at a slower rate and were present in a solution for a longer time) during the gastric phase, thus improving the stability of protein nanohydrogels and the bioaccessibility of proteins. Moreover, it was observed that chitosan coating applied on the nanohydrogels also enhanced the bioaccessibility of bioactive compounds (i.e. curcumin and caffeine). Overall results suggest that the use of chitosan layer to coat protein-based nanohydrogels could be a good alternative to improve proteins´ stability during in vitro digestion and protect lipophilic and hydrophilic compounds, improving their bioaccessibility. In conclusion, this works showed that Lf-GMP nanohydrogels are a promising delivery system for encapsulation of lipophilic and hydrophilic bioactive compounds. This system can thus be an alternative to synthetic carriers, with potential applications in food and pharmaceutical industries.

Um dos maiores desafios da indústria alimentar é desenvolver sistemas inovadores que sejam capazes de aumentar a qualidade e a segurança dos alimentos sem perder de vista a sua sustentabilidade ambiental. Em resposta a estes desafios, vários estudos na área da nanotecnologia têm tido como objetivo o desenvolvimento de novas estruturas que permitam a modificação ou otimização de materiais que promovam oportunidades comerciais, tecnológicas e científicas para a indústria. Os nanohidrogéis de proteína são constituídos por cadeias poliméricas tridimensionais com elevada capacidade de reter água ao mesmo tempo que mantêm a sua estrutura interna intacta. A sua elevada área interna, capacidade em encapsular diferentes compostos bioativos e a sua resposta pré-determinada face a determinados estímulos ambientais, tornam estas estruturas bastante apelativas para a indústria alimentar. Contudo, a utilização de biopolímeros naturais como é o caso das proteínas traz inúmeros desafios, nomeadamente em termos de estabilidade, conservação e comportamento no sistema digestivo humano, que necessitam ser avaliados. Tendo em vista todos estes desafios, a presente tese pretende avaliar as melhores condições para desenvolver um nanohidrogel constituído por duas proteínas do leite (lactoferrina-Lf e o glicomacropetideo -GMP) e analisar a sua estabilidade face a diferentes estímulos ambientais que permitirá prever o seu comportamento em futuras aplicações alimentares. Desenvolveram-se nanohidrogéis constituídos por Lf e GMP com um tamanho de 170 nm e uma polidispersividade de 0.1 através de gelificação térmica da mistura de Lf com o GMP para uma razão molar de 1 para 7, a 80 ºC durante 20 min. Estudos de estabilidade em diferentes condições ambientais revelaram que os nanohidrogéis obtidos apresentaram diferentes tamanhos e valores de polidespersividade face a alterações de pH, temperatura e força iónica. Realizaram-se ensaios de toxicidade para avaliar a possibilidade de estas estruturas serem utilizadas em produtos alimentares e verificou-se que os nanohidrogéis não apresentaram toxicidade quando submetidos ao contacto com células Caco-2. Avaliaram-se dois métodos de secagem dos nanohidrogéis: liofilização e nano spray drying. Verificou-se que durante a secagem por nano spray drying a estrutura da proteína apresentou uma menor degradação do que nos nanohidrogéis secos por liofilização. Contudo, a sensibilidade térmica dos nanohidrogéis secos por nano spray-drying é superior e a sua reidratação originou a formação de aglomerados, contrariamente ao observado com os nanohidrogéis secos por liofilização. Encapsulou-se, curcumina e cafeína (utilizados como composto modelo lipofílico e como composto modelo hidrofílico, respetivamente) nos nanohidrogéis através de gelificação térmica, obtendo-se elevadas taxas de eficiência de encapsulação (> 90 %). O mecanismo de libertação dos compostos bioativos através dos nanohidrogéis foi avaliado a pH 2 e apH 7, através do ajuste do modelo matemático “Linear Superimposition Model” aos dados experimentais. Verificou-se que a libertação dos compostos é influenciada pelo pH: a pH 2, a libertação do composto ocorre preferencialmente por difusão de Fick e em pH 7 ocorre por relaxamento do polímero. Neste último caso, no entanto, apenas se observou libertação de cafeína a pH 7, a pH 7 não se observou a libertação da curcumina através dos nanohidrogéis. A aplicação de uma camada de quitosano nos nanohidrogéis de proteína permitiu aumentar a estabilidade da partícula durante a digestão gástrica in vivo, bem como diminuir a digestão das proteínas durante este período. Verificou-se ainda que com a aplicação desta camada foi possível aumentar a bioacessibilidade das proteínas e dos compostos bioativos encapsulados durante a digestão gastro intestinal in vivo. Em conclusão, este trabalho permitiu desenvolver um nanohidrogel a partir de duas proteínas com elevado teor nutricional e com inúmeras propriedades funcionais, o que além de permitir um futuro desenvolvimento de produtos alimentares (sumos, compotas, alimentos para atletas ou para crianças) tem um potencial impacto na saúde humana. Estes nanohidrogéis apresentaram ainda a possibilidade de incorporar diferentes compostos bioativos, o que amplia a sua versatilidade de aplicação na indústria alimentar. Foi ainda possível encontrar alternativas para que a sua ingestão seja prolongada no organismo humano, permitindo que estes consigam chegar aos locais onde ocorre a sua absorção (epitélio intestinal) e aumentar a sua eficiência. Os presentes nanohidrogéis surgem assim como um veículo de transporte de compostos bioativos que poderá ser utilizado na indústria alimentar e farmacêutica.

This thesis was financially supported by a PhD scholarship from Fundação para a Ciência e Tecnologia (Ref.: SFRH/BD/73178/2010), inserted in the Programa Potencial Humano Quadro de Referência Estratégico Nacional (POPH - QREN) Tipologia 4.1 – Formação Avançada. The POPH-QREN is co-financed by Fundo Social Europeu (FSE) and by Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES).