双壳贝类幼虫变态诱导及其机理研究

变态过程是双壳贝类由幼虫向成体转变的一个必不缺少的发育阶段。研究双壳贝类幼虫的变态过程及其机理，对于阐明它们的种群数量变动，促进重要经济双壳贝类增养殖的发展有重要的理论和实践意义。本论文除了用化学物质对几种双壳贝类(海湾扇贝、墨西哥湾扇贝和硬壳蛤)幼虫的变态进行诱导外，主要以激素和神经递质的作用方式为基础，通过直接测定双壳贝类(以海湾扇贝为代表)幼虫体内激素和神经递质、第二信使cAMP等生化物质含量的变化来研究双壳贝类幼虫变态过程中的信息传递途径，从分子生物学和神经生物学角度阐明双壳贝类幼虫变态机理。主要结果如下：1．通过参考国内外大量文献的基础上，较为系统地评述了近二十年来海洋无脊椎动物幼虫附着变态研究的一些进展情况，主要包括诱导因子、附着变态机理模型、人工诱导物的应用和延迟变态四个方面。到目前为止，人们已经发现了许多海洋无脊椎动物幼虫附着变态的诱导物质，主要分为天然诱导物和人工诱导物两大类，一些人工诱导物如GABA、肾上腺素和去甲肾上腺素已经在经济贝类苗种生产中得到应用。幼虫附着变态机理模型主要有长牡蛎(Crassostrea gigas)幼虫附着变态的双调控模型、红鲍(Haliotis rufescens)幼虫附着变态的上行调节模型以及多毛类Phragmatopoma california幼虫附着变态的脂肪酸调控模型。本论文还评述了海洋无脊椎动物幼虫发生延迟变态的原因以及延迟变态对海洋无脊椎动物造成的影响，并提出了解决的方法和今后研究的重点问题。2．在室内用氯化乙酰胆碱、ATP和CaCl_2 3种化学物质对海湾扇贝幼虫的变态进行了诱导实验。结果表明，虽然在个别浓度和处理时间氯化乙酰胆碱和ATP有诱导作用，但总体诱导效果不显著。而10×10~(-3)～40×10~(-3M的CaCl_2在处理12～24h后诱导效果较显著，其诱导效果对处理时间的依赖性较显著，在浓度为40×10~(-3)M和处理时间为24h时诱导效果最好，与对照组相比，变态率提高23.18％。3种诱导物对幼虫死亡率均有显著影响，并且死亡率对浓度和处理时间均有显著的依赖性，浓度越高，处理时间越长，死亡率越高。3．用KCl、肾上腺素、去甲肾上腺素和氯化胆碱进行了墨西哥湾扇贝(Argopectenirradians concentricus Say)幼虫变态的诱导作用实验。结果表明，KCl、肾上腺素、去甲肾上腺素和氯化胆碱对墨西哥湾扇贝幼虫变态均有显著诱导作用。KCl在处理时间为12h～48h范围内均有诱导作用；13.42×10~(-3)M和20.13×10~(-3)M的KCl诱导效果较好，变态率平均提高10％以上。1．O×10~(-6)M～50×10~(-6)M的肾上腺素在处理时间为lh～12h较适宜，此时变态率均提高10％以上。1.0×10~(-6)M～50×10~(-6)M的去甲肾上腺素在处理时间为1h～24h都较适宜，变态率平均均提高10％以上，最高可提高31．07％。0.01×10~(-4)M～1.O×10~(-4)M的氯化胆碱在处理时间为12h～48h时诱导效果均较好，它们之间的平均变态提高率并没有显著差别，均在12％～13％之间。10×10~(-4)M的氯化胆碱在处理时间为12h时诱导效果较明显，变态率可以提高19.14％，超过12h，变态率明显下降，100×10~(-4)M的氯化胆碱明显产生毒害作用，幼虫变态率均为零，而幼虫的死亡率均为100％。4．用KCl、肾上腺素、去甲肾上腺素、L-DOPA、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，Serotonin，5-HT)和GABA(γ-氨基丁酸)进行了不同浓度不同处理时间对硬壳蛤(Mercenaria mercenaria L.)幼虫变态诱导实验。结果表明，KCl、肾上腺素、去甲肾上腺素、L-DOPA和5-羟色胺对硬壳蛤幼虫的变态均有诱导作用，而GABA的诱导 作用不显著。KCl的最佳诱导浓度随处理时间不同而有所不同。当处理时间为1～24h时，KCl的最佳诱导浓度为33.56×10~(-3)M，此时幼虫变态率均提高24％以上，当处理时间为48h时，KCl的最佳诱导浓度为20.13～26.85×10~(-3)M，处理时间为72h时，最佳诱导浓度为13.42×10~(-3)M。肾上腺素和去甲肾上腺素的诱导作用与浓度和处理时间均有关。肾上腺素的最佳处理浓度为100×10~(-6)M，最佳处理时间均为8h，此时幼虫变态率提高最大，为36.97％。当去甲肾上腺素的诱导浓度为100×10~(-6)M，处理时间为8h～16h时，幼虫变态提高率较高，均大于18％，死亡提高率均低于30％，当去甲肾上腺索诱导浓度为500×10~(-6)M时，虽然在8h～16h的处理时间范围内，幼虫变态提高率也较高，均大于18％，但当处理时间超过8h，在16～48h范围内，幼 虫死亡提高率明显升高，均大于50％。L-DOPA的适宜诱导浓度为10×10~(-6)M～50×10~(-6)M，适宜处理时间为8～24h，此时幼虫变态率均提高30％以上，最高可提高79.43％。5-羟色胺的诱导作用较强，其适宜诱导浓度为100×10~(-6)M—1000×10~(-6)M，适宜处理时间为0.5～24h，此时幼虫变态率提高均在30％以上，当处理时间为8h时，最佳诱导浓度为1000×10~(-6)M，此时幼虫变态率提高57.5％，当处理时间为24h时，最佳诱导浓度为100×10~(-6)M，此时幼虫变态率提高69.29％。GABA的诱导作用较弱，最佳诱导浓度随处理时间的不同而有所不同。处理时间为24h和48h时，最佳诱导浓度为0.1×10~(-6)M；处理时间为0.5～16h时，最佳诱导浓度为100×10~(-6)M。5．KCl、肾上腺素、去甲肾上腺索、L-DOPA、5-羟色胺、GABA、茶碱和咖啡因8种诱导物对不同发育阶段海湾扇贝幼虫变态的诱导作用是不同的。13．42×10~(-3)M和20.13×10~(-3)M的KCl对第12天幼虫的变态有抑制作用，变态提高率为负值；之后当幼虫发育至第13和14天时，两浓度的KCl能够明显诱导幼虫变态，变态提高率均高于20％，而对于第16天的幼虫诱导作用有所减弱，变态提高率有所降低；26.85×10~(-3)M的KCl对第12和13天幼虫的变态均有抑制作用，变态提高率为负值，对第14和16天幼虫的变态却有明显的持续的诱导作用，变态提高率分别为22.98％和37.5％。神经递质肾上腺素、去甲肾上腺素、L-DOPA、5-羟色胺和GABA的诱导作用规律基本相似，即对第13天海湾扇贝幼虫的变态有明显的抑制作用，变态提高率均为负值，而对第14天幼虫的诱导作用较显著。茶碱和咖啡因作为影响细胞内cAMP的物质，它们的诱导作用规律与神经递质有所不同。它们对第13天海湾扇贝幼虫变态的诱导效果最好。6．测定了不同发育阶段及人工诱导后海湾扇贝幼虫体内去甲肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺含量的变化规律。结果表明，海湾扇贝幼虫体内去甲肾上腺索含量在变态前和变态后没有明显变化，变态前为2352(pg／mg湿重)，变态后为2770(pg／mg湿重)。多巴胺和5-羟色胺含量在变态前随幼虫的发育而增加，变态前(第13天)急剧增加，第13天的幼虫比第12天的幼虫分别增加了2.8倍和5.7倍，变态后急剧下降，变态后幼苗比第13天的幼虫分别降低了25.1倍和16.4倍。海湾扇贝幼虫体内DA：NE比和5-HT：NE比在变态前和变态后变化比较剧烈。DA：NE比和5-HT：NE比在变态前(第13天)急剧增加，第13天的幼虫比第12天的幼虫增加了3.O倍(DA：NE比)和5.0倍(5-HT:NE比)；变态后急剧降低，变态后幼苗比第13天的幼虫降低了29.8倍(DA：NE比)和19.5倍(5-HT：NE比)。海湾扇贝幼虫经KCl和氯化钙诱导24h后，体内去甲肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺以及DA：NE比和5-HT：NE比均有所降低。本实验的结果表明，多巴胺和5-羟色胺可能启动了海湾扇贝幼虫的变态过程。7．茶碱和咖啡因对墨西哥湾扇贝幼虫的变态均有明显诱导作用。它们的诱导作用均对浓度的依赖性较强，对处理时间的依赖性较弱。10×10~(-4)M的茶碱诱导效果最好，平均变态提高率达33％，其次为1.0×10~(-4)M和100×10~(-4)M的茶碱，平均变态提高率分别为23.15％和21.97％。处理时间对茶碱诱导效果影响不显著，在1～24h范围内，平均变态提高率在19.07～26.1％之间变动。10×10~(-4)M的咖啡因诱导效果最佳，4个处理时间的平均变态提高率为36.01％，其次为100×10~(-4)M，平均变态提高率为26.43％。处理时间对茶碱的诱导效果影响不大，在1～24h范围内，平均变态提高率在19.65～22.02％之间变动。8．采用直接测定cAMP的方法来研究cAMP是否参与了海湾扇贝幼虫的变态过程。结果表明，cAMP参与了海湾扇贝幼虫的变态过程。海湾扇贝幼虫体内cAMP含量随着发育阶段的不同而有所变化。在D形幼虫期最低，为73 pmol／(mg蛋白质)；当到达壳顶期幼虫时cAMP含量明显增加，比D形幼虫期提高了12.7倍。从壳顶期幼虫到眼点幼虫(100％，第13天)cAMP含量增加速度较慢，各发育阶段分别比前一发育阶段增加了0.4倍、0.3倍和0.2倍。但当幼虫变态后，体内cAMP含量又急剧增加，幼苗体内cAMP含量比眼点幼虫(100％，第13天)增加了6.1倍。当用KCl、肾上腺索和L-DOPA诱导后，幼虫体内cAMP含量明显增加，分别比对照组提高了7.8倍、1.5倍和10.7倍，说明cAMP参与了这3种诱导物诱导海湾扇贝幼虫变态的过程。9．在前面实验结果和参考有关文献的基础上，初步提出了以海湾扇贝为代表的双壳贝类幼虫变态机理模型：幼虫变态分为两个过程：启动过程和后续过程。当幼虫发育到一定阶段，在外界刺激因子的作用下，体内分泌多巴胺和5-羟色胺，多巴胺和5-羟色胺通过某种信号转导途径(如以DG和IP_3为第二信使)启动变态过程，变态过程启动后，又激活以cAMP为第二信使的信号转导途径(暂时称为后续过程)，两者共同完成了幼虫的变态过程。

南极普里兹湾大、中型浮游动物群落生态学研究

在南大洋生态系统中，桡足类既在初级生产和更高营养级之间起着承上启下的作用，也为大型浮游动物，主要是磷虾生物量年际变化和地区变化提供了很好的缓冲，磷虾存在时它是竞争者和捕食对象，磷虾缺乏时初级生产的转化主要由它承担。国际上对南极桡足类的研究在最近十年进展很快，尤其是生活史策略的研究取得了长足进步。我国对南极磷虾的研究已处于国际先进水平，但对桡足类等小型浮游动物来说却只是刚刚起步。本文利用中国第十三、十五次南极考察的浮游动物标本研了普里兹湾的游游动物群落结构和地理分布。随纬度的不同，普里兹湾存在三种群落类型，62－65°海域是以纽鳃樽为主的北部被囊群落，小型桡足类拟长腹剑水蚤（Oithona similis）和以哲水蚤（Paracalanus spp）在该区域密度最大，最大型的巨锚哲水蚤（Rhincalanus gigas）为该区所特有，并且只有62°S附近出现大量的无节幼体；65－67°S之间是尖角似哲水蚤（Calanoides acutus）和戈氏长腹水蚤（Metridia gerlachei）的分布高峰区，多毛类和毛颚类分布也较多，该地区由磷虾和桡足类交替控制；67°S以南至近岸为近岸群落，是晶磷虾（Euphausia crystallorophias）的分布区域，在我们的调查中由大量的磷虾幼体出现，无节幼体最大密度6000ind·m~(-2)，蚤状幼体达到6400ind·m~(-2)。划分北部和中部群落的指示种为纽鳃樽（Salpa thommpsoni）、巨锚哲水蚤和毛颚类；北部和近岸群落的指示种为巨锚哲水蚤、戈氏长腹水蚤和磷虾的蚤状幼体；中部群落和近岸群落之间的指示种是晶磷虾，磷虾的无节幼体和角突隆剑水蚤（Oncaea conifera）作为该区的指示种不是很明显。CHINARE－XV期间进行了桡足类优势种是产卵量培养实验，在调查其间尖角似哲水蚤和戈氏长腹水蚤分别有13.3和5只／雌的产卵量，尖角似哲水蚤表现为明显的双峰态种群结构，早期幼体占据绝大部分，表现为成长种群，CI最早出现在陆冰缘站的冰下推测生殖发生在十月至十一月间。巨锚哲水蚤的无节幼体集中出现于低纬度区，并没有发现有桡足幼体出现。

牡蛎染色体的分子生物学分析

本研究应用显带技术和荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术，鉴定了牡蛎的染色体；应用FISH方法定位了一系列的重复序列和大分子的P1克隆DNA；制备了染色体特异性探针。应用FISH特异性探针成功地鉴定了长牡蛎的三体10。结果如下：1．分析了G带和C带在美洲牡蛎染色体上的分布。G带在每一条染色体上的带型不同，某些染色体间(如第1对和第4对染色体，第7对和第9对染色体)的带型差别不是很明显。G带型容易受染色体收缩程度的影响。C带型重复性较好，染色体带型较清楚，分布在染色体的端粒区域和着丝粒区域。G带和C带带型能够用来鉴定牡蛎的染色体，但是重复性低和带型差异不显著，并不适合常规的染色体鉴定。2．早期胚胎和担轮幼虫制备的染色体适合于FISH分析。染色体制备方法重复性好，可适用于其它贝类的染色体制备。3．研究了重复序列基因--rDNA的定位：1)18S-5.8S rDNA在研究的五种巨蛎属Crassostrea牡蛎均只有一个位 点。太平洋种(C.gigas，C. ariakensis和C. plicatula)中，杂交信号位于最短的染色体一第10对染色体长臂的端粒区域，在大西洋种(C. virginica和C. rhizophorae)中，同一序列定位在第2对染色体短臂的端粒区域。2)18S-28S rDNA在两种蛤中有两个位点。rDNA探针定位在侏儒蛤(Mulinis Lateralis)的第15对和第19对染色体的端粒区域，同一序列定位在硬壳蛤(Mercenaria mercenaria)的第10对染色体的长臂和第12对染色体短臂的端粒区域。信号强度在两对染色体之间有差异。 3)5s rDNA位于美洲牡蛎的第5对染色体的短臂上靠近着丝粒区域和第6 对染色体的短臂的中间区域。信号强度在两对染色体之间没有显著差异。5S rDNA探针可以作为鉴定和识别第5对和第6对染色体的特异性探针。4．研究了一些重复序列的定位1)两个短的重复序列1G8，1P2均产生很强的荧光信号分布在美洲牡蛎所有的染色体上。在低严谨条件下，这些序列均产生很强的信号散布在所有的染色体上。在高严谨条件下，信号强度大大减弱，但是信号仍散布在所有的染色体上。这些重复序列散布在美洲牡蛎的整个基因组中。2)高度重复序列Cgl70产生的信号分布在长牡蛎的7对染色体的着丝粒区域，没有发现间区信号。在第1对，第2对，第4对和第7对染色体上的荧光信号强且稳定。在第5对，第8对和第10对染色体上的信号相对弱且不稳定。在剩余的染色体上(第3对，第6对和第9对染色体)没有检测到荧光信号。结果表明此卫星序列是一个着丝粒卫星序列。在美洲牡蛎的染色体上没有检测到荧光信号，表明了这个着丝粒卫星序列在这两种牡蛎中的分布存在着显著的差异。3)脊椎动物端粒序列(TTAGGG)n的FISH信号局限在四种双壳贝类(美洲牡蛎，the mangrove oyster，硬壳蛤，侏儒蛤)所有染色体的端粒区域，没有发现间区信号的存在。研究结果与已报道的研究结果表明脊椎动物端粒序列或许存在于所有双壳贝类的染色体末端。双壳贝类是目前研究过的唯一含有脊椎动物端粒序列DNA的无脊椎动物。4)研究了RAPD探针在美洲牡蛎染色体上的定位。大多数RAPD探针产生了多个信号散布在间期细胞核和所有的染色体上。引物OPX-03，OPX-04，OPX—06，OPG-02，OPM—04，OPM-11，0PS-02制备的探针在适宜的条件下产生特异性荧光 信号，分布在牡蛎的特定的染色体上。PCR特异性带产生的探针OPX—06—310和0PG-02—300产生了特异性的荧光信号：OPX—06—310产生的信号位于第5对染色体的短臂的近端粒区域，0PG—02—300探针定位到第3对染色体的短臂上。这两个探针是鉴定美洲牡蛎单条染色体的特异性探针。5．研究了大分子Pl克隆DNA(插入片断为80～100 kb)在美洲牡蛎染色体上的定位。Pl克隆DNA通过切口平移方法标记digoxigenin—11-dUTP用作FISH的探针。Cot-1 DNA作为竞争剂有效地抑制了Pl克隆序列中的重复序列产生的信号。杂交信号用fluorescein标记的anti—digoxigenin抗体来检测，用两层抗体rabbit-anti-sheep抗体和FITC anti—rabbit抗体来扩增信号。9个P1探针成功地定位在特定的染色体上。46—1探针杂交到第1对染色体的长臂靠近着丝粒区域；47-10探针定位到第2对染色体的长臂近端粒区域；Cvpl和48-13两探针定位到第3对染色体上：Cvpl位于短臂的端粒区域，48-13探针位于长臂的近着丝粒区域；48—10探针杂交到第4对染色体的长臂上；48-1探针杂交到第5对染色体长臂的近着丝粒区域；49-11探针位于第7对染色体长臂上；探针49-10和44-11位于第8对染色体长臂上。同时我们成功地将2个P1探针杂交到同一染色体分裂相中，进一步确定了Pl探针在美洲牡蛎染色体 上的定位。6．应用18S-28S rDNA探针成功地鉴定出长牡蛎非整倍体中的三体10。经鉴定AF-35，AF-39和AF-3三体家系属于三体10家系。rDNA探针分布在三条染色体上，即多出的一条染色体为染色体10。相应地在间期细胞核上有三个信号出现。AF-34和AF-36家系不属于三体10家系。rDNA探针分布在两条染色体上，相应地在间期细胞核上有两个信号出现。FISH和染色体特异性探针为非整倍体的鉴定提供了一个快速准确可靠的方法和途径。

改性粘土治理有害赤潮对生态环境的影响初探

本文以室内实验为基础，研究了改性粘土治理有害赤潮的方法对生态环境的影响。研究结果表明：有机和无机改性粘土对溶解氧（DO）、化学耗氧量（COD）、pH等主要水质因子均有改善作用；对营养盐，尤其是磷酸盐有一定的吸附作用，在外加磷酸盐为0-0.3μmol/ml范围内，吸附量随水体中磷酸盐浓度的增加而增大，有机改性粘土对海水中磷酸盐的吸附能力为：有机改性粘土Ⅰ>有机改性粘土Ⅱ>有机改性粘土Ⅲ。通过有机改性粘土对磷酸盐的吸附－再释放情况，进一步探讨了其磷酸盐的释放对赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）、东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）等赤潮生物生长的影响。实验结果显示，经过有机改性的粘土有利于提高其对磷酸盐的吸附能力，降低对磷酸盐的解吸率，利用有机改性粘土治理赤潮可以缓解海水富营养化程度，即使被吸附的部分磷酸盐能缓慢释放，但仍不足以维持赤潮生物的正常生长。无机改性粘土对磷酸盐和硝酸盐与有机改性粘土有相似的吸附性能。其添加剂PAC的重金属含量符合沉积物排放要求，不会对环境造成压力。 其次，以太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)幼贝为对象，研究了有机改性粘土Ⅱ和无机改性粘土在对海洋底栖生物的影响。急性毒性试验中二者对牡蛎幼贝的半致死浓度（LC50）分别为4.62 g/L和2.67 g/L，均远远大于改性粘土去除赤潮藻的浓度。在能够有效去除赤潮微藻的粘土浓度条件下，经慢性毒性试验发现改性粘土对牡蛎幼贝成活率、生长和摄食略有降低，但无明显影响，在牡蛎幼贝鳃组织和消化道组织的超微结构中未发现机械损伤。 最后，研究了改性粘土在对去除有毒赤潮藻过程中对底栖生物的影响。以能产生麻痹性贝毒（PSP）的塔玛亚历山大藻（A. tamarense，ATHK）为例，研究了PSP在水体中和粘土沉积层中的分布，发现改性粘土去除塔玛亚历山大藻能有效降低水体中藻细胞浓度及其所携带的PSP毒素。由于藻细胞破裂, 虽然沉积层中藻细胞体内部分PSP毒素溢出，但通过塔玛亚历山大藻细胞不同组分对牡蛎的影响发现，细胞内容物和细胞碎片对牡蛎没有明显毒副作用，由此推断改性粘土对藻细胞絮凝沉降后,能降低对生物的不良影响。此外，室内实验模拟了去除赤潮生物塔玛亚历山大藻（A. tamarense，ATHK）、东海原甲藻 (P. donghaiense )、赤潮异弯藻 (H. akashiwo)过程中，比较改性粘土和赤潮微藻对生物体的影响发现改性粘土在去除赤潮藻过程中能提高牡蛎的存活率，进一步证明改性粘土在赤潮生物防控中，是一种有效的应急措施。

长牡蛎SNP标记的开发及多态性检测

长牡蛎是重要的经济养殖贝类，良种化、抗逆性状及快速生长个体的培育是长牡蛎养殖业得以持续发展的基础。目前飞速发展的分子标记辅助育种技术为优良品种的快速培育提供了理论基础和实践经验。本研究以长牡蛎为主要研究材料，探讨了长牡蛎SNP标记的筛选和多态性评价。 本研究利用已有长牡蛎EST库中的序列进行单核苷酸多态（SNP）标记开发。通过对长牡蛎（Crassostrea gigas）已有的EST序列数据库检索，经过序列聚类和拼接得到EST簇4548个，含有不少于4条EST序列的簇共1079个，经过进一步设置筛选条件，整理出可供利用的EST簇313个，得到候选SNP位点共计1140个。目前根据候选SNP位点共设计引物82组，通过片段长度差异等位基因特异性PCR（fragment length discrepant allele specific PCR，FLDAS-PCR）的分型方法，在一野生群体中进行检测和验证，结果共有17个SNP候选位点显示多态性，期望杂合度分布区间为0.088至0.506，观测杂合度分布区间为0.091至0.667；通过哈代-温伯格(HW) 平衡、连锁不平衡检验，结果显示除3个SNP位点的差异显著（P值<0.05）,不符合HW平衡之外，其他14个位点没有明显的连锁不平衡。对含有17个SNP的EST的共同序列进行BlastX分析，推测其功能并确定开放阅读框，从而预测17个SNP的性质。 本研究表明对于目前基因组学研究尚处在初级阶段的海洋生物物种，通过基于EST数据库的SNP开发是一条重要途径，可以有效弥补海洋生物基因组学滞后影响SNP标记开发的现状。

亚历山大藻对海产贝类胚胎和蒙古裸腹溞的影响及致毒机制研究

本文研究了典型有毒赤潮藻——亚历山大藻(Alexandrium)对海湾扇贝(Argopecten irradians Lamarck)、文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)和太平洋牡蛎(Ostrea gigas Thunberg)受精卵孵化的影响和致毒机制以及对蒙古裸腹溞(Moina mongolica Daday)生命活动的影响。此外，还针对我国赤潮发生特点，模拟研究了我国东海大规模赤潮对菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum (Adams et Reeve)）受精卵孵化和蒙古裸腹溞种群数量的影响。 结果发现：8株产PSP毒素的亚历山大藻：塔玛亚历山大藻( ATHK, AT5-1, AT5-3, ATCI02, ATCI03)，链状亚历山大藻, A. lusitanicum、微小亚历山大藻和2株不产PSP毒素的相关亚历山藻(AC-1, AS-1)对海湾扇贝受精卵的孵化均有显著抑制作用，说明在亚历山大藻属中，这种抑制作用具有一定的普遍性，并与PSP毒素的产生无直接关系，表明存在非PSP毒素的其它毒性物质。一种PSP标准毒素STX也没有这种抑制作用，进一步证明该抑制作用与PSP毒素不直接相关。 相关亚历山大藻AC-1对海湾扇贝、文蛤和太平洋牡蛎受精卵孵化的有显著的毒害作用，其藻液、重悬液、去藻液和内容物均显著影响受精卵的孵化。相关亚历山大藻AC-1对海湾扇贝、文蛤和太平洋牡蛎担轮幼虫细胞的超微结构有显著破坏作用，破坏膜结构和胞内结构，影响细胞内的功能器官如溶酶体的稳定性，使卵黄颗粒萎缩变形；对文蛤和太平洋牡蛎的受精卵显示出极强的毒害作用： 3000cells•ml-1时，使二者胚胎完全溶掉消失；在2000cells•ml-1的藻液中培养2h后，担轮幼虫的外膜发生溶解，整个幼体呈葡萄串样。相关亚历山大藻AC-1产生的这种毒性物质可能对贝类胚胎细胞的结构和功能有影响。 亚历山大藻对蒙古裸腹溞的毒性效应与不同藻种/藻株密切有关：塔玛亚历山大藻（AT-6, ATCI02）、链状亚历山大藻、A. lusitanicum和微小亚历山大藻不影响蒙古裸腹溞的存活，而塔玛亚历山大藻（ATHK、ATCI03和AT5-1）和相关亚历山大藻(AC-1, AS-1)有显著影响。蒙古裸腹溞能摄食塔玛亚历山大藻(AT-6, ATHK, ATCI02, ATCI03, AT5-1)，链状亚历山大藻, A. lusitanicum和微小亚历山大藻，很少或基本不摄食相关亚历山大藻。亚历山大藻影响蒙古裸腹溞的RNA/DNA比值和蛋白质含量以及Na+,K+-ATP酶活性。相关亚历山大藻AC-1对蒙古裸腹溞的存活有极强的毒性作用，藻液、重悬液、内容物和碎片均有显著影响；即使与3×106cells•ml-1小球藻混合，10和50cells•ml-1的相关亚历山大藻AC-1仍能使蒙古裸腹溞的产幼数和存活时间显著下降。亚历山大藻对蒙古裸腹溞生命活动的影响不仅与PSP毒素有关，还与非PSP毒素有关；蒙古裸腹溞可能也是研究有害藻急性和慢性毒性的一种理想生物。 应用菲律宾蛤仔胚胎和蒙古裸腹溞评价我国东海特大规模赤潮对海洋生物资源的潜在危害时发现：单种链状亚历山大藻对菲律宾蛤仔受精卵的孵化和蒙古裸腹溞的种群增长均有显著不利影响；单种东海原甲藻（1~10×104cells•ml-1）对菲律宾蛤仔受精卵的孵化没有影响；较低密度的东海原甲藻能维持蒙古裸腹溞（2~5×104cells•ml-1）的种群增长；较高密度的东海原甲藻对蒙古裸腹溞（10×104cells•ml-1）种群有显著的抑制作用。两种藻以赤潮密度混合后，适当密度的东海原甲藻能在一定程度上减轻链状亚历山大藻对菲律宾蛤仔受精卵和蒙古裸腹溞的毒性。可见，东海连年爆发的大规模赤潮不仅对浮游生态系统有不利影响，若同时爆发亚历山大藻赤潮，则对海洋浮游生态系统和贝类资源的恢复产生更加不利的影响。

牡蛎的比较解剖学及系统分类和演化的研究

本文对我国己发表的牡蛎作了详细的比较解剖学研究。在强蛎亚科（Pycnodonteinae）发现了第三个心耳－－右上心耳和与其相连的第三条回心静脉－－后静脉，这在双壳类中实属首次报道。第一次提出了牡蛎循环系统的两种类型，附心脏型和无附心脏型。两者之间的主要区别是：前者无肌套血管，其外套血液主要来自环外套动脉和附心脏，而后者由于无附心脏和环外套动脉，其外套血液主要来自肌套血管；前者是通过出鳃静脉和外套静脉分别将鳃前部和后部的血液送回心耳，而后者的外套静脉与外入鳃血管不通，鳃中的血液只能通过出鳃静脉回到心耳。根据外套腔的形态特点，本文将中国的牡蛎分为三种类型六个组。第一种类型，左右侧都具侧水腔，包括一个组；第二种类型，仅右侧具有侧水腔，包括四个组；第三种类型；不具侧水腔，包括一个组。在比较解剖学研究的基础上，文章还讨论了消化系统，神经系统，循环系统等一些主要系统的演化过程，并推测了现生牡蛎各属间的演化关系。提出了一些新的分类依据，发现了一个具有重要演化意义的单行属种，爪蛎属（Talonostrea），猫爪牡蛎（T. talonata）。澄清了目前世界上在舌骨蛎属（Hyotissa）、拟舌骨蛎属（Parahyotissa）、小蛎属（Saccostrea）和巨蛎属（Crassostrea）分类中的混乱。解决了我国牡蛎分类中存在己久的疑难问题，将己发表的20种牡蛎重新鉴定为15种，即舌骨牡蛎（Hyotissa hyotis），复瓦牡蛎（Parahyotissa imbricata）。中华牡蛎（P. sinensis），鸡冠牡蛎（Lopha cristagalli）。薄片牡蛎（Dendostren folium），缘齿牡蛎（D. cre-nulifera），褶牡蛎（Alectryonella plicatula），猫爪牡蛎（T. talonata），长牡蛎（Crassostrea gigas），近江牡（C. rivularis），拟近江牡蛎（Crassostrea sp.），僧帽牡蛎（Saccostrea cucullata），棘刺牡蛎（S. echinata），鹅掌牡蛎（Planostrea pestigris）和密鳞牡蛎（Ostrea denselamellosa）。它们分别隶属于二个科，曲蛎科（Grypheidae）和牡蛎科（Ostreidae）；四个亚科，强蛎亚科（Pycnodonteinae）。冠蛎亚科（Pycnodonteinae），巨蛎亚科（Lopheinae）和牡蛎亚科（Crassostreinae）。

海湾扇贝超氧化物歧化酶家族基因结构、表达和多态性分析

海湾扇贝Argopecten irradian Lamarck于1982年从美国引种到中国，由于具有较快的生长速度和很高的经济效益，海湾扇贝成为中国最主要的养殖贝类之一。近年来海湾扇贝养殖遇到了死亡率高等问题，深入开展海湾扇贝功能基因的研究，尤其是免疫相关基因及其机制研究并在此基础上寻找扇贝疾病防治的有效方法对海湾扇贝的健康养殖十分重要。 对于贝类免疫系统来说，其血细胞在先天性免疫防御中起着重要的作用。当受到外界病原侵染时，贝类血细胞的一个重要免疫反应就是吞噬作用。在吞噬病原过程中，受到病原侵染的贝类还会产生其他多种免疫反应，这些免疫反应将消耗大量的能量（ATP），产能的呼吸链会加速运转，由此也会引发与呼吸链相耦联的活性氧（ROS）的大量产生。这些活性氧具有极强的反应特性，能破坏病原微生物的结构和功能分子，实现对入侵病原的杀灭。利用活性氧对被吞噬的病原进行杀灭，这是吞噬作用消除病原抵御侵染的重要机制。但由于活性氧分子反应的非特异性，它们也会破坏宿主机体细胞内的功能蛋白分子、不饱和脂肪酸分子和核酸等，对细胞造成严重的伤害，进而导致机体生理机能的损伤和免疫系统的破坏。所以，及时消除病原感染机体内过量产生的ROS，维持相关细胞的正常代谢，对提高机体抵抗力和免疫力具有重要的作用。O2-是生物体内产生的第一种活性氧分子，其他的活性氧分子也是由它衍生而来，消除过量O2-是消除过量活性氧危害的第一步也是关键一步。生物体内，超氧化物歧化酶（SOD）是催化O2-发生歧化反应，消除O2-的关键酶。 首先，本文通过RACE方法获得了海湾扇贝SOD家族全部三种基因的cDNA全长并对其进行了序列的生物信息学分析，海湾扇贝AiCuZnSOD全长cDNA为1047个碱基，其中开放阅读框为459个碱基，编码152个氨基酸，与栉孔扇贝Chlamys farreri的CuZnSOD相似度为77.5%，与长牡蛎Crassostrea gigas的相似度为75%，与人的相似度为74.7%。AiMnSOD全长cDNA为1207个碱基，其中开放阅读框为678个碱基，编码226个氨基酸，序列比对结果发现AiMnSOD的氨基酸序列与虾夷扇贝Mizuhopecten yessoensis和皱纹盘鲍Haliotis discus hannai的相似度分别为85%和78.4%，与哺乳动物相似度也在68%~72%之间。AiECSOD全长cDNA为893个碱基，其中开放阅读框为657个碱基，编码218个氨基酸。AiECSOD与其它物种ECSOD相似度比较低。与线虫Brugia pahangi的相似度为27.9%，与疟蚊Anopheles gambiae的相似度为31.4%，与斑马鱼Danio rerio的相似度为27.8%，与人的相似度也只有28.6%，与同是贝类的长牡蛎ECSOD也只有28.1%的相似性。主要原因是AiECSOD的信号肽和肝磷脂结合区域在各物种中无同源性。 其次，采用qRT-PCR（quantitative real time PCR）方法分析三种SOD基因在不同组织中的表达情况，结果表明三种SOD基因的组织表达有所差异。AiCuZnSOD基因在鳃中表达水平最高，其次是血细胞和性腺，在外套膜、闭壳肌和肝胰脏表达水平较低。AiMnSOD基因在鳃中表达水平最高，其次是外套膜，在血细胞、性腺，而在肝胰脏和闭壳肌表达较弱。AiECSOD基因在血细胞中表达水平最高，其次是肝胰脏，在鳃、闭壳肌表达水平较低，而性腺和外套膜没有检测到。同时，采用qRT-PCR对鳗弧菌Vibrio angullarum感染后海湾扇贝血细胞中三种SOD基因mRNA表达变化进行了检测。AiCuZnSOD表达量在各个时间段没有显著差异(P > 0.05)。AiMnSOD的表达量在1.5 h时略有下降，在3 h时达到最高表达量，是空白组（0h）的3倍(P < 0.01)，从6 h到24 h表达量逐渐下降，24 h时表达量是空白组的1.6倍，24 h到48 h又稍有升高。AiECSOD的表达量在1.5 h时有所下降，是空白组的0.3倍（P < 0.05)，随后逐渐升高，在12 h时达到最高表达量，是空白组（0h）的4.5倍（P < 0.01），从24 h到48 h表达量逐渐下降并恢复到空白组的水平。在对照组，各个时间点没有显著差异（P > 0.05）。在鳗弧菌感染后，海湾扇贝三种SOD的表达并不一致，且差异比较显著。AiCuZnSOD被认为是构成性表达基因，其受外界刺激的影响最小，AiMnSOD和AiECSOD受刺激后表达上调比较明显。 第三，采用Genome-walking的方法得到了海湾扇贝三种SOD基因的基因组全长和近端启动子序列并对其进行了相关分析。AiCuZnSOD的基因组序列全长为4279bp，包含有4个外显子和3个内含子。AiMnSOD的基因组序列全长为10692bp，包含有4个外显子和3个内含子。AiECSOD的基因组序列全长为5276bp，包含有5个外显子和4个内含子。三种基因外显子和内含子的结合处序列遵循-AT/GT-原则。我们把海湾扇贝SOD家族的三个基因的近端启动子进行了比较分析。发现三种SOD在靠近起始密码子的位置都有Oct-1结合位点。三种SOD共有的转录位点有：Oct-1、C/EBPalp、Oct2.1、Sp-1和GATA-1。AiCuZnSOD和AiMnSOD共有的转录位点有：ICSBP、Ftz、TATA-box、C/EBPbeta和Antp。AiCuZnSOD和AiECSOD共有的转录位点有：AP-1和NFκB。AiMnSOD和AiECSOD共有的转录位点有：GR和ER。AiCuZnSOD独有的位点有：SRF、YY-1和NF-1。AiMnSOD独有的位点有：HNF-1、Hb、MEB、NF-muE1、Pit-1a和Eve。AiECSOD独有的位点有：CREB、RATA-alph、Kruppel-like和AP-3。 此外，通过构建原核表达载体，本研究对AiCuZnSOD和AiECSOD基因进行了体外重组表达，并对纯化的重组蛋白进行了酶活分析。酶活分析表明，重组AiCuZnSOD蛋白有较高的酶活和稳定性。 最后，我们对海湾扇贝三种SOD基因的部分区域，包括启动子、编码区，部分内含子区域进行了SNP检测，并对SOD基因部分SNP位点多态性和鳗弧菌敏感性进行了相关分析。三种SOD基因中，我们共发现了59个SNP位点，其中AiECSOD的SNP位点最多，特别是在启动子区，AiCuZnSOD和AiMnSOD多态性较低。其中AiCuZnSOD启动子区的-1739 T-C 位点的基因型和等位基因，AiECSOD启动子区的-498 A-T和-267 G-A等位基因频率，AiECSOD的第一个外显子38 Thr-Lys的多态性在敏感和抗菌群体中存在显著差异（P < 0.05）。

长牡蛎可存活四倍体的诱发机制和异源三倍体的诱发

采用乙酸地衣红染色技术（Acetic orcein staining technique）较系统地研究了长牡蛎 Crassostrea gigas (Thunberg)三倍体产生的卵子在受精且第一极体释放受抑制后的减数分裂过及染色体的分离行为以阐明可存活四倍体的产生体的机制。用浓度为0.5 mg/L的细胞松驰素B （CB）处理受卵以抑制其第一极体的释放。在观察到个别受精卵出现第一极体时开始CB处理，持续至对照组中50％的受精卵出现的第一极体。对处理组和对照组的受精卵从受精后隔5分钟取样一次，用卡诺氏液（Carnoy's fixative, 冰醋酸和甲醇按1：3的体积比充分混合）固家样品。采用0.5%的乙酸－地衣红染料进行受精卵的染色，而后压片观察受精卵染色体行为。长牡蛎三倍体产生的卵子，中期I同源染色体构型呈现单价体（Univalents）,二价体（Bivalents）、三价体（Trivalents）以及大于三价体的多价体（Multivalents）混合出更的特征。在第一极体释放受抑制的受精卵的第二次减数分裂过程中，可确认四种染色体分离类型：三极分离（Tripolar segregation） (54.5%)、联合二极分离（United bipolar segregation） (12%)、独立二级分离（Incomplete united bipolar segregation）(4%)。其余卵子的染色体分离行为（23％）不规律，呈现不同程度的紊乱，但总体看来介于上述四种分离类型之间。此外，某些特定的独立二级也可能是四位体形成的最主要的细胞遗传学体制。此外，某些特定的独立二极分离也可能产生四倍体。轻细胞体驰素B 处理的受精卵的减数分裂过程具有显著的不同步性，表现在三个方面：第一，在两个重复组之间，即两个雌体之间，存在第二次减数分裂的时间进程的不同步性；第二，同一个雌体产生的卵子之间的发育速度不同步性，表现为不同的卵子进入第一次减数分裂的时间不同；第三，同一卵子内的染色体之间，其行为有时存在的不同步性。另外，探讨了中心类在支配第二减数分裂时各种染色体分离行为的可能机制。以长牡蛎二倍体与近江牡蛎二倍体的染交作为对照，探讨了能长牡蛎四倍体与近江牡蛎二倍体杂并诱导异源三倍体的可行性。长牡蛎Crassostrea gigas (Thunberg)四倍体和二倍体与近江牡蛎Crassostrea rivularis (Gould)二倍体的杂交以及相应的对照组共进行了三批重复实验，杂交实验采用高密度的精子。研究结果表明，自交组平均受精率依次为94％（GG）、77％ （RR）,88% （G／GG）和85％ （GG／G）。双方差分析（ANOVA）表明，各自交组之间受精率没有显著差异（F＝3.118, P=0.132）。在杂交组，直接授精后180分钟，尚未观察到受精迹象，因而无法估计受精率。授精后48小时的孵化率各组之间差异很大，并经双方差分析（ANOVA）表明存在显著性差异，（F＝3.188, P=0.018）。其中GGR和RGG组的孵化率相近似，产生的幼虫数量明显少于对照组。在四种类型的杂交实验中，二倍体C. gigas (雌体) ＊ 二倍体 C. rivularis (雌体)（ＧＲ）早最成功的。虽基ＧＲ组幼虫的生长率低于对照组，但其存活率接近于对照组。长牡蛎四倍体与近江牡蛎二倍体杂交组（GR），在授精后两天的孵化率较低，但幼虫的生长状况与对照组接近。另外两个杂交组，即近江牡蛎二倍体与长牡蛎四倍体（RGG），二倍体近江牡蛎江与二倍体长牡蛎（RG），授精后两天的孵化率很低，幼虫生长得缓慢。三个重复组的GR杂交组和一个重复组的GGR杂交组获得稚贝。聚合酶链式反应／限制性酶切片段长度的多态性（PCR／PFLP）检支分析结果证实这些稚贝均是杂交种；流式细胞术分析结果证明GGR获得的稚贝是三倍体，从而证明获得了长牡蛎与近江牡蛎的异源三倍体。有迹象表明三倍体与二倍体杂交种之间（GGR对GR）存在生长上的差异。首先，GGR的眼点幼虫大约比GR组早出现5－7天即仅次于对照组GG，G／GG，和GG／G；第二，尽管仅获得少量GGR幼贝，这些幼贝在授精后90天的大小显著大于GR组的个体。在RGG和RG组中，幼虫没能存活到眼点幼点阶段。细胞学检查结果表明，杂交组的绝大多数卵子发育停滞在第一次减数分裂中期（Metaphase I）,这一过程至少持续到授精后180分钟。仅有2％的GGR 组的卵子在授精后180分钟进入第一次减数分裂后期）（Anaphase I）. 而在此时期，GR，RGG和RG组的卵子中，仍只观察到10第二价体（Bivalents）.

软体动物线粒体基因组学及分子系统发生研究

本研究以双壳纲、翼形亚纲、珍珠贝目、扇贝超科的栉孔扇贝(Chlamys farreri )、海湾扇贝(Argopecten irradians)和牡蛎超科巨蛎属(Crassostrea)的长牡蛎(C. gigas)、葡萄牙牡蛎(C. angulata)、熊本牡蛎(C. sikamea)、香港巨牡蛎(C. hongkongensis)和近江牡蛎(C. ariakensis)5种牡蛎及异齿亚纲、帘蛤目、帘蛤科的紫斑文蛤(Meretrix pethechialis)为研究对象，系统的研究了以上物种的线粒体基因组全序列的特点。并以线粒体12个蛋白质编码基因的序列，在氨基酸和核苷酸水平上构建了软体动物的分子系统发生树。本研究旨在为利用线粒体基因组全序列全面构建软体动物分子系统发生树，为软体动物的系统发生和进化研究提供一种新的思路和前期基础工作，本研究主要内容分为以下三个部分： 一、栉孔扇贝和海湾扇贝线粒体基因组序列分析及分子系统发生研究 采用Long-PCR技术扩增了栉孔扇贝和海湾扇贝线粒体全基因组，利用步移法结合文库构建的测序策略获得了线粒体基因组的序列。海湾扇贝线粒体全基因组长度为16,211 bp，栉孔扇贝接近全序列长度为20,789 bp。两个基因组都编码35个基因，包括12个蛋白质编码基因，2个rRNA和21个tRNA。与典型的动物线粒体基因组相比，两个基因组都缺少一个蛋白质编码基因atp8和2个trnS, 在海湾扇贝基因组中有1个trnF的重复，而在栉孔扇贝基因组中有1个trnM的重复。基因排列比较显示，尽管海湾扇贝、栉孔扇贝和巨扇贝分类学上属于同一扇贝科，但是它们的线粒体基因排列非常不同。在四种扇贝中，虾夷扇贝与栉孔扇贝的基因排列顺序非常相似；即使排除tRNA的比较，栉孔扇贝和海湾扇贝基因组仅仅共享三个小的基因块；而海湾扇贝与巨扇贝仅有一个相同的基因块。在所有的系统发生分析中，四种扇贝稳定的系统发生关系得到强有力的支持，海湾扇贝较其他三种扇贝较早的分化出来；栉孔扇贝比其他两种扇贝与虾夷扇贝亲缘关系更近。贝叶斯法和最大似然法分析都支持扇贝超科的单系发生。 二、巨蛎属牡蛎线粒体基因组全序列分析及分子系统发生研究 采用Long-PCR扩增技术和步移法结合文库构建的技术策略获得了巨蛎属C. gigas、C. angulata、C. sikamea、C. hongkongensis和C. ariakensis 5种牡蛎线粒体全基因组序列，并于GenBank已公布的美洲牡蛎C.virginica序列进行比较研究。C. gigas、C. angulata、C. sikamea、C. hongkongensis和C. ariakensis线粒体全基因组长度分别为18,225 bp、18,225 bp、18,243 bp、18,622 bp和18,414 bp，都长于C. virginica基因组17,244 bp的长度。本研究的5种牡蛎线粒体基因组都编码39个基因，包括12个蛋白质编码基因，2个rRNA和25个tRNA。与典型的线粒体基因组相比，都缺少一个蛋白质编码基因atp8，有trnM、trnK和trnQ 3个tRNA基因的重复，更特别的是基因组中的rrnL分为两段，这在其它线粒体基因组中未见报道，有一个重复的rrnS；而C. virginica基因组编码37个基因，与其他牡蛎相比，没有trnK和trnQ重复，只有一个rrnS。基因排列比较显示，巨蛎属的5种牡蛎C. gigas、C. angulata、C. sikamea、C. hongkongensis和C. ariakensis基因排列完全一致，而与C. virginica的基因排列相比仍然有较大的差别，有多个tRNA发生易位。系统发生分析显示，C. gigas和C. angulata首先聚在一起，然后与C. sikamea聚为一支。C. hongkongensis和C. ariakensis聚成一支。C. virginica为单独的一支。系统树清楚的显示出C. gigas和C. angulata以及C. hongkongensis和C. ariakensis非常近的亲缘关系，这也是长期以来，牡蛎分类学上的经典问题，有学者认为C. gigas和C. angulata为同一物种，线粒体基因组的数据显示C. gigas和C. angulata可能达到不同物种的差异。传统分类上的“近江牡蛎”的“白蚝”和“赤蚝”，线粒体序列差别明显，完全支持两种牡蛎新种名的制定。 三、紫斑文蛤线粒体基因组全序列分析及分子系统发生研究 采用Long-PCR扩增技术和步移法结合文库构建的技术策略获得了紫斑文蛤线粒体基因组全序列。该基因组全长19,567 bp，编码36个基因，包括12个蛋白质编码基因，2个rRNA和22个tRNA。与典型的线粒体基因组相比，缺少一个蛋白质编码基因atp8和1个trnS, 有1个trnQ基因的重复。基因排列比较显示，双壳类的基因排列在低的分类阶元时相对保守。在帘蛤科中，紫斑文蛤M. petechialis和菲律宾蛤仔V. philippinarum共享四个完全一致的基因块，两个大的基因块是cox1-L1-nad1-nad2-nad4L-I 和 cox2-P-cob-rrnL-nad4-H-E-S2-atp6-nad3-nad5，另两个小基因块只包括tRNA基因。在以氨基酸序列构建的分子系统树中，帘蛤科紫斑文蛤与菲律宾蛤仔首先聚在一起，然后，它们与A. tuberculata形成一个进化枝。这一枝与H. arctica结合起来，支持异齿亚纲单系发生。

Food sources of three bivalves living in two habitats of Jiaozhou Bay (Qingdao, China): Indicated by lipid biomarkers and stable isotope analysis

Food Sources of three filter-feeding bivalves from two habitats (intertidal oyster Crassostrea gigas, mussel Mytilus galloprovincialis. and subtidal cultured scallop Chlamys farreri) of Jiaozhou Bay (Qingdao,China) were determined by fatty acid and stable isotope in analysis. Cultured scallop was characterized by significant diatom markets such as 16:1/16:0 close to 1 and high ratio of 20:5(n - 3)/22:6(n - 3), hence we assume that the scallop mainly feeds on diatoms. Fatty acid biomarkers specific to bacteria and terrestrial materials were also found in considerable amounts in scallop tissue, which suggested that there were Substantial bacterial and terrestrial input into the food of the species. Intertidal oyster and mussel, however, exhibited significant flagellate marker. 22:6(n - 3). and lower level of diatom markers. which indicated that flagellates are also part of intertidal bivalves' Planktonic food Sources: meanwhile, high level of Chlorophyta fatty acid marker, Sigma 18:2(n - 6) + 18:3(n - 3), suggested that Ulva pertusa (Chlorophyta) seaweed bed supplied important food sources to intertidal bivalves. Additionally, result of stable isotope analysis showed that phytoplankton contributed 86.2 to 89.0% to intertidal bivalves' carbon budget; macroalga U. pertusa origin source had a contribution of MIX, to 11.0%, which indicated its role Lis in important supplemental food source to intertidal bivalves. From this study. it is concluded that the dietary difference of three bivalves probably relates to the different potential food sources in the scallop farm and intertidal zone in Jiaozhou Bay.

Chromosomal rearrangement in Pectinidae revealed by rRNA loci and implications for bivalve evolution

Karyotype and chromosomal localization of major (18-5.8-28S) and minor (5S) ribosomal RNA genes were studied in two species of Pectinidae, zhikong (Chlamys farreri) and bay (Argopecten irradians irradians) scallops. using fluorescence in situ hybridization (FISH). C. farreri had a haploid number of 19 with a karyotype of 3m + 4sm + 7sm-st + 4st + 1st-t, and A. i. irradians had a haploid number of 16 with a karyotype of 5st + 11t. In C. farreri, the major and minor rRNA genes had one locus each and were mapped to the same chromosome-Chromosome 5. In A. i. irradians, the major rRNA genes had two loci, located on Chromosomes 4 and 8, and the 5S rRNA gene was found at a third chromosome-Chromosome 10. Results of this and other studies indicate that karyotype of A. i. irradians (n = 16, 21 arms) is secondary and derived from an ancestral karyotype similar to that of C. farreri (n = 19, 38 arms) through considerable chromosomal loss and rearrangements. The ability to tolerate significant chromosomal loss suggests that the modal karyotype of Pectinidae and possibly other bivalves with a haploid number of 19 is likely tetraploid; i.e., at least one genome duplication has occurred during the evolution of Bivalvia.

Chromosomal mapping of major ribosomal rRNA genes in the hard clam (Mercenaria mercenaria) using fluorescence in situ hybridization

Karyotype and chromosomal location of the major ribosomal RNA genes were studied in the hard clam (Mercenaria mercenaria Linnaeus) using fluorescence in situ hybridization (FISH). Metaphase chromosomes were obtained from early embryos. Internal transcribed spacers (ITS) between major RNA genes were amplified and used as FISH probes. The probes were labeled with digoxigenin-11-dUTP by polymerase chain reaction and detected with fluorescein-labeled anti-digoxigenin antibodies. FISH with the ITS probes produced two to four signals per nucleus or metaphase. M. mercenaria had a haploid number of 19 chromosomes with a karyotype of seven metacentric, four metacentric or submetacentric, seven submetacentric, and one submetacentric or subtelocentric chromosomes (7M + 4M/SM + 7SM + 1SM/ST). Two ITS loci were observed: one located near the centromere on the long arm of Chromosome 10 and the other at the telomere of the short arm of Chromosome 12. FISH signals on Chromosome 10 are strong and consistent, while signals on Chromosome 12 are variable. This study provides the first karyotype and chromosomal assignment of the major RNA genes in M. mercenaria. Similar studies in a wide range of species are needed to understand the role of chromosomal changes in bivalve evolution.

Classification of common oysters from North China

Oysters are commonly found on rocky shores along China's northern coast, although there is considerable confusion as to what species they are. To determine the taxonomic status of these oysters, we collected specimens from nine locations north of the Yangtze River and conducted genetic identification using DNA sequences. Fragments from three genes, mitochondrial 165 rRNA, mitochondria! cytochrome oxidase I (COI), and nuclear 285 rRNA, were sequenced in six oysters from each of the nine sites. Phylogenetic analysis of all three gene fragments clearly demonstrated that the small oysters commonly found on intertidal rocks in north China are Crassostrea gigas (Thunberg, 1793), not C. plicatula (the zhe oyster) as widely assumed. Their small size and irregular shell characteristics are reflections of the stressful intertidal environment they live in and not reliable characters for classification. Our study confirms that the oysters from Weifang, referred to as Jinjiang oysters or C. rivularis (Gould, 1861), are C. ariakensis (Wakiya, 1929). We found no evidence for the existence of C. talienwhanensis (Crosse, 1862) and other Crassostrea species in north China. Our study highlights the need for reclassifying oysters of China with molecular data.

Identification of Crassostrea ariakensis and related oysters by multiplex species-specific PCR

Genetic markers are needed for rapid and reliable identification of oysters. In this study, we developed multiplex genus- and species-specific PCR markers for the identification of oysters from China. We used the mitochondrial cytochrome oxidase I (COI) and nuclear 28S ribosomal RNA genes for marker development. DNA sequences from different species were obtained from GenBank or by direct sequencing. Sequences were aligned, and genus- and species-specific nucleotides were identified. Primers were designed for genus/species-specific amplification to generate fragments of different sizes. A multiplex set of genus- and species-specific primers from the 28S gene was able to separate C. ariakensis and C. hongkongensis from other species and assign oysters to four genera. A set of species-specific COI primers provided positive identification of all five Crassostrea species from China, C. ariakensis, C. hongkongensis, C. angulata, C. gigas, and C. sikamea in a single PCR. The multiplex PCR assays do not require fluorescence-labeling or post-PCR enzyme digestion, providing a simple, fast and reliable method for the identification of oysters from China.