Angiogenesis and angioregression gene expression analyses in swine corpus luteum

The corpus luteum (CL) lifespan is characterized by a rapid growth, differentiation and controlled regression of the luteal tissue, accompanied by an intense angiogenesis and angioregression. Indeed, the CL is one of the most highly vascularised tissue in the body with a proliferation rate of the endothelial cells 4- to 20-fold more intense than in some of the most malignant human tumours. This angiogenic process should be rigorously controlled to allow the repeated opportunities of fertilization. After a first period of rapid growth, the tissue becomes stably organized and prepares itself to switch to the phenotype required for its next apoptotic regression. In pregnant swine, the lifespan of the CLs must be extended to support embryonic and foetal development and vascularisation is necessary for the maintenance of luteal function. Among the molecules involved in the angiogenesis, Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) is the main regulator, promoting endothelial cells proliferation, differentiation and survival as well as vascular permeability and vessel lumen formation. During vascular invasion and apoptosis process, the remodelling of the extracellular matrix is essential for the correct evolution of the CL, particularly by the action of specific class of proteolytic enzymes known as matrix metalloproteinases (MMPs). Another important factor that plays a role in the processes of angiogenesis and angioregression during the CL formation and luteolysis is the isopeptide Endothelin-1 (ET-1), which is well-known to be a potent vasoconstrictor and mitogen for endothelial cells. The goal of the present thesis was to study the role and regulation of vascularisation in an adult vascular bed. For this purpose, using a precisely controlled in vivo model of swine CL development and regression, we determined the levels of expression of the members of VEGF system (VEGF total and specific isoforms; VEGF receptor-1, VEGFR-1; VEGF receptor-2, VEGFR-2) and ET- 1 system (ET-1; endothelin converting enzyme-1, ECE-1; endothelin receptor type A, ET-A) as well as the activity of the Ca++/Mg++-dependent endonucleases and gelatinases (MMP-2 and MMP-9). Three experiments were conducted to reach such objectives in CLs isolated from ovaries of cyclic, pregnant or fasted gilts. In the Experiment I, we evaluated the influence of acute fasting on VEGF production and VEGF, VEGFR-2, ET-1, ECE-1 and ET-A mRNA expressions in CLs collected on day 6 after ovulation (midluteal phase). The results indicated a down-regulation of VEGF, VEGFR-2, ET-1 and ECE-1 mRNA expression, although no change was observed for VEGF protein. Furthermore, we observed that fasting stimulated steroidogenesis by luteal cells. On the basis of the main effects of VEGF (stimulation of vessel growth and endothelial permeability) and ET-1 (stimulation of endothelial cell proliferation and vasoconstriction, as well as VEGF stimulation), we concluded that feed restriction possibly inhibited luteal vessel development. This could be, at least in part, compensated by a decrease of vasal tone due to a diminution of ET-1, thus ensuring an adequate blood flow and the production of steroids by the luteal cells. In the Experiment II, we investigated the relationship between VEGF, gelatinases and Ca++/Mg++-dependent endonucleases activities with the functional CL stage throughout the oestrous cycle and at pregnancy. The results demonstrated differential patterns of expression of those molecules in correspondence to the different phases of the oestrous cycle. Immediately after ovulation, VEGF mRNA/protein levels and MMP-9 activity are maximal. On days 5–14 after ovulation, VEGF expression and MMP-2 and -9 activities are at basal levels, while Ca++/Mg++-dependent endonuclease levels increased significantly in relation to day 1. Only at luteolysis (day 17), Ca++/Mg++-dependent endonuclease and MMP-2 spontaneous activity increased significantly. At pregnancy, high levels of MMP-9 and VEGF were observed. These results suggested that during the very early luteal phase, high MMPs activities coupled with high VEGF levels drive the tissue to an angiogenic phenotype, allowing CL growth under LH (Luteinising Hormone) stimulus, while during the late luteal phase, low VEGF and elevate MMPs levels may play a role in the apoptotic tissue and extracellular matrix remodelling during structural luteolysis. In the Experiment III, we described the expression patterns of all distinct VEGF isoforms throughout the oestrous cycle. Furthermore, the mRNA expression and protein levels of both VEGF receptors were also evaluated. Four novel VEGF isoforms (VEGF144, VEGF147, VEGF182, and VEGF164b) were found for the first time in swine and the seven identified isoforms presented four different patterns of expression. All isoforms showed their highest mRNA levels in newly formed CLs (day 1), followed by a decrease during mid-late luteal phase (days 10–17), except for VEGF182, VEGF188 and VEGF144 that showed a differential regulation during late luteal phase (day 14) or at luteolysis (day 17). VEGF protein levels paralleled the most expressed and secreted VEGF120 and VEGF164 isoforms. The VEGF receptors mRNAs showed a different pattern of expression in relation to their ligands, increasing between day 1 and 3 and gradually decreasing during the mid-late luteal phase. The differential regulation of some VEGF isoforms principally during the late luteal phase and luteolysis suggested a specific role of VEGF during tissue remodelling process that occurs either for CL maintenance in case of pregnancy or for noncapillary vessel development essential for tissue removal during structural luteolysis. In summary, our findings allow us to determine relationships among factors involved in the angiogenesis and angioregression mechanisms that take place during the formation and regression of the CL. Thus, CL provides a very interesting model for studying such factors in different fields of the basic research.

Role of xanthophyll and water-water cycles in the protection of photosynthetic apparatus in Arbutus unedo and Arabidopsis thaliana

Photosynthetic organisms have sought out the delicate balance between efficient light harvesting under limited irradiance and regulated energy dissipation under excess irradiance. One of the protective mechanisms is the thermal energy dissipation through the xanthophyll cycle that may transform harmlessly the excitation energy into heat and thereby prevent the formation of damaging active oxygen species (AOS). Violaxanthin deepoxidase (VDE) converts violaxanthin (V) to antheraxanthin (A) and zeaxanthin (Z) defending the photosynthetic apparatus from excess of light. Another important biological pathway is the chloroplast water-water cycle, which is referred to the electrons from water generated in PSII reducing atmospheric O2 to water in PSI. This mechanism is active in the scavenging of AOS, when electron transport is slowed down by the over-reduction of NADPH pool. The control of the VDE gene and the variations of a set of physiological parameters, such as chlorophyll florescence and AOS content, have been investigated in response to excess of light and drought condition using Arabidopsis thaliana and Arbutus unedo.. Pigment analysis showed an unambiguous relationship between xanthophyll de-epoxidation state ((A+Z)/(V+A+Z)) and VDE mRNA amount in not-irrigated plants. Unexpectedly, gene expression is higher during the night when xanthophylls are mostly epoxidated and VDE activity is supposed to be very low than during the day. The importance of the water-water cycle in protecting the chloroplasts from light stress has been examined through Arabidopsis plant with a suppressed expression of the key enzyme of the cycle: the thylakoid-attached copper/zinc superoxide dismutase. The analysis revealed changes in transcript expression during leaf development consistent with a signalling role of AOS in plant defence responses but no difference was found any in photosynthesis efficiency or in AOS concentration after short-term exposure to excess of light. Environmental stresses such as drought may render previously optimal light levels excessive. In these circumstances the intrinsic regulations of photosynthetic electron transport like xanthophyll and water-water cycles might modify metabolism and gene expression in order to deal with increasing AOS.

Study of the antioxidant fraction in edible olive oils obtained from different technological systems and parameters

Questo lavoro di tesi è stato suddiviso in tre parti. L’argomento principale è stato lo “Studio della componente antiossidante di oli ottenuti da olive mediante l’utilizzo di diversi sistemi e parametri tecnologici”. E’ ben noto come la qualità ossidativa di un olio di oliva dipenda oltre che dalla sua composizione in acidi grassi, dalla presenza di composti caratterizzati da un elevata attività antiossidante, ovvero le sostanze fenoliche. I composti fenolici contribuiscono quindi in maniera preponderante alla shelf life dell’olio extravergine di oliva. Inoltre sono state riscontrate delle forti correlazione tra alcune di queste sostanze e gli attributi sensoriali positivi di amaro e piccante. E’ poi da sottolineare come il potere antiossidante dei composti fenolici degli oli vergini di oliva, sia stato negli ultimi anni oggetto di considerevole interesse, poiché correlato alla protezione da alcune patologie come ad esempio quelle vascolari, degenerative e tumorali. Il contenuto delle sostanze fenoliche negli oli di oliva dipende da diversi fattori: cultivar, metodo di coltivazione, grado di maturazione delle olive e ovviamente dalle operazioni tecnologiche poiché possono variare il quantitativo di questi composti estratto. Alla luce di quanto appena detto abbiamo valutato l’influenza dei fattori agronomici (metodi di agricoltura biologica, integrata e convenzionale) e tecnologici (riduzione della temperatura della materia prima, aggiunta di coadiuvanti in fase di frangitura e di gramolatura, confronto tra tre oli extravergini di oliva ottenuti mediante diversi sistemi tecnologici) sul contenuto in composti fenolici di oli edibili ottenuti da olive (paper 1-3-4). Oltre alle sostanze fenoliche, negli oli di oliva sono presenti altri composti caratterizzati da proprietà chimiche e nutrizionali, tra questi vi sono i fitosteroli, ovvero gli steroli tipici del mondo vegetale, che rappresentano la frazione dell’insaponificabile quantitativamente più importante dopo gli idrocarburi. La composizione quali-quantitativa degli steroli di un olio di oliva è una delle caratteristiche analitiche più importanti nella valutazione della sua genuinità; infatti la frazione sterolica è significativamente diversa in funzione dell’origine botanica e perciò viene utilizzata per distinguere tra di loro gli oli e le loro miscele. Il principale sterolo nell’olio di oliva è il β- sitosterolo, la presenza di questo composto in quantità inferiore al 90% è un indice approssimativo dell’aggiunta di un qualsiasi altro olio. Il β-sitosterolo è una sostanza importante dal punto di vista della salute, poiché si oppone all’assorbimento del colesterolo. Mentre in letteratura si trovano numerosi lavori relativi al potere antiossidante di una serie di composti presenti nell’olio vergine di oliva (i già citati polifenoli, ma anche carotenoidi e tocoferoli) e ricerche che dimostrano invece come altri composti possano promuovere l’ossidazione dei lipidi, per quanto riguarda il potere antiossidante degli steroli e dei 4- metilsteroli, vi sono ancora poche informazioni. Per questo è stata da noi valutata la composizione sterolica in oli extravergini di oliva ottenuti con diverse tecnologie di estrazione e l’influenza di questa sostanza sulla loro stabilità ossidativa (paper 2). E’ stato recentemente riportato in letteratura come lipidi cellulari evidenziati attraverso la spettroscopia di risonanza nucleare magnetica (NMR) rivestano una importanza strategica da un punto di vista funzionale e metabolico. Questi lipidi, da un lato un lato sono stati associati allo sviluppo di cellule neoplastiche maligne e alla morte cellulare, dall’altro sono risultati anche messaggeri di processi benigni quali l’attivazione e la proliferazione di un normale processo di crescita cellulare. Nell’ambito di questa ricerca è nata una collaborazione tra il Dipartimento di Biochimica “G. Moruzzi” ed il Dipartimento di Scienze degli Alimenti dell’Università di Bologna. Infatti, il gruppo di lipochimica del Dipartimento di Scienze degli Alimenti, a cui fa capo il Prof. Giovanni Lercker, da sempre si occupa dello studio delle frazioni lipidiche, mediante le principali tecniche cromatografiche. L’obiettivo di questa collaborazione è stato quello di caratterizzare la componente lipidica totale estratta dai tessuti renali umani sani e neoplastici, mediante l’utilizzo combinato di diverse tecniche analitiche: la risonanza magnetica nucleare (1H e 13C RMN), la cromatografia su strato sottile (TLC), la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e la gas cromatografia (GC) (paper 5-6-7)

Processo biotecnologico a cellule immobilizzate per la produzione di acidi grassi volatili da acque di vegetazione

Le acque di vegetazione (AV) costituiscono un serio problema di carattere ambientale, sia a causa della loro elevata produzione sia per l’ elevato contenuto di COD che oscilla fra 50 e 150 g/l. Le AV sono considerate un refluo a tasso inquinante fra i più elevati nell’ambito dell’industria agroalimentare e la loro tossicità è determinata in massima parte dalla componente fenolica. Il presente lavoro si propone di studiare e ottimizzare un processo non solo di smaltimento di tale refluo ma anche di una sua valorizzazione, utlizzandolo come materia prima per la produzione di acidi grassi e quindi di PHA, polimeri biodegradabili utilizzabili in varie applicazioni. A tale scopo sono stati utilizzati due bioreattori anaerobici a biomassa adesa, di identica configurazione, con cui si sono condotti due esperimenti in continuo a diverse temperature e carichi organici al fine di studiare l’influenza di tali parametri sul processo. Il primo esperimento è stato condotto a 35°C e carico organico pari a 12,39 g/Ld, il secondo a 25°C e carico organico pari a 8,40 g/Ld. Si è scelto di allestire e mettere in opera un processo a cellule immobilizzate in quanto questa tecnologia si è rivelata vantaggiosa nel trattamento continuo di reflui ad alto contenuto di COD e carichi variabili. Inoltre si è scelto di lavorare in continuo poiché tale condizione, per debiti tempi di ritenzione idraulica, consente di minimizzare la metanogenesi, mediata da microrganismi con basse velocità specifiche di crescita. Per costituire il letto fisso dei due reattori si sono utilizzati due diversi tipi di supporto, in modo da poter studiare anche l’influenza di tale parametro, in particolare si è fatto uso di carbone attivo granulare (GAC) e filtri ceramici Vukopor S10 (VS). Confrontando i risultati si è visto che la massima quantità di VFA prodotta nell’ambito del presente studio si ha nel VS mantenuto a 25°C: in tale condizione si arriva infatti ad un valore di VFA prodotti pari a 524,668 mgCOD/L. Inoltre l’effluente in uscita risulta più concentrato in termini di VFA rispetto a quello in entrata: nell’alimentazione la percentuale di materiale organico presente sottoforma di acidi grassi volatili era del 54 % e tale percentuale, in uscita dai reattori, ha raggiunto il 59 %. Il VS25 rappresenta anche la condizione in cui il COD degradato si è trasformato in percentuale minore a metano (2,35 %) e questo a prova del fatto che l’acidogenesi ha prevalso sulla metanogenesi. Anche nella condizione più favorevole alla produzione di VFA però, si è riusciti ad ottenere una loro concentrazione in uscita (3,43 g/L) inferiore rispetto a quella di tentativo (8,5 g/L di VFA) per il processo di produzione di PHA, sviluppato da un gruppo di ricerca dell’università “La Sapienza” di Roma, relativa ad un medium sintetico. Si può constatare che la modesta produzione di VFA non è dovuta all’eccessiva degradazione del COD, essendo questa nel VS25 appena pari al 6,23%, ma piuttosto è dovuta a una scarsa concentrazione di VFA in uscita. Questo è di buon auspicio nell’ottica di ottimizzare il processo migliorandone le prestazioni, poiché è possibile aumentare tale concentrazione aumentando la conversione di COD in VFA che nel VS25 è pari a solo 5,87%. Per aumentare tale valore si può agire su vari parametri, quali la temperatura e il carico organico. Si è visto che il processo di acidogenesi è favorito, per il VS, per basse temperature e alti carichi organici. Per quanto riguarda il reattore impaccato con carbone attivo la produzione di VFA è molto ridotta per tutti i valori di temperatura e carichi organici utilizzati. Si può quindi pensare a un’applicazione diversa di tale tipo di reattore, ad esempio per la produzione di metano e quindi di energia.

Produzione di bioetanolo da scarti lignocellulosici della canna da zucchero: condizioni di saccarificazione e fermentazione simultanee (SSF) e aspetti ambientali del processo

Il presente studio ha avuto l’obiettivo di indagare la produzione di bioetanolo di seconda generazione a partire dagli scarti lignocellulosici della canna da zucchero (bagassa), facendo riscorso al processo enzimatico. L’attività di ricerca è stata svolta presso il Dipartimento di Ingegneria Chimica dell’Università di Lund (Svezia) all’interno di rapporti scambio con l’Università di Bologna. Il principale scopo è consistito nel valutare la produzione di etanolo in funzione delle condizioni operative con cui è stata condotta la saccarificazione e fermentazione enzimatica (SSF) della bagassa, materia prima che è stata sottoposta al pretrattamento di Steam Explosion (STEX) con aggiunta di SO2 come catalizzatore acido. Successivamente, i dati ottenuti in laboratorio dalla SSF sono stati utilizzati per implementare, in ambiente AspenPlus®, il flowsheet di un impianto che simula tutti gli aspetti della produzione di etanolo, al fine di studiarne il rendimento energetico dell’intero processo. La produzione di combustibili alternativi alle fonti fossili oggigiorno riveste primaria importanza sia nella limitazione dell’effetto serra sia nel minimizzare gli effetti di shock geopolitici sulle forniture strategiche di un Paese. Il settore dei trasporti in continua crescita, consuma nei paesi industrializzati circa un terzo del fabbisogno di fonti fossili. In questo contesto la produzione di bioetanolo può portare benefici per sia per l’ambiente che per l’economia qualora valutazioni del ciclo di vita del combustibile ne certifichino l’efficacia energetica e il potenziale di mitigazione dell’effetto serra. Numerosi studi mettono in risalto i pregi ambientali del bioetanolo, tuttavia è opportuno fare distinzioni sul processo di produzione e sul materiale di partenza utilizzato per comprendere appieno le reali potenzialità del sistema well-to-wheel del biocombustibile. Il bioetanolo di prima generazione ottenuto dalla trasformazione dell’amido (mais) e delle melasse (barbabietola e canna da zucchero) ha mostrato diversi svantaggi: primo, per via della competizione tra l’industria alimentare e dei biocarburanti, in secondo luogo poiché le sole piantagioni non hanno la potenzialità di soddisfare domande crescenti di bioetanolo. In aggiunta sono state mostrate forti perplessità in merito alla efficienza energetica e del ciclo di vita del bioetanolo da mais, da cui si ottiene quasi la metà della produzione di mondiale di etanolo (27 G litri/anno). L’utilizzo di materiali lignocellulosici come scarti agricolturali e dell’industria forestale, rifiuti urbani, softwood e hardwood, al contrario delle precedenti colture, non presentano gli svantaggi sopra menzionati e per tale motivo il bioetanolo prodotto dalla lignocellulosa viene denominato di seconda generazione. Tuttavia i metodi per produrlo risultano più complessi rispetto ai precedenti per via della difficoltà di rendere biodisponibili gli zuccheri contenuti nella lignocellulosa; per tale motivo è richiesto sia un pretrattamento che l’idrolisi enzimatica. La bagassa è un substrato ottimale per la produzione di bioetanolo di seconda generazione in quanto è disponibile in grandi quantità e ha già mostrato buone rese in etanolo se sottoposta a SSF. La bagassa tal quale è stata inizialmente essiccata all’aria e il contenuto d’acqua corretto al 60%; successivamente è stata posta a contatto per 30 minuti col catalizzatore acido SO2 (2%), al termine dei quali è stata pretrattata nel reattore STEX (10L, 200°C e 5 minuti) in 6 lotti da 1.638kg su peso umido. Lo slurry ottenuto è stato sottoposto a SSF batch (35°C e pH 5) utilizzando enzimi cellulolitici per l’idrolisi e lievito di birra ordinario (Saccharomyces cerevisiae) come consorzio microbico per la fermentazione. Un obiettivo della indagine è stato studiare il rendimento della SSF variando il medium di nutrienti, la concentrazione dei solidi (WIS 5%, 7.5%, 10%) e il carico di zuccheri. Dai risultati è emersa sia una buona attività enzimatica di depolimerizzazione della cellulosa che un elevato rendimento di fermentazione, anche per via della bassa concentrazione di inibitori prodotti nello stadio di pretrattamento come acido acetico, furfuraldeide e HMF. Tuttavia la concentrazione di etanolo raggiunta non è stata valutata sufficientemente alta per condurre a scala pilota un eventuale distillazione con bassi costi energetici. Pertanto, sono stati condotti ulteriori esperimenti SSF batch con addizione di melassa da barbabietola (Beta vulgaris), studiandone preventivamente i rendimenti attraverso fermentazioni alle stesse condizioni della SSF. I risultati ottenuti hanno suggerito che con ulteriori accorgimenti si potranno raggiungere gli obiettivi preposti. E’ stato inoltre indagato il rendimento energetico del processo di produzione di bioetanolo mediante SSF di bagassa con aggiunta di melassa in funzione delle variabili più significative. Per la modellazione si è fatto ricorso al software AspenPlus®, conducendo l’analisi di sensitività del mix energetico in uscita dall’impianto al variare del rendimento di SSF e dell’addizione di saccarosio. Dalle simulazioni è emerso che, al netto del fabbisogno entalpico di autosostentamento, l’efficienza energetica del processo varia tra 0.20 e 0.53 a seconda delle condizioni; inoltre, è stata costruita la curva dei costi energetici di distillazione per litro di etanolo prodotto in funzione delle concentrazioni di etanolo in uscita dalla fermentazione. Infine sono già stati individuati fattori su cui è possibile agire per ottenere ulteriori miglioramenti sia in laboratorio che nella modellazione di processo e, di conseguenza, produrre con alta efficienza energetica bioetanolo ad elevato potenziale di mitigazione dell’effetto serra.

Tecniche di risparmio idrico a livello locale e mondiale. Approfondimento sulle buone pratiche agricole per un uso sostenibile dell'acqua

Oltre un miliardo di persone non ha oggi accesso all’acqua potabile; più di due miliardi è il numero di coloro che vivono in condizioni igienico-sanitarie realmente proibitive. Sono 80 i paesi nel mondo (con il 40% della popolazione totale) in cui si riscontra difficoltà di approvvigionamento e presenza di risorse idriche che mancano dei requisiti che dovrebbero essere assicurati per la tutela della salute: quotidianamente e sistematicamente il diritto di accesso all’acqua, che nessun individuo dovrebbe vedersi negato, viene violato. Scarsità di acqua e non omogenea distribuzione sulla superficie terrestre sono fattori che concorrono alla crisi della risorsa, cui contribuiscono processsi di natura ambientale (cambiamenti climatici, desertificazione), di natura economica (le sorti dell’industria agroalimentare, la globalizzazione degli scambi, il bisogno crescente di energia), di natura sociale (migrazioni, urbanizzazione, crescita demografica, epidemie), di natura culturale (passaggio dal rurale all’urbano, dall’agricoltura di sussistenza a quella di profitto). Nell’ottica di uno sviluppo sostenibile un aumento indiscriminato dell’offerta non può costituire soluzione al continuo incremento della domanda di acqua. Si rende pertanto necessaria la definizione di politiche e strumenti di cambiamento nei modelli di consumo e nella pianificazione che consentano una riduzione degli squilibri nella distribuzione e nella gestione della risorsa a livello domestico e civile, industriale, agricolo. L’uso efficiente, e quindi sostenibile, dell’acqua è da perseguirsi secondo le modalità: • Risparmio, inteso come minore consumo di acqua all’inizio del ciclo. • Riciclo dell’acqua in circuito chiuso, inteso come riuso dell’acqua di scarico, o uso multiplo dell’acqua. Una idonea utilizzazione dipende da una idonea progettazione, che abbia come finalità: • La destinazione in via prioritaria delle fonti e delle risorse di più elevata qualità agli usi idropotabili, con una graduale sostituzione del consumo per altri usi con risorse di minore pregio. • La regolamentazione dell’uso delle acque sotterranee, mediante la limitazione del ricorso all’impiego di pozzi solo in mancanza di forniture alternative per uso civile, industriale, agricolo. • L’incentivazione ad un uso razionale della risorsa, anche mediante l’attuazione di idonee politiche tariffarie. • L’aumento dell’efficienza delle reti di adduzione e distribuzione, sia civili che irrigue. • La promozione di uso efficiente, riciclo e recupero di acqua nell’industria. • Il miglioramento dell’efficienza ed efficacia delle tecniche di irrigazione. • La promozione del riutilizzo delle acque nei vari settori. • La diffusione nella pratica domestica di apparati e tecnologie progettati per la riduzione degli sprechi e dei consumi di acqua. In ambito agricolo la necessità di un uso parsimonioso della risorsa impone il miglioramento dell’efficienza irrigua, pari appena al 40%. La regione Emilia Romagna a livello locale, Israele a livello internazionale, forniscono ottimi esempi in termini di efficacia dei sistemi di trasporto e di distribuzione, di buona manutenzione delle strutture. Possibili soluzioni verso le quali orientare la ricerca a livello mondiale per arginare la progressiva riduzione delle riserve idriche sono: • Revisione dei costi idrici. • Recupero delle riserve idriche. • Raccolta dell’acqua piovana. • Miglioramento degli impianti di distribuzione idrica. • Scelta di metodi di coltivazione idonei alle caratteristiche locali. • Scelta di colture a basso fabbisogno idrico. • Conservazione della risorsa attraverso un sistema di irrigazione efficiente. • Opere di desalinizzazione. • Trasferimento idrico su vasta scala da un’area all’altra. Si tratta di tecniche la cui attuazione può incrementare la disponibilità media pro capite di acqua, in particolare di coloro i quali non ne posseggono in quantità sufficiente per bere o sono privi di sistemi igienico-sanitari sufficienti.

Studi funzionali e strutturali sul wildtype e sul mutante γM23-K della ATP sintasi di Rhodobacter capsulatus: ruolo dell'ADP e della forza protonmotiva nell'attivazione dell’enzima e nell'accoppiamento dell'idrolisi di ATP alla traslocazione protonica

Nel presente lavoro di tesi sono state messe a confronto le ATP sintasi wild-type e γM23-K in cromatofori del batterio fotosintetico Rhodobacter capsulatus sotto gli aspetti funzionale e regolatorio. Si pensava inizialmente che la mutazione, in base a studi riportati in letteratura condotti sull’omologa mutazione in E. coli, avrebbe indotto disaccoppiamento intrinseco nell’enzima. Il presente lavoro ha chiarito che il principale effetto della mutazione è un significativo aumento dell’affinità dell’enzima per l’ADP inibitorio, che ne determina il ridotto livello di ATP idrolisi e la rapidissima reinattivazione in seguito ad attivazione da forza protonmotiva. Il residuo 23 della subunità γ si trova posizionato in prossimità della regione conservata DEELSED carica negativamente della subunità β, e l’introduzione nel mutante di una ulteriore carica positiva potrebbe determinare una maggiore richiesta di energia per indurre l’apertura del sito catalitico. Un’analisi quantitativa dei dati di proton pumping condotta mediante inibizione parziale dell’idrolisi del wildtype ha inoltre mostrato come il grado di accoppiamento del mutante in condizioni standard non differisca sostanzialmente da quello del wild-type. D’altro canto, è stato recentemente osservato come un disaccoppiamento intrinseco possa venire osservato in condizioni opportune anche nel wild-type, e cioè a basse concentrazioni di ADP e Pi. Nel presente lavoro di tesi si è dimostrato come nel mutante l’osservazione del fenomeno del disaccoppiamento intrinseco sia facilitata rispetto al wild-type. È stato proprio nell’ambito delle misure condotte sul mutante che è stato possibile dimostrare per la prima volta il ruolo fondamentale della componente elettrica della forza protonmotiva nel mantenere lo stato enzimatico ad elevato accoppiamento. Tale ruolo è stato successivamente messo in luce anche nel wild-type, in parte anche grazie all’uso di inibitori specifici di F1 e di FO. Il disaccoppiamento intrinseco nel wild-type è stato ulteriormente esaminato anche nella sua dipendenza dalla rimozione di ADP e Pi; in particolare, oltre all’amina fluorescente ACMA, è stata utilizzata come sonda di ΔpH anche la 9-aminoacridina e come sonda di Δψ l’Oxonolo VI. In entrambi i casi il ruolo accoppiante di questi due ligandi è stato confermato, inoltre utilizzando la 9-aminoacridina è stato possibile calibrare il segnale di fluorescenza con salti acido-base, dando quindi una base quantitativa ai dati ottenuti. Noi riteniamo che il più probabile candidato strutturale coinvolto in questi cambiamenti di stato enzimatici sia la subunità ε, di cui è noto il coinvolgimento in processi di regolazione e in cambiamenti strutturali indotti da nucleotidi e dalla forza protonmotiva. In collaborazione con il Dipartimento di Chimica Fisica dell’Università di Friburgo è in atto un progetto per studiare i cambiamenti strutturali presumibilmente associati al disaccoppiamento intrinseco tramite FRET in singola molecola di complessi ATP-sintasici marcati con fluorofori sia sulla subunità ε che sulla subunità γ. Nell’ambito di questa tesi sono stati creati a questo fine alcuni doppi mutanti cisteinici ed è stato messo a punto un protocollo per la loro marcatura con sonde fluorescenti.

Interazioni tra le glicoproteine D, B, H ed L critiche per la fusione indotta dal virus Herpes simplex

Four glycoproteins (gD, gB, gH, and gL) are required for herpes simplex virus (HSV) entry into the cell and for cell-cell fusion in transfected cells. gD serves as the receptor-binding glycoprotein and as the trigger of fusion; the other three glycoproteins execute fusion between the viral envelope and the plasma or endocytic membranes. Little is known on the interaction of gD with gB, gH, and gL. Here, the interactions between herpes simplex virus gD and its nectin1 receptor or between gD, gB, and gH were analyzed by complementation of the N and C portions of split enhanced green fluorescent protein (EGFP) fused to the glycoproteins. Split EGFP complementation was detected between proteins designated gDN + gHC, gDN + gBC, and gHN + gBC + wtgD, both in cells transfected with two or tree glycoproteins and in cells transfected with the four glycoproteins, commited to form syncytia. The in situ assay provides evidence that gD interacts with gH and gB independently one of the other. We further document the interaction between gH and gB. To elucidate which portions of the glycoproteins interact with each other we generated mutants of gD and gB. gD triggers fusion through a specialised domain, named pro-fusion domain (PFD), located C-terminally in the ectodomain. Here, we show that PFD is made of subdomains 1 and 2 (amino acids 260–285 and 285–310) and that each one partially contributed to herpes simplex virus infectivity. Chimeric gB molecules composed of HSV and human herpesvirus 8 (HHV8) sequences failed to reach the cell surface and to complement a gB defective virus. By means of pull down experiments we analyzed the interactions of HSV-HHV8 gB chimeras with gH or gD fused to the strep-tag. The gB sequence between aa residues 219-360 was identified as putative region of interaction with gH or critical to the interaction.

The photosynthetic bacterial reaction center in native and artificial envirnoments: effects on light-induced electron transfer

In this thesis we focussed on the characterization of the reaction center (RC) protein purified from the photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides. In particular, we discussed the effects of native and artificial environment on the light-induced electron transfer processes. The native environment consist of the inner antenna LH1 complex that copurifies with the RC forming the so called core complex, and the lipid phase tightly associated with it. In parallel, we analyzed the role of saccharidic glassy matrices on the interplay between electron transfer processes and internal protein dynamics. As a different artificial matrix, we incorporated the RC protein in a layer-by-layer structure with a twofold aim: to check the behaviour of the protein in such an unusual environment and to test the response of the system to herbicides. By examining the RC in its native environment, we found that the light-induced charge separated state P+QB - is markedly stabilized (by about 40 meV) in the core complex as compared to the RC-only system over a physiological pH range. We also verified that, as compared to the average composition of the membrane, the core complex copurifies with a tightly bound lipid complement of about 90 phospholipid molecules per RC, which is strongly enriched in cardiolipin. In parallel, a large ubiquinone pool was found in association with the core complex, giving rise to a quinone concentration about ten times larger than the average one in the membrane. Moreover, this quinone pool is fully functional, i.e. it is promptly available at the QB site during multiple turnover excitation of the RC. The latter two observations suggest important heterogeneities and anisotropies in the native membranes which can in principle account for the stabilization of the charge separated state in the core complex. The thermodynamic and kinetic parameters obtained in the RC-LH1 complex are very close to those measured in intact membranes, indicating that the electron transfer properties of the RC in vivo are essentially determined by its local environment. The studies performed by incorporating the RC into saccharidic matrices evidenced the relevance of solvent-protein interactions and dynamical coupling in determining the kinetics of electron transfer processes. The usual approach when studying the interplay between internal motions and protein function consists in freezing the degrees of freedom of the protein at cryogenic temperature. We proved that the “trehalose approach” offers distinct advantages with respect to this traditional methodology. We showed, in fact, that the RC conformational dynamics, coupled to specific electron transfer processes, can be modulated by varying the hydration level of the trehalose matrix at room temperature, thus allowing to disentangle solvent from temperature effects. The comparison between different saccharidic matrices has revealed that the structural and dynamical protein-matrix coupling depends strongly upon the sugar. The analyses performed in RCs embedded in polyelectrolyte multilayers (PEM) structures have shown that the electron transfer from QA - to QB, a conformationally gated process extremely sensitive to the RC environment, can be strongly modulated by the hydration level of the matrix, confirming analogous results obtained for this electron transfer reaction in sugar matrices. We found that PEM-RCs are a very stable system, particularly suitable to study the thermodynamics and kinetics of herbicide binding to the QB site. These features make PEM-RC structures quite promising in the development of herbicide biosensors. The studies discussed in the present thesis have shown that, although the effects on electron transfer induced by the native and artificial environments tested are markedly different, they can be described on the basis of a common kinetic model which takes into account the static conformational heterogeneity of the RC and the interconversion between conformational substates. Interestingly, the same distribution of rate constants (i.e. a Gamma distribution function) can describe charge recombination processes in solutions of purified RC, in RC-LH1 complexes, in wet and dry RC-PEM structures and in glassy saccharidic matrices over a wide range of hydration levels. In conclusion, the results obtained for RCs in different physico-chemical environments emphasize the relevance of the structure/dynamics solvent/protein coupling in determining the energetics and the kinetics of electron transfer processes in a membrane protein complex.

Molecular basis oh herpes simplex virus entry into the cell and retargeting of the viral tropism for the design of oncolytic herpesviruses

Herpes simplex virus 1 (HSV-1) infects oral epitelial cells, then spreads to the nerve endings and estabilishes latency in sensory ganglia, from where it may, or may not reactivate. Diseases caused by virus reactivation include mild diseases such as muco-cutaneous lesions, and more severe, and even life-threatening encephalitis, or systemic infections affecting diverse organs. Herpes simplex virus represents the most comprehensive example of virus receptor interaction in Herpesviridae family, and the prototype virus encoding multipartite entry genes. In fact, it encodes 11-12 glycoproteins and a number of additional membrane proteins: five of these proteins play key roles in virus entry into subsceptible cells. Thus, glycoprotein B (gB) and glycoprotein C (gC) interact with heparan sulfate proteoglycan to enable initial attachment to cell surfaces. In the next step, in the entry cascade, gD binds a specific surface receptor such as nectin1 or HVEM. The interaction of glycoprotein D with the receptor alters the conformation of gD to enable the activation of gB, glycoprotein H, and glycoprotein L, a trio of glycoproteins that execute the fusion of the viral envelope with the plasma membrane. In this thesis, I described two distinct projects: I. The retargeting of viral tropism for the design of oncolytic Herpesviruses: • capable of infecting cells through the human epitelial growth factor receptor 2 (HER2), overexpressed in highly malignant mammary and ovarian tumors and correlates with a poor prognosis; • detargeted from its natural receptors, HVEM and nectin1. To this end, we inserted a ligand to HER2 in gD. Because HER2 has no natural ligand, the selected ligand was a single chain antibody (scFv) derived from MAb4D5 (monoclonal antibody to HER2), herein designated scHER2. All recombinant viruses were targeted to HER2 receptor, but only two viruses (R-LM113 and R-LM249) were completely detargeted from HVEM and nectin1. To engineer R-LM113, we removed a large portion at the N-terminus of gD (from aa 6 to aa 38) and inserted scHER2 sequence plus 9-aa serine-glycine flexible linker at position 39. On the other hand, to engineer R-LM249, we replaced the Ig-folded core of gD (from aa 61 to aa 218) with scHER2 flanked by Ser-Gly linkers. In summary, these results provide evidence that: i. gD can tolerate an insert almost as big as gD itself; ii. the Ig-like domain of gD can be removed; iii. the large portion at the N-terminus of gD (from aa 6 to aa 38) can be removed without loss of key function; iv. R-LM113 and R-LM249 recombinants are ready to be assayed in animal models of mammary and ovary tumour. This finding and the avaibility of a large number of scFv greatly increase the collection of potential receptors to which HSV can be redirected. II. The production and purification of recombinant truncated form of the heterodimer gHgL. We cloned a stable insect cell line expressing a soluble form of gH in complex with gL under the control of a metalloprotein inducible promoter and purified the heterodimer by means of ONE-STrEP-tag system by IBA. With respect to biological function, the purified heterodimer is capable: • of reacting to antibodies that recognize conformation dependent epitopes and neutralize virion infectivity; • of binding a variety cells at cell surface. No doubt, the availability of biological active purified gHgL heterodimer, in sufficient quantities, will speed up the efforts to solve its crystal structure and makes it feasible to identify more clearly whether gHgL has a cellular partner, and what is the role of this interaction on virus entry.

Each one teaches one: characterizing active forms of proteins by single molecule force spectroscopy

This Ph.D. candidate thesis collects the research work I conducted under the supervision of Prof.Bruno Samor´ı in 2005,2006 and 2007. Some parts of this work included in the Part III have been begun by myself during my undergraduate thesis in the same laboratory and then completed during the initial part of my Ph.D. thesis: the whole results have been included for the sake of understanding and completeness. During my graduate studies I worked on two very different protein systems. The theorical trait d’union between these studies, at the biological level, is the acknowledgement that protein biophysical and structural studies must, in many cases, take into account the dynamical states of protein conformational equilibria and of local physico-chemical conditions where the system studied actually performs its function. This is introducted in the introductory part in Chapter 2. Two different examples of this are presented: the structural significance deriving from the action of mechanical forces in vivo (Chapter 3) and the complexity of conformational equilibria in intrinsically unstructured proteins and amyloid formation (Chapter 4). My experimental work investigated both these examples by using in both cases the single molecule force spectroscopy technique (described in Chapter 5 and Chapter 6). The work conducted on angiostatin focused on the characterization of the relationships between the mechanochemical properties and the mechanism of action of the angiostatin protein, and most importantly their intertwining with the further layer of complexity due to disulfide redox equilibria (Part III). These studies were accompanied concurrently by the elaboration of a theorical model for a novel signalling pathway that may be relevant in the extracellular space, detailed in Chapter 7.2. The work conducted on -synuclein (Part IV) instead brought a whole new twist to the single molecule force spectroscopy methodology, applying it as a structural technique to elucidate the conformational equilibria present in intrinsically unstructured proteins. These equilibria are of utmost interest from a biophysical point of view, but most importantly because of their direct relationship with amyloid aggregation and, consequently, the aetiology of relevant pathologies like Parkinson’s disease. The work characterized, for the first time, conformational equilibria in an intrinsically unstructured protein at the single molecule level and, again for the first time, identified a monomeric folded conformation that is correlated with conditions leading to -synuclein and, ultimately, Parkinson’s disease. Also, during the research work, I found myself in the need of a generalpurpose data analysis application for single molecule force spectroscopy data analysis that could solve some common logistic and data analysis problems that are common in this technique. I developed an application that addresses some of these problems, herein presented (Part V), and that aims to be publicly released soon.