The vascular targeting agent combretastatin-A4 and a novel cis-Restricted {beta}-Lactam Analogue, CA-432, induce apoptosis in human chronic myeloid leukemia cells and ex vivo patient samples including those displaying multidrug resistance

Combretastatin-A4 (CA-4) is a natural derivative of the African willow tree Combretum caffrum. CA-4 is one of the most potent antimitotic components of natural origin, but it is, however, intrinsically unstable. A novel series of CA-4 analogs incorporating a 3,4-diaryl-2-azetidinone (β-lactam) ring were designed and synthesized with the objective to prevent cis -trans isomerization and improve the intrinsic stability without altering the biological activity of CA-4. Evaluation of selected β-lactam CA-4 analogs demonstrated potent antitubulin, antiproliferative, and antimitotic effects in human leukemia cells. A lead β-lactam analog, CA-432, displayed comparable antiproliferative activities with CA-4. CA-432 induced rapid apoptosis in HL-60 acute myeloid leukemia cells, which was accompanied by depolymerization of the microtubular network, poly(ADP-ribose) polymerase cleavage, caspase-3 activation, and Bcl-2 cleavage. A prolonged G(2)M cell cycle arrest accompanied by a sustained phosphorylation of mitotic spindle checkpoint protein, BubR1, and the antiapoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-x(L) preceded apoptotic events in K562 chronic myeloid leukemia (CML) cells. Molecular docking studies in conjunction with comprehensive cell line data rule out CA-4 and β-lactam derivatives as P-glycoprotein substrates. Furthermore, both CA-4 and CA-432 induced significantly more apoptosis compared with imatinib mesylate in ex vivo samples from patients with CML, including those positive for the T315I mutation displaying resistance to imatinib mesylate and dasatinib. In summary, synthetic intrinsically stable analogs of CA-4 that display significant clinical potential as antileukemic agents have been designed and synthesized.

c-Kit+ progenitors generate vascular cells for tissue-engineered grafts through modulation of the Wnt/Klf4 pathway

The development of decellularised scaffolds for small diameter vascular grafts is hampered by their limited patency, due to the lack of luminal cell coverage by endothelial cells (EC) and to the low tone of the vessel due to absence of a contractile smooth muscle cells (SMC). In this study, we identify a population of vascular progenitor c-Kit+/Sca-1- cells available in large numbers and derived from immuno-privileged embryonic stem cells (ESCs). We also define an efficient and controlled differentiation protocol yielding fully to differentiated ECs and SMCs in sufficient numbers to allow the repopulation of a tissue engineered vascular graft. When seeded ex vivo on a decellularised vessel, c-Kit+/Sca-1-derived cells recapitulated the native vessel structure and upon in vivo implantation in the mouse, markedly reduced neointima formation and mortality, restoring functional vascularisation. We showed that Krüppel-like transcription factor 4 (Klf4) regulates the choice of differentiation pathway of these cells through β-catenin activation and was itself regulated by the canonical Wnt pathway activator lithium chloride. Our data show that ESC-derived c-Kit+/Sca-1-cells can be differentiated through a Klf4/β-catenin dependent pathway and are a suitable source of vascular progenitors for the creation of superior tissue-engineered vessels from decellularised scaffolds.

Neuro-glia-vascular alterations by common neonatal clinical conditions

Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014

Adipose stromal vascular fraction cell sheets as vascular strategies for tissue engineering and regenerative medicine applications

Tese de mestrado em Engenharia Biomédica e Biofísica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015

Cadherin-5: a biomarker for metastatic breast cancer with optimum efficacy in oestrogen receptor-positive breast cancers with vascular invasion

Background: A glycoproteomic study has previously shown cadherin-5 (CDH5) to be a serological marker of metastatic breast cancer when both protein levels and glycosylation status were assessed. In this study we aimed to further validate the utility of CDH5 as a biomarker for breast cancer progression. Methods: A nested case–control study of serum samples from breast cancer patients, of which n=52 had developed a distant metastatic recurrence within 5 years post-diagnosis and n=60 had remained recurrence-free. ELISAs were used to quantify patient serum CDH5 levels and assess glycosylation by Helix pomatia agglutinin (HPA) binding. Clinicopathological, treatment and lifestyle factors associated with metastasis and elevated biomarker levels were identified. Results: Elevated CDH5 levels (P=0.028) and ratios of CDH5:HPA binding (P=0.007) distinguished patients with metastatic disease from those that remained metastasis-free. Multivariate analysis showed that the association between CDH5:HPA ratio and the formation of distant metastases was driven by patients with oestrogen receptor (ER+) positive cancer with vascular invasion (VI+). Conclusions: CDH5 levels and the CDH5 glycosylation represent biomarker tests that distinguish patients with metastatic breast cancer from those that remain metastasis-free. The test reached optimal sensitivity and specificity in ER-positive cancers with vascular invasion.

Variabilidade dos limites de estabilidade na posição ortostática em utentes com Acidente Vascular Encefálico

Introdução: O controlo postural (CP), intimamente ligado aos limites de estabilidade, é fundamental nas atividades da vida diária e encontra-se comprometido após Acidente Vascular Encefálico (AVE). Objectivo: Descrever as alterações nos limites de estabilidade, na posição ortostática, em utentes com AVE, face à aplicação de um programa de intervenção baseado num processo de raciocínio clínico. Métodos: Estudo de série de casos, de três indivíduos com alterações do CP do tronco e/ou das grandes articulações, decorrentes de AVE, mas capazes de assumir e manter a posição ortostática. Para avaliar os limites de estabilidade foram utilizados a plataforma de pressões Emed (coordenadas do centro de pressão, COPx e COPy) e o MultidirectionalReachTest (MDRT). Foram também aplicadas, a Fugl-Meyer Assessmentof Sensoriomotor Recovery After Stroke (FMA) e a Berg Balance Scale (BBS). Os instrumentos de avaliação foram aplicados antes e após a intervenção (M0 e M1), de 8 semanas, baseada nos princípios do conceito de Bobath. Resultados: Os valores dos testes de alcance no MDRT aumentaram em todos os utentes. Os limites e os deslocamentos médio-lateral (COPx) e, ântero-posterior (COPy) dos valores do CPr aumentaram, entre M0 e M1. No que se refere à FMA e a BBS, verificou-se que todos apresentaram um aumento dos scores. Conclusão: Os utentes modificaram os seus limites de estabilidade no sentido do aumento, assim como, da função motora e do equilíbrio. Deste modo, a intervenção de acordo com os princípios do conceito de Bobath aparenta introduzir os estímulos necessários à reorganização funcional do sistema nervoso central lesado.

Reorganização do controlo postural do tronco e a sua influência na distribuição de carga na posição ortostática em indivíduos com Acidente Vascular Encefálico

Introdução: O Acidente Vascular Encefálico (AVE) consiste numa das primeiras causas de mortalidade e morbilidade em Portugal. Esta lesão do Sistema Nervoso Central (SNC) desencadeia alterações ao nível do controlo postural (CP), que interferem com a recuperação funcional dos indivíduos. Objetivo: Deste modo, torna-se premente descrever as alterações do CP do tronco através da análise dos alinhamentos dos segmentos corporais do tronco no grupo de indivíduos selecionados, face à aplicação de um programa de intervenção baseado nos princípios do Conceito de Bobath. Metodologia: Estudo de série de casos, em seis indivíduos com alterações neuromotoras decorrentes de AVE, os quais foram avaliados antes e após o plano de intervenção segundo a abordagem baseada nos princípios do Conceito de Bobath, através do registo observacional, da Classificação Internacional de Funcionalidade Incapacidade e Saúde (CIF), da utilização do Software de Avaliação Postural (SAPO) e da Plataforma de Pressões da Emed (PPE), modelo AT. Os dados recolhidos foram trabalhados em função do valor médio através do software Excel. Resultados: A análise do SAPO, na posição ortostática observam-se mudanças quer na vista posterior quer nas laterais, indicando uma maior simetria entre hemitroncos, e mudanças nos alinhamentos verticais indicando uma maior aproximação dos 180º. Na PPE observam-se os valores da área plantar, da pressão plantar média e do centro de pressão, tendem globalmente a uma maior semelhança e simetria. Quanto à CIF também se verificou uma diminuição da restrição na participação e limitação na atividade. Conclusão: A intervenção baseada no processo de raciocínio clínico aparenta introduzir os estímulos necessários à reorganização funcional do SNC lesado, produzindo melhorias ao nível dos alinhamentos dos segmentos corporais e desta forma melhorar a atividade muscular.

Comportamento do tronco na fase inicial da sequência de movimento de sentado para de pé, em indivíduos com Acidente Vascular Encefálico, em fase aguda

As alterações do controlo postural do tronco observadas em indivíduos pós acidente vascular encefálico (AVE) podem traduzir-se em dificuldades na realização da sequência de movimento de sentado para de pé (STS). Desta forma, o presente estudo teve como objetivo descrever o comportamento do tronco, durante a primeira fase do STS, em cinco indivíduos pós-AVE, em fase aguda. Para tal, os indivíduos foram avaliados em dois momentos, antes (M0) e após (M1) um período de intervenção de 3 meses. Recorreu-se ao Software de Avaliação Postural (SAPo) para analisar o deslocamento do tronco no sentido anterior, bem como a simetria entre hemitronco contralesional vs. ipsilesional. Avaliou-se também o controlo postural e equilíbrio através das Escala de Avaliação Postural para Pacientes com Sequelas de AVE (PASS) e Escala de Equilíbrio de Berg (EEB), respetivamente. Para cada indivíduo foi desenvolvido um processo de raciocínio clínico tendo por base a avaliação observacional de componentes do movimento. Os resultados evidenciaram uma diminuição do deslocamento do tronco entre M0 e M1, em três dos cinco indivíduos, no que se refere ao ângulo do plano horizontal - EIPS - ângulo inferior da omoplata e do plano horizontal – EIPS – acrómio; outro dos indivíduos, no M0 não foi capaz de realizar o deslocamento do tronco, mas concluiu-o em M1; e outro indivíduo aumentou esse deslocamento nos dois ângulos. Em relação à diferença das distâncias entre o hemitronco contralesional vs ipsilesional, para o ângulo superior da omoplata e C7, estes resultados diminuíram de M0 para M1 em todos os indivíduos. Em quatro dos cinco indivíduos, as diferenças das distâncias para o ângulo inferior da omoplata e T7 e o ângulo inferior da omoplata e a EIPS, entre o hemitronco contralesional vs ipsilesional também diminuíram no M1 comparativamente ao M0. Foi ainda possível observar que todos os indivíduos apresentaram uma melhor extensão linear do tronco na posição inicial de sentado em M1 comparativamente a M0. Para as escalas aplicadas, PASS e EEB, a maioria dos indivíduos em estudo duplicou em M1 a pontuação obtida em M0. Concluindo, os participantes do estudo evidenciaram um menor deslocamento anterior do tronco durante o STS, assim como, uma maior simetria entre os dois hemitroncos, após uma intervenção de fisioterapia baseada nos princípios do conceito de Bobath.