Atomic force microscopy assisted with electron and ion beam microscopy for the direct measurement of biostructures and DNA samples

Dissertation to obtain a Master degree in Biotechnology

The role of electron transfer in DNA building blocks: evaluation of strand breaks and their implications

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Engenharia Física

Contribuição para o conhecimento da Leptospirose humana na região do Lobito (Angola): aplicação de métodos de diagnóstico serológico e molecular

A Leptospirose é um problema emergente na Saúde Pública, devido às suas proporções epidemiológicas e pelo aumento da incidência da doença em países industrializados e em desenvolvimento (Meites et al., 2004). A doença tem uma ampla distribuição geográfica e ocorre com maior frequência nas zonas tropicais, subtropicais e temperadas (Vijayachari et al., 2008). Contudo, em algumas regiões desconhece-se a verdadeira prevalência, sendo reportada através de surtos esporádicos (Pappas et al., 2007). As manifestações clínicas inespecíficas da infecção podem ser subdiagnosticadas nas regiões tropicais, onde as doenças febris são comuns e onde podem ser confundidas com doenças mais conhecidas como a Malária, Hepatite Viral, Dengue e outras. Em Angola, o diagnóstico é realizado apenas através da história do paciente e suspeita clínica, dando origem a diagnósticos pouco precisos. Deste modo, é importante o uso de métodos laboratoriais, especialmente testes serológicos específicos, para a confirmação do diagnóstico clínico (Levett, 2001). O objectivo principal deste estudo foi investigar a ocorrência de Leptospirose humana em Lobito (Província de Benguela) e identificar os serovares circulantes de Leptospira interrogans sensu lato (s.l.), utilizando técnicas serológicas e moleculares. Entre Abril e Junho de 2011, após o necessário consentimento informado, fez-se um inquérito clínico-epidemiológico a 141 pacientes (64 homens e 77 mulheres) assistidos no Hospital Geral do Lobito, por cefaleias e febre com diagnóstico desconhecido, dos quais se colheram 141 amostras séricas e 36 amostras de urina. A avaliação serológica foi inicialmente feita no laboratório local através da Técnica de Aglutinação Macroscópica sobre Lâmina (MACROLepto) – teste de rastreio - e, posteriormente confirmada pela Técnica de Aglutinação Microscópica (TAM) - teste de referência - realizado no Laboratório de Leptospirose (IHMT, em Lisboa). Para a detecção de DNA de Leptospira utilizou-se a Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR) com primers baseados no gene hap 1. Procedeu-se ainda à sequenciação dos produtos da PCR. As principais manifestações clínicas foram: cefaleias (73,8%), febre (65,2%), mialgias (41,1%) e náuseas (33,3%). Dos dados epidemiológicos observou-se que 131 dos pacientes tiveram contacto com os principais reservatórios de leptospiras, os roedores, e 76 ingeriram água não potável. Os resultados serológicos revelaram no teste MACROLepto: 14 (10%) amostras positivas e 18 (13%) não-conclusivas, sendo os serogrupos Icterohaemorrhagiae (Copenhageni), Australis (Bratislava) e Sejroe os mais comuns. Destas amostras, cinco, foram confirmadas pela TAM (presença de aglutininas anti – L. interrogans s.l.). Paralelamente, o DNA de Leptospira foi detectado em 13+/81 (16%) das amostras séricas e numa amostra de urina. A sequenciação identificou os serovares Copenhageni e Lai, ambos pertencentes ao serogrupo Icterohaemorrhagiae da espécie genómica L. interrogans. Os resultados obtidos mostraram que a maioria dos pacientes, mesmo aqueles que praticavam actividades de menor risco epidemiológico, tiveram contacto com roedores e com águas não potáveis. O estudo também provou que a Leptospirose afectou sobretudo as mulheres adultas, admitindo-se que este achado possa ser comum noutras regiões do País. Por último, ficou demonstrada a existência de Leptospirose na região, o que poderá contribuir para a inclusão da doença na lista de doenças febris em Angola e noutros países tropicais.

Contribuição para o conhecimento da Leptospirose Humana na Região do Lobito (Angola)

A Leptospirose é um problema emergente na Saúde Pública, devido às suas proporções epidemiológicas e pelo aumento da incidência da doença em países industrializados e em desenvolvimento (Meites et al., 2004). A doença tem uma ampla distribuição geográfica e ocorre com maior frequência nas zonas tropicais, subtropicais e temperadas (Vijayachari et al., 2008). Contudo, em algumas regiões desconhece-se a verdadeira prevalência, sendo reportada através de surtos esporádicos (Pappas et al., 2007). As manifestações clínicas inespecíficas da infecção podem ser subdiagnosticadas nas regiões tropicais, onde as doenças febris são comuns e onde podem ser confundidas com doenças mais conhecidas como a Malária, Hepatite Viral, Dengue e outras. Em Angola, o diagnóstico é realizado apenas através da história do paciente e suspeita clínica, dando origem a diagnósticos pouco precisos. Deste modo, é importante o uso de métodos laboratoriais, especialmente testes serológicos específicos, para a confirmação do diagnóstico clínico (Levett, 2001). O objectivo principal deste estudo foi investigar a ocorrência de Leptospirose humana em Lobito (Província de Benguela) e identificar os serovares circulantes de Leptospira interrogans sensu lato (s.l.), utilizando técnicas serológicas e moleculares. Entre Abril e Junho de 2011, após o necessário consentimento informado, fez-se um inquérito clínico-epidemiológico a 141 pacientes (64 homens e 77 mulheres) assistidos no Hospital Geral do Lobito, por cefaleias e febre com diagnóstico desconhecido, dos quais se colheram 141 amostras séricas e 36 amostras de urina. A avaliação serológica foi inicialmente feita no laboratório local através da Técnica de Aglutinação Macroscópica sobre Lâmina (MACROLepto) – teste de rastreio - e, posteriormente confirmada pela Técnica de Aglutinação Microscópica (TAM) - teste de referência - realizado no Laboratório de Leptospirose (IHMT, em Lisboa). Para a detecção de DNA de Leptospira utilizou-se a Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR) com primers baseados no gene hap 1. Procedeu-se ainda à sequenciação dos produtos da PCR. As principais manifestações clínicas foram: cefaleias (73,8%), febre (65,2%), mialgias (41,1%) e náuseas (33,3%). Dos dados epidemiológicos observou-se que 131 dos pacientes tiveram contacto com os principais reservatórios de leptospiras, os roedores, e 76 ingeriram água não potável. Os resultados serológicos revelaram no teste MACROLepto: 14 (10%) amostras positivas e 18 (13%) não-conclusivas, sendo os serogrupos Icterohaemorrhagiae (Copenhageni), Australis (Bratislava) e Sejroe os mais comuns. Destas amostras, cinco, foram confirmadas pela TAM (presença de aglutininas anti – L. interrogans s.l.). Paralelamente, o DNA de Leptospira foi detectado em 13+/81 (16%) das amostras séricas e numa amostra de urina. A sequenciação identificou os serovares Copenhageni e Lai, ambos pertencentes ao serogrupo Icterohaemorrhagiae da espécie genómica L. interrogans. Os resultados obtidos mostraram que a maioria dos pacientes, mesmo aqueles que praticavam actividades de menor risco epidemiológico, tiveram contacto com roedores e com águas não potáveis. O estudo também provou que a Leptospirose afectou sobretudo as mulheres adultas, admitindo-se que este achado possa ser comum noutras regiões do País. Por último, ficou demonstrada a existência de Leptospirose na região, o que poderá contribuir para a inclusão da doença na lista de doenças febris em Angola e noutros países tropicais.

Functional and structural studies of two enzymes: membrane bound kinase and Z-DNA/Z-RNA-binding protein

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Sistemas de Bioengenharia

Arte em Construção: Análise Documental Sobre o Projecto “DNA – District of New Art”, Lisboa

Trabalho de Projecto realizado para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Comunicação – Cinema e Televisão

Optimization of randomly amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction for molecular typing of Salmonella enterica serovar Typhi

Optimization of the RAPD reaction for characterizing Salmonella enterica serovar Typhi strains was studied in order to ensure the reproducibility and the discriminatory power of this technique. Eight Salmonella serovar Typhi strains isolated from various regions in Brazil were examined for the fragment patterns produced using different concentrations of DNA template, primer, MgCl2 and Taq DNA polymerase. Using two different low stringency thermal cycle profiles, the RAPD fingerprints obtained were compared. A set of sixteen primers was evaluated for their ability to produce a high number of distinct fragments. We found that variations associated to all of the tested parameters modified the fingerprinting patterns. For the strains of Salmonella enterica serovar Typhi used in this experiment, we have defined a set of conditions for RAPD-PCR reaction, which result in a simple, fast and reproducible typing method.

Phenetic studies on randomly amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction-variability of four geographical populations of Lutzomyia whitmani (Diptera: Psychodidae) in Brazil

Previous evaluation of the genetic variability of four biogeographical populations of Lutzomyia whitmani from known foci of cutaneous leishmaniasis in Brazil demonstrated two main spatial clusters: Corte de Pedra-BA, Ilhéus-BA and Serra de Baturité-CE in the first cluster, and Martinho Campos-MG in the second. Further analysis showed a high degree of homogeneity in Corte de Pedra population but not in the others, which presented a significant percentage of specimens displaced from their phenon of origin (discrepant individuals). In the present work we analyzed the frequencies of association coefficients in the matrixes of similarity per population of Lutzomyia whitmani from both sexes and the general phenograms obtained, in a more detailed study of those discrepant specimens. Populational stability was observed for Corte de Pedra population, whereas the three remaining populations showed varying degrees of heterogeneity and different displacements according to sex. Our results strongly suggested the existence of a genetic flow between the lineages North-South/North-East and Ilhéus/Serra do Baturité of Lutzomyia whitmani.

DNA-Protein interaction: a response regulatory protein associated with Mo homeostasis in Desulfovibrio alaskensis G20.

Dissertation for a degree in Doctor in Sustainable Chemistry

Efetividade das vacinas anti-VHB (DNA-recombinante) em doadores de sangue de uma região endêmica para hepatite B no sul do Brasil

O objetivo deste estudo foi de estimar a efetividade das vacinas anti-VHB em um estudo longitudinal, retrospectivo composto por 1.012 doadores de sangue que completaram o esquema padrão de vacinação (três doses, incluindo doses de reforço nos doadores com títulos de anti-HBs <10UI/L) durante o período entre 1998 e 2002. Os resultados mostram que a taxa de soroconversão foi significativamente menor nos doadores cujo título de anti-HBs foi mensurado após seis meses decorridos do término do esquema de vacinação e nos doadores com mais de 50 anos. A efetividade média correspondeu a 88,7%, variando de 80,6% nos com maior idade (50 anos ou mais) a 91,4% nos doadores mais jovens (18 a 30 anos). O regime de dose de reforço foi efetivo, principalmente por reduzir o percentual de não-respondedores. Conclui-se que a efetividade da vacina foi significativamente maior nos doadores mais jovens e que o tempo decorrido entre a vacinação e a testagem interferiu na taxa de soroconversão.

Estudo da ação danificadora do 2,2'-Bipyridyl no DNA na presença de radiação UV

Em 2008, foram estimados no mundo, cerca de 12.7 milhões de novos casos de cancro e 7,6 milhões de mortes por cancro, sendo que 56% dos casos e 64% das mortes ocorreram nos países em desenvolvimento. Estes números indicam que é necessário se encontrar novos meios de combater este flagelo. Uma das possibilidades é encontrar moléculas intercalantes do ácido desoxirribonucleico (DNA) que se degradem na presença de radiação ou partículas carregadas de baixa energia que criem condições de induzir lesões no DNA, inibidoras da replicação e que portanto contribuam para a não proliferação de células cancerígenas. Assim, nesta dissertação analisou-se a influência do agente intercalante 2,2'-Bipyridyl do DNA em presença de radiação UV, 254 nm, na degradação do DNA. Os danos criados no DNA foram analisados pelas técnicas de espectroscopia de ultravioleta-visível e de infravermelho. Os resultados obtidos permitiram inferir que a cinética de degradação do DNA é mais eficiente na presença do composto 2,2'-Bipyridyl e que o ataque pelos produtos da decomposição do 2,2'-Bipyridyl é feito a todas as bases, embora com constantes características diferentes, sendo a ataque à guanina com uma constante de tempo maior. Estes resultados permitem concluir que este composto pode ser um possível candidato a indutor de lesões no DNA.

Identification and differentiation of Candida species from pediatric patients by random amplified polymorphic DNA

Thirty-four Candida isolates were analyzed by random amplified polymorphic DNA using the primer OPG-10:24 Candida albicans; 4 Candida tropicalis; 2 Candida parapsilosis; 2 Candida dubliniensis; 1 Candida glabrata and 1 Candida krusei. The UPGMA-Pearson correlation coefficient was used to calculate the genetic distance between the different Candida groupings. Samples were classified as identical (correlation of 100%); highly related samples (90%); moderately related samples (80%) and unrelated samples (< 70%). The results showed that the RAPD proposed was capable of classifying the isolates coherently (such that same species were in the same dendrogram), except for two isolates of Candida parapsilosis and the positive control (Netherlands, 1973), probably because they are now recognized as three different species. Concerning the only fluconazole-resistant Candida tropicalis isolate with a genotype that was different to the others, the data were insufficient to affirm that the only difference was the sensitivity to fluconazole. We concluded that the Random Amplified Polymorphic DNA proposed might be used to confirm Candida species identified by microbiological methods.

Alteração da metilação do DNA após exposição prolongada a fitoquímicos

Parte do trabalho efetuado durante este projeto de dissertação foi publicado na revista Chemico-Biological Interactions. E apresentado no “50th Congress of the European Societies of Toxicology 7th - 10th September 2014 Edinburgh International Conference Centre, Edinburgh, Scotland” em forma de poster.