Evidence for the evolution of multiple genomes in arbuscular mycorrhizal fungi.

Ancient asexuals directly contradict the evolutionary theories that explain why organisms should evolve a sexual life history. The mutualistic, arbuscular mycorrhizal fungi are thought to have been asexual for approximately 400 million years. In the absence of sex, highly divergent descendants of formerly allelic nucleotide sequences are thought to evolve in a genome. In mycorrhizal fungi, where individual offspring receive hundreds of nuclei from the parent, it has been hypothesized that a population of genetically different nuclei should evolve within one individual. Here we use DNA-DNA fluorescent in situ hybridization to show that genetically different nuclei co-exist in individual arbuscular mycorrhizal fungi. We also show that the population genetics techniques used in other organisms are unsuitable for detecting recombination because the assumptions and underlying processes do not fit the fungal genomic structure shown here. Instead we used a phylogenetic approach to show that the within-individual genetic variation that occurs in arbuscular mycorrhizal fungi probably evolved through accumulation of mutations in an essentially clonal genome, with some infrequent recombination events. We conclude that mycorrhizal fungi have evolved to be multi-genomic.

Incidence et traitement des lymphocèles après greffe rénale

1.1. La greffe de rein La greffe d'organes a révolutionné la médecine. De tout le temps elle a suscité les fantasmes et les rêves : la pratique est ancestrale ; elle remonte au 3ème siècle lorsque Saint Côme et Saint Damien réalisent pour la première fois une greffe de jambe de Maure sur un patient. Il faudra néanmoins attendre le 20ème siècle pour voir la transplantation se réaliser plus concrètement avec succès et se généraliser. A Vienne, en 1902, le Dr. Ulmann (1861-1937) pratique la toute première autogreffe de rein sur un chien. Il replace le rein de l'animal au niveau du cou, pratiquant une anastomose vasculaire. Depuis, les tentatives se multiplient et peu après le Dr. Von Decastello, pratique la première transplantation chien-chien. Par la suite, en associa- tion avec le Dr. Ulmann la première greffe entre un chien et une chèvre aura lieu, avec un certain succès. En effet, elle a permis à l'animal receveur de produire de l'urine. L'avancée majeure durant ce début de siècle fut le développement d'une nouvelle technique de suture vasculaire par le Dr. Carrel, qui obtiendra le prix Nobel en 1912. Son élève, le Dr. Jaboulay (1860-1913) a réalisé plusieurs tentatives de xénogreffes rénales. Il pratiquera en 1906 les deux premières xénogreffes en utilisant un cochon et une chèvre comme donneurs. Le greffon fut respectivement placé au niveau de la cuisse et du bras des patients. La fonction rénale durera une heure. En 1909 Ernest Unger (1875-1938) transplanta un rein de fox-terrier sur un boxer, avec une production d'urine pendant 14 jours. Durant la même année le Dr. Unger a pratiqué une xénogreffe en transplantant un rein de nouveau né sur un babouin, cette intervention se terminant par la mort de l'animal. Un autre essai de greffe singe à humain, pratiqué sur une femme mourant de défaillance rénale, a fait comprendre à Unger qu'il y a des barrières biologiques dans la transplantation, mais que la greffe rénale est techniquement faisable. En 1914, J.B. Murphy découvre l'importance de la rate et de la moelle osseuse dans la réponse immune. En 1933 et 1949 en Ukraine, les premières allogreffes humaines de reins sont pratiquées par le chirurgien soviétique Yu Yu Voronoy. Malheureuse- ment aucune fonction rénale des greffons n'a été observée. Après une période de « stagnation scientifique » générale qui durera à peu près 10 ans, l'intérêt pour la transplantation refait surface dans les années 1950. Deux équipes de chirurgien se forment : une à Boston et l'autre à Paris. De nombreux cas d'allogreffes humaines sans immunosuppression sont documentés de 1950 à 1953. Malheureusement chaque opération aboutit à un échec, ceci dû aux phénomènes du rejet. M. Simonsen et WJ. Dempster découvrent qu'un mécanisme immun est à la base du rejet. Ils établissent aussi que la position pelvienne était meilleure que la position plus superficielle. Grâce aux découvertes dans le domaine du rejet et les nombreux progrès techniques, une allogreffe entre vrais jumeaux est pratiquée à Boston en 1954. L'opération est un succès total et permet de contrer toutes les hypothèses négatives avancées par certains groupes de travail. Depuis 1948, de nombreux travaux dans le domaine de l'immunosuppression ont été entrepris. La découverte de l'action immunosuppressive de la cortisone permet son instauration dans le traitement anti-rejet, malheureusement avec peu de succès. En effet, l'irradiation totale reste la méthode de choix jusqu'en 1962, date de l'apparition de l'Azaothioprine (Imuran®). La découverte de l'Azaothioprine, permet d'avancer de nouvelles hypothèses concernant le rejet : en évitant le rejet post-opératoire aigu, une protection et une adaptation au receveur pourraient être modulées par l'immunosuppression. Dans les années 1960, l'apparition des immunosuppresseurs de synthèse permet de développer de nouvelles lignes de traitement. Le Dr.Starzl et ses collègues, découvrent l'efficacité d'un traitement combiné de Prednisone et d'Azathioprine qui devient alors le standard d'immunosuppression post greffe durant cette période. Les années 60 et 70 sont des années d'optimisme. La prise en charge des patients s'améliore, le développement de la dialyse permet de maintenir en vie les patients avant la greffe, les techniques de conservation des organes s'améliorent, la transplantation élargit son domaine d'action avec la première greffe de coeur en 1968. Le typage tissulaire permet de déterminer le type d'HLA et la compatibilité entre le re- ceveur et le donneur afin de minimiser les risques de rejet aigu. Les années 1970 se caractérisent par deux amélioration majeures : celle du typage HLA-DR et l'apparition des inhibiteurs de la calcineurine (Cyclosporine A). Ce dernier restera l'agent de premier choix jusqu'aux alentours des années 1990 où apparaissaient de nouveaux immunosuppresseurs, tels que les inhibiteurs mTOR (siroli- mus) et les inhibiteurs de l'inosine monophosphate déshydrogénase (mycophénolate mofétil), par exemple. En conclusion, la transplantation rénale a été une des premières transplantations d'organes solides pratiquées sur l'homme avec de nombreux essais cliniques impliquant une multitude d'acteurs. Malgré des périodes de hauts et de bas, les avancements techniques ont été notables, ce qui a été très favorable en terme de survie pour les patients nécessitant une greffe. 1.2. Le lymphocèle La greffe rénale, comme toute autre acte chirurgical, comporte des risques et une morbidité spécifique. Le lymphocèle a la prévalence la plus élevée, qui peut aller de 0.6 à 51% 1-3 avec des variations entre les études. Le lymphocèle est défini comme une collection post opératoire de liquide lymphatique dans une cavité non épithélialisée et n'est pas causée par une fuite urinaire ou une hémorragie1, 4. Historiquement, le lymphocèle a été décrit pour la première fois dans la littérature médicale dans les années 1950, par Kobayashi et Inoue5 en chirurgie gynécologique. Par la suite Mori et al.6 en 1960 documentent la première série d'analyse de lymphocèles. En 1969 le lymphocèle est décrit pour la première fois par Inociencio et al.7 en tant que complication de greffe rénale. Sa pathogénèse n'est pas complètement élucidée, cependant plusieurs facteurs de risque ont été identifiés tels que : la ligature inadéquate des vaisseaux lymphatiques lors de la dissection des vaisseaux iliaques du donneur et de la préparation du greffon, le BMI, les diurétiques, l'anticoagulation (héparine), les hautes doses de stéoïdes, certains agents immunosuppresseurs (sirolimus), le diabète, les problèmes de cicatrisation, une hypoalbuminémie, une chirurgie rétropéritonéale préalable et le rejet aigu de greffe. (Tableau 1) Une symptomatologie peut être présente ou absente : elle découle directement de la localisation et de la taille de la collection8, 9, 10. Lorsqu'on se trouve devant un tableau de lymphocèle asymptomatique, la découverte se fait de manière fortuite lors d'un contrôle de suivi de greffe11, 12 cliniquement ou par échographie. En cas de lymphocèle non significatif cela ne requiert aucun traitement. Au contraire, lorsqu'il atteint une certaines taille il provoque un effet de masse et de compression qui provoque la symptomatologie. Cette dernière est peu spécifique et apparait en moyenne entre 2 semaines et 6 mois 13 après la greffe. Le patient va se présenter avec un tableau pouvant aller de la simple douleur abdominale en passant par un oedème du membre inférieur ou, dans de plus rares cas, une thrombose veineuse profonde sera le seul signe consécutif au lymphocèle14, 15. La plupart du temps on observera des valeurs de créatinine élevées, signant une souffrance rénale. Le diagnostic du lymphocèle peut se faire selon plusieurs techniques. La plus utilisée est la ponction à l'aiguille fine sous guidage ultrasonographique4. L'analyse du liquide ponctionné permet de différencier un lymphocèle d'un urinome. Les autres techniques existantes sont : la ponction après injection de carmin d'indigo15, un pyelogramme intraveineux et un lymphangiogramme16, le CT-Scan ou l'IRM15. Le dosage sanguin d'IL6 et IL8 est parfois utilisé pour déterminer si le lymphocèle est infecté.15 Suite à l'apparition d'une collection symptomatique; le rein transplanté peut être dans une situation à risque pour laquelle un traitement doit être entrepris. A l'heure actuelle, il n'existe pas de solution universelle dans la prévention et le traitement de ce type de complication. Les solutions sont multiples et dépendent principalement de la localisation et de la taille de la collection. Pendant de nombreuses années, le seul traitement du lymphocèle a été celui de l'aspiration percutanée simple. Cette dernière conduit cependant à un taux de récidive de presque 100%.17 Cette technique reste une solution utilisée principalement à visée diagnostique18, 19, 20, 21 ou pour soulager les patients à court terme15. Pour améliorer l'efficacité de cette technique on a fait appel à des agents sclérosants comme l'éthanol, la povidone-iodine, la tétracycline, la doxycycline ou de la colle de fibrine. Des complications chirurgicales ont cependant été rapportées, pouvant aller jusqu'au rejet de greffe22. La fenestration par laparoscopie a été décrite pour la première fois en 1991 par McCullough et al.23 Cette technique reste, de nos jours, la technique la plus utilisée pour le traitement du lymphocèle. Elle a de nombreux avantages : un temps de convalescence court, des pertes de sang minimes et une réalimentation rapide24, 25. On constate en outre la quasi absence de récidives après traitement11, 26. L'évaluation radiologique est très importante, car la marsupialisation par laparoscopie est limitée par l'emplacement et le volume de la collection. Ainsi, on évitera ce type de traite- ment lorsque la collection se situera postérieurement, à proximité de la vessie, de l'uretère ou du hile rénal. Dans ces situations, la laparotomie s'impose malgré l'augmentation de la morbidité liée à cette technique24. Actuellement on cherche à trouver une technique universelle du traitement des lymphocèles avec la chirurgie la moins invasive possible et le taux de récidive le plus faible possible. Malgré ses li- mites, la fenestration par laparoscopie apparaît comme une très bonne solution. Cette étude consiste en une évaluation rétrospective des traitements chirurgicaux de cette complication post-opératoire de la greffe rénale au CHUV (Centre Hospitalier Universitaire Vaudois) de 2003 à 2011. Le but est de recenser et analyser les différentes techniques que l'on observe actuellement dans la littérature et pouvoir ainsi proposer une technique idéale pour le CHUV.

Etude rétrospective de la prévalence des comorbidités associées aux patients hospitalisés au CHUV entre 2008 et 2010 et atteints de goutte

Objectifs : Il s'agit d'une étude descriptive, rétrospective, de la prévalence des comorbidités dans une population de patients atteints de la maladie de la goutte et hospitalisés dans le Centre Hospitalier Universitaire de Lausanne (CHUV) entre le 1er janvier 2008 et le 31 décembre 2010, ainsi qu'une analyse descriptive des différents traitements employés. Méthode : Les codes diagnostiques AP-DRG des archives électroniques du CHUV ont été utilisés dans le but de faire une analyse manuelle des dossiers. 259 dossiers de patients ont étés analysés et ont permis une description démographique, une analyse de la prévalence des comorbidités, ainsi qu'une description des différents traitements et complications. Résultats : La goutte à Lausanne touche principalement les hommes (78% des patients), l'âge moyen est de 76 ans et 7 mois chez les hommes contre 80 ans et 7 mois chez les femmes. Les tranches d'âge les plus concernées, avec 34.2% des hommes et 42.11% des femmes sont les 75-85 ans. L'espérance de vie est supérieure de 6 ans et demie chez les femmes. 75% des patients ont un excès de poids, 26 % sont obèses. Les comorbidités principales sont l'hypertension artérielle (85% des patients), L'insuffisance rénale chronique (50.2%), les cardiopathies ischémiques (35.7%), le diabète de type II (34.4%), l'alcoolisme chronique (22.5%), les néoplasies (16.7%) et les lithiases rénales (5.4%). La goutte se présente principalement (92.8%) sous forme de crise. La prise en charge par le service de rhumatologie concerne seulement 21.4% des patients. 82.5% des patients suivent un traitement médicamenteux, qui comprend principalementdes AINS (79% des patients), de l'allopurinol (53%, dont 3.6% d'intolérance), de la colchicine (34.6%) et des corticoïdes (27%). Les traitements des comorbidités sont les traitements antihypertenseurs (56.7% d'inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine et 56.6% des diurétiques de l'anse). Parmi les patients traités avec un AINS, 54.4% sont en insuffisance rénale chronique, 62% en insuffisance cardiaque et 41% ont un épisode de cardiopathie ischémique. 50% des patients traités avec de la colchicine ont une insuffisance cardiaque et 30% ont eu une cardiopathie ischémique. Parmi les patients qui ont eu un épisode infectieux, la crise de goutte est apparue chez 80% d'entre eux avant l'infection. Conclusion : La goutte est une maladie concernant une tranche de la population qui présente des comorbidités importantes sur le plan cardiovasculaire et métabolique, dont il faut tenir compte lors de l'élaboration d'un traitement de la crise ou d'un plan de traitement préventif de l'hyperuricémie.

Racial Stereotypes in Fictions of Slavery: Uncle Tom´s Cabin by Harriet Beecher Stowe and O Escravo by José Evaristo D’ Almeida

Most stereotypes about Africans and their descendants started with colonialism in the fifteenth century. The encounter between Africans and Europeans facilitated the creation of myths and stereotypes about the colonized peoples, which were made effective through the naturalization of differences. The relationship between skin color and slavery developed to produce a racialized system of forced labor on which colonialism depended for its survival. Stereotypes functioned to legitimize colonial authority by building the notion that the colonizer ruled over the colonized because of an innate superiority. Therefore, stereotyping is an effective "discursive strategy" (Bhabha) based on fixity and repetition with the aim of controlling the other. Harriet Beecher Stowe’s Uncle Tom’s Cabin and José Evaristo D’Almeida O Escravo both denounced the evils of slavery in the United States of America and Cape Verde respectively, claiming for the end of the institution. However, they are both ambivalent towards slaves and blacks, being unable to envisage social equality for the two races. Both authors construct their black characters as stereotypical others, but they depict the light-skin characters as superior both culturally and physically. The bi-racial characters are portrayed as the ones who possess beauty and intelligence as an inheritance from their European ancestry, while blacks are relegated to the margins. We need to consider, however, that slavery in Cape Verde had different characteristics from its counterpart in the United States of America. In Cape Verde the Africans outnumbered the Europeans and that circumstance favored miscegenation and the emergence of forms of mixed culture, which came to be seen as positive and natural. In the United States of America miscegenation was regarded as a taboo since early. And even after Emancipation, “the one-drop rule” made the offspring of an African descendant black, however 'white' he or she might be.

Vários percursos diversas identificações : descendentes de migrantes cabo-verdianos no Bairro do Talude - Unhos

The research presented here aimed to analyze the processes of integration of Cape Verdeans immigrants descendants of living in the neighborhood of Talude, Town of Unhos, Municipality of Loures. To analyze the central object of research - the process of integration of descendants of migrants in the neighborhood of Talude we tried to answer the following questions, which reflect the objectives of the research:  What are the paths of socialization the descendants of immigrants: at the family, at school, in employment, in the neighborhood and in other activities?  What is the influence of gender relations in the processes of integration of descendants?  What are the perception the of immigrants descendants living in the neighborhood of Talude in relation to how they are viewed by residents of the Town residents in the neighborhood? And the people or society in general? And what influence these perceptions have in their process of integration? This study consists in two parts: the design of the survey, which is depicted on the reason for the choice of topic, the definition of the topic, research objectives, the method that was used in the course of investigation and the framing of the issue. In the second part, the analysis of data in different pathways: family, neighborhood, school, labor market, in other activities, the influence of gender and image(s). As a general conclusion we can say that there are several factors that contribute to the identification of immigrant descendants (there are no apparent factors that predominate) and the images they have of themselves and the Portuguese society in general are diverse.

Protection of pancreatic beta-cells by high density lipoproteins

SUMMARYThe incidence of type 2 diabetes (T2D) is increasing worldwide and is linked to the enhancement of obesity. The principal cause of T2D development is insulin resistance, which lead to the increase of insulin production by the pancreatic beta-cells. In a pathological environment, namely dyslipidaemia, hyperglycaemia and inflammation, beta-cell compensation will fail in more vulnerable cells and diabetes will occur. High Density Lipoproteins (HDLs), commonly named "good cholesterol" are known to be atheroprotective. Low levels of HDLs are associated with increased prevalence of cardiovascular disease but are also an independent risk factor for the development of T2D. HDLs were demonstrated to protect pancreatic beta-cells against several stresses. However the molecular mechanisms of the protection are unknown and the objectives of this work were to try to elucidate the way how HDLs protect. The first approach was a broad screening of genes regulated by the stress and HDLs. A microarray analysis was performed on beta-cells stressed by serum deprivation and rescued by HDLs. Among the genes regulated, we focused on 4E-BP1, a cap-dependent translational inhibitor. In addition, HDLs were also found to protect against several other stresses.Endoplasmic reticulum (ER) stress is a mechanism that may play a role in the onset of T2D. The unfolded protein response (UPR) is a physiological process that aims at maintaining ER homeostasis in conditions where the protein folding and secretion is perturbed. Specific signalling pathways are involved in the increase of folding, export and degradation capacity of the ER. However, in case where the stress is prolonged, this mechanism turns to be pathological, by inducing cell death effector pathways, leading to beta-cell apoptosis. In our study, we discovered that HDLs were protective against ER stress induced by drugs and physiological stresses such as saturated free fatty acids. HDLs protected beta-cells by promoting ER homeostasis via the improvement of the folding and trafficking od proteins from the ER to the Golgi apparatus.Altogether our results suggest that HDLs are important for beta-cell function and survival, by protecting them from several stresses and acting on ER homeostasis. This suggests that attempt in keeping normal HDLs levels or function in patients is crucial to lessen the development of T2D.RÉSUMÉL'incidence du diabète de type 2 est en constante augmentation et est fortement liée à l'accroissement du taux d'obésité. La cause principale du diabète de type 2 est la résistance à l'insuline, qui entraîne une surproduction d'insuline par les cellules bêta pancréatiques. Dans un environnement pathologique associé à l'obésité (dyslipidémie, hyperglycémie et inflammation), les cellules bêta les plus vulnérables ne sont plus capables de compenser en augmentant leur production d'insuline, dysfonctionnent, ce qui conduit à leur mort par apoptose. Les lipoprotéines de hautes densités (HDLs), communément appelées (( bon cholestérol », sont connues pour leurs propriétés protectrices contre l'athérosclérose. Des niveaux bas de HDLs sanguins sont associés au risque de développer un diabète de type 2. Les HDLs ont également montré des propriétés protectrices contre divers stresses dans la cellule bêta. Cependant, les mécanismes de protection restent encore inconnus et l'objectif de ce travail a été d'investiguer les mécanismes moléculaires de protection des HDLs. La première approche choisie a été une étude du profil d'expression génique par puce à ADN afin d'identifier les gènes régulés par le stress et les HDLs. Parmi les gènes régulés, notre intérêt s'est porté sur 4E-BP1, un inhibiteur de la traduction coiffe- dépendante, dont l'induction par le stress était corrélée avec une augmentation de l'apoptose. Suite à cette étude, les HDLs ont également montrés un rôle protecteur contre d'autres stresses. Il s'agit particulièrement du stress du réticulum endoplasmique (RE), qui est un mécanisme qui semble jouer un rôle clé dans le développement du diabète. L'UPR (« Unfolded Protein Response ») est un processus physiologique tendant à maintenir l'homéostasie du réticulum endoplasmique, organelle prépondérante pour la fonction des cellules sécrétrices, notamment lorsqu'elle est soumise à des conditions extrêmes telles que des perturbations de la conformation tertiaire des protéines ou de la sécrétion. Dans ces cas, des voies de signalisation moléculaires sont activées, ce qui mène à l'exportation des protéines mal repliées, à leur dégradation et à l'augmentation de l'expression de chaperonnes capables d'améliorer le repliement des protéines mal formées. Toutefois, en cas de stress persistant, ce mécanisme de protection s'avère être pathologique. En induisant des voies de signalisation effectrices de l'apoptose, il conduit finalement au développement du diabète. Dans cette étude, nous avons démontré que les HDLs étaient capables de protéger la cellule bêta contre le stress du RE induits par des inhibiteurs (thapsigargine, tunicamycine) ou des stresses physiologiques tels que les acides gras libres. Les HDLs ont la capacité d'améliorer l'homéostasie du RE, notamment en favorisant le repliement et le transfert des protéines du RE à l'appareil de Golgi.En résumé, ces données suggèrent que les HDLs sont bénéfiques pour la survie des cellules bêta soumises à des stresses impliqués dans le développement du diabète, notamment en restaurant l'homéostasie du RE. Ces résultats conduisent à soutenir que le maintien des taux de cholestérol joue un rôle important dans la limitation de l'incidence du diabète.

Study of the mechanisms regulating the proliferative potential of human CD8+T lymphocytes over-expressing telomerase reverse transcriptase (hTERT)

Résumé La plupart des cellules issues du sang ont une durée de vie limitée. Dans les cellules somatiques humaines, y incluant les lymphocytes T, la taille des télomères diminue progressivement à chaque division cellulaire, pouvant aboutir à des instabilités chromosomiques. L'expression ectopique du gène de la transcriptase réverse de la télomérase (hTERT) dans les cellules restaure l'activité de la télomérase, et permet un rallongement de leur vie réplicative. Malgré l'absence de signes caractéristiques de transformation, nous ne savons pas encore si les cellules somatiques qui surexpriment hTERT sont physiologiquement indiscernables des cellules normales. Certaines études récentes proposent que la télomérase joue plusieurs rôles additionnels dans d'autres phénomènes biologiques tels que la réparation de l'ADN, la survie et la croissance des cellules. Dans notre étude, nous avons utilisé des clones issus de lymphocytes T cytotoxiques surexprimant la télomérase afin d'étudier les mécanismes moléculaires qui règlent leur prolifération et leur sénescence. Nous avons montré que les «jeunes » cellules T exprimant ou non hTERT révèlent des taux de croissance identiques suite à des réponses de stimulation induites par des mitogènes. De plus, aucun changement global dans leur expression des gènes n'a pu être mis en évidence. Curieusement, nous avons observé des réponses réduites dans la prolifération des cellules transduites avec la télomérase qui présentaient une élongation des télomères et une durée de vie prolongée. Ces cellules, malgré le maintien d'un niveau élevé de l'expression de gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire, ont également montré une expression accrue de plusieurs gènes trouvés en commun avec nos lymphocytes T vieillissants n'exprimant pas de télomérase. En particulier, les cellules ayant une durée de vie prolongée grâce à l'expression de la télomérase accumulaient également certains inhibiteurs du cycle cellulaire tels que p16Ink4a et p21Cip1, associés à l'arrêt de la croissance cellulaire. En résumé, nos résultats indiquent la présence fonctionnelle de mécanismes alternatifs pouvant contrôler la croissance réplicative de ces cellules; ils sont donc encourageants dans l'optique d'une utilisation à moindre risque de lymphocytes T «immortalisés » à des fins thérapeutiques pour traiter les tumeurs malignes ou les infections. Summary Most mature blood cells have a finite life span. In human somatic cells, including T lymphocytes, telomeres progressively shorten with each cell division eventually leading to chromosomal instability. Ectopic expression of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene in cells restores telomerase activity and results in the extension of their replicative life span. Despite lack of transformation characteristics, it is yet unknown whether somatic cells that over-express telomerase are biologically and physiologically indistinguishable from normal cells. Recent data suggest that telomerase might mediate additional functions in DNA repair, cell survival and cell growth. Using CD8+ T lymphocyte clones over-expressing telomerase we investigated the molecular mechanisms that regulate T cell proliferation and senescence. Here we show that early-passage T cell clones transduced or not with hTERT displayed identical growth rates upon mitogenic stimulation and no marked global changes in gene expression. Surprisingly, reduced proliferative responses were observed in hTERT-transduced cells with elongated telomeres and extended life span. These cells, despite maintaining high expression level of genes involved in cell cycle division and progression, also showed increased expression of several genes associated with normal aging T lymphocytes. In particular, late passage T cells over-expressing telomerase accumulated the cyclin-dependent inhibitors p16INK4a and p21CIP1 that have largely been associated with in vitro growth arrest. Whether tumor-reactive CD8+ T cells that ectopically express telomerase could now be used for adoptive transfer therapy in cancer patients remains unclear at this point. Nevertheless, our results regarding the safe and effective use of hTERT-transduced lymphocytes are encouraging, since they indicate that alternative growth arrest mechanisms such as p 16 and p21 are still functional in these cells and regulate to some extend their growth potential.

Biological aspects of immature stage of Nyssomyia whitmani (Antunes and Coutinho) (Diptera, Psychodidae, Phlebotominae) in laboratory conditions

Nyssomyia whitmani (Antunes and Coutinho, 1939) has been considered as a complex of cryptic species, and some of the populations of this complex plays an important role in the transmission of Leishmania spp. in Brazil. The present study reports the biological aspects concerning the productivity out of eggs and the development time of the descendants of females obtained in Dourados municipality, Mato Grosso do Sul state. The females were captured with modified electric aspirators, fed in hamsters and further individualized in containers for breeding. At the insectary, temperature and relative humidity were maintained on average of 24.5 °C and 67.3%, respectively. From 944 females 3737 eggs were obtained, 748 (20.0%) evolved to the stage of larvae, and 93 (12.4%) of these reached adult stage. The life cycle lasted 80.6 days and the last larval instar was the longest. The use of a higher protein diet revealed a significant improvement in larval development.

Biology and pathogenicity of "Waddlia chondrophila"

Abstract This thesis investigates the pathogenicity of a Chlamydia-related bacterium: Waddlia chondrophila, which is suspected to cause abortion in bovines as well as miscarriages in humans. Macrophages represent the first line of defense of the innate immunity against invading pathogens, we thus studied the interaction between W. chondrophila and human macrophages. We observed that W. chondrophila multiplied very efficiently inside monocyte-derived macrophages. Diagnostic tools to detect obligate intracellular bacteria are lacking so we developed a Waddlia specific real-time PCR based on the 16S rRNA encoding gene. Since W. chondrophila could be involved in human miscarriage, we analyzed samples from women having miscarriage or uneventful pregnancy. Waddlia serologies results confirmed an association between the presence of W. chondrophila antibodies and miscarriage (23.2% versus 14.6% in the control group, p-value 0.044). As W. chondrophila's pathogenicity was suggested, we studied its antibiotic susceptibility. W. chondrophila revealed to be susceptible to macrolides and tetracylines but resistant to beta-lactams and fluoroquinolones. This resistance to fluoroquinolones could be explained by mutations in the quinolone resistance determining region of the gyrase (GyrA) and topoisomerase IV (ParC) encoding genes. In conclusion, this thesis allowed to precise the role of W. chondrophila in human miscarriage. However, more studies will be necessary to fully understand the pathogenesis of W. chondrophila in adverse pregnancy outcomes. Résumé Le but de cette thèse a été d'étudier la pathogénicité d'une bactérie apparentée aux Chlamydia: Waddlia chondrophila. Les macrophages représentant la première ligne de défense du système immunitaire inné contre les pathogènes, nous avons d'abord étudié l'interaction entre W. chondrophila and les macrophages humains. Nous avons pu observer que W. chondrophila résistait aux effecteurs microbicides des macrophages et se multipliait efficacement au sein de ces cellules. Au vu du manque d'outils diagnostiques pour détecter cette bactérie intracellulaire obligatoire, nous avons également développé une PCR en temps réel, spécifique pour Waddlia, basée sur le gène de l'ARN ribosomal 16S. Cette PCR a été utilisée dans les différents projets afin de détecter la présence de W. chondrophila. W. chondrophila étant suspectée de pouvoir causer des fausses couches chez la femme, nous avons analysé des échantillons provenant de femmes ayant souffert de fausse couche, ainsi que, comme contrôles, des femmes ayant eu une grossesse normale. Les sérologies ont révélé une association entre la présence d'anticorps dirigés contre Waddlia et la fausse couche (23.2% versus 14.6% chez les contrôles, p-value=0.044). La présence de la bactérie a aussi été détectée par PCR et immunohistochimie dans plusieurs échantillons. L'implication de W. chondrophila dans la fausse couche se précisant, nous avons étudié sa susceptibilité aux antibiotiques. W. chondrophila s'est révélée sensible aux macrolides et aux tetracyclines mais résistante aux beta-lactames et aux quinolones. Cette résistance aux quinolones peut être expliquée par la présence de mutations dans le QRDR (région déterminant la résistance aux quinolones) des gènes gyrA et parC. En conclusion, cette thèse a permis de préciser l'implication de W. chondrophila dans la fausse couche. Des études complémentaires seront cependant nécessaires pour confirmer et préciser le rôle exact de W. chondrophila dans les problèmes obstétricaux.

Social and medical vulnerability factors of emergency department frequent users in a universal health insurance system

Objectifs - Identifier les facteurs de vulnérabilité sociaux et médicaux associés au recours multiple aux consultations des urgences. - Déterminer si les patients à recours multiple sont plus à même de combiner ces facteurs dans un système d'assurance universelle. Méthode Il s'agit d'une étude cas-contrôle rétrospective basée sur l'étude de dossiers médico-administratifs comparant des échantillons randomisés de patients à recours multiple à des patients n'appartenant pas à cette catégorie, au sein des urgences du Centre Hospitalier Universitaire Vaudois et de la Policlinique Médicale Universitaire de Lausanne. Les auteurs ont défini les patients à recours multiple comme comptabilisant au moins quatre consultations aux urgences durant les douze mois précédents. Les patients adultes (>18 ans) ayant consulté les urgences entre avril 2008 et mars 2009 (période d'étude) étaient inclus ; ceux quittant les urgences sans décharge médicale étaient exclus. Pour chaque patient, le premier dossier d'urgence informatisé inclus dans la période d'étude était sélectionné pour l'extraction des données. Outre les variables démographiques de base, les variables d'intérêt comprennent des caractéristiques sociales (emploi, type de résidence) et médicales (diagnostic principal aux urgences). Les facteurs sociaux et médicaux significatifs ont été utilisés dans la construction d'un modèle de régression logistique, afin de déterminer les facteurs associés avec le recours multiple aux urgences. De plus, la combinaison des facteurs sociaux et médicaux a été étudiée. Résultats Au total, 359/Γ591 patients à recours multiple et 360/34'263 contrôles ont été sélectionnés. Les patients à recours multiple représentaient moins d'un vingtième de tous les patients des urgences (4.4%), mais engendraient 12.1% de toutes les consultations (5'813/48'117), avec un record de 73 consultations. Aucune différence en termes d'âge ou de genre n'est apparue, mais davantage de patients à recours multiples étaient d'une nationalité autre que suisse ou européenne (n=117 [32.6%] vs n=83 [23.1%], p=0.003). L'analyse multivariée a montré que les facteurs de vulnérabilité sociaux et médicaux les plus fortement associés au recours multiple aux urgences étaient : être sous tutelle (Odds ratio [OR] ajusté = 15.8; intervalle de confiance [IC] à 95% = 1.7 à 147.3), habiter plus proche des urgences (OR ajusté = 4.6; IC95% = 2.8 à 7.6), être non assuré (OR ajusté = 2.5; IC95% = 1.1 à 5.8), être sans emploi ou dépendant de l'aide sociale (OR ajusté = 2.1; IC95% = 1.3 à 3.4), le nombre d'hospitalisations psychiatriques (OR ajusté = 4.6; IC95% = 1.5 à 14.1), ainsi que le recours à au moins cinq départements cliniques différents durant une période de douze mois (OR ajusté = 4.5; IC95% = 2.5 à 8.1). Le fait de comptabiliser deux sur quatre facteurs sociaux augmente la vraisemblance du recours multiple aux urgences (OR ajusté = 5.4; IC95% = 2.9 à 9.9) ; des résultats similaires ont été trouvés pour les facteurs médicaux (OR ajusté = 7.9; IC95% = 4.6 à 13.4). La combinaison de facteurs sociaux et médicaux est fortement associée au recours multiple aux urgences, puisque les patients à recours multiple étaient dix fois plus à même d'en comptabiliser trois d'entre eux (sur un total de huit facteurs, IC95% = 5.1 à 19.6). Conclusion Les patients à recours multiple aux urgences représentent une proportion modérée des consultations aux urgences du Centre Hospitalier Universitaire Vaudois et de la Policlinique Médicale Universitaire de Lausanne. Les facteurs de vulnérabilité sociaux et médicaux sont associés au recours multiple aux urgences. En outre, les patients à recours multiple sont plus à même de combiner les vulnérabilités sociale et médicale que les autres. Des stratégies basées sur le case management pourraient améliorer la prise en charge des patients à recours multiple avec leurs vulnérabilités afin de prévenir les inégalités dans le système de soins ainsi que les coûts relatifs.

Développement d'outils de surveillance biologique pour l'évaluation des risques à la santé de travailleurs en arboriculture et en viticulture exposés aux fongicides

De nombreux travailleurs utilisent le captan et le folpet comme fongicides en agriculture, mais leur exposition n'est pas toujours mesurée de manière spécifique et précise. La surveillance biologique est un excellent outil à cet effet puisqu'elle permet de quantifier l'exposition réelle. Toutefois, la majorité des connaissances toxicologiques pour ces fongicides proviennent d'études sur les animaux, et les données chez l'humain sont limitées.Le but du présent projet est donc de développer des outils de surveillance biologique pour évaluer l'exposition de travailleurs au captan et au folpet. Dans cette perspective, le projet a été subdivisé en trois parties complémentaires, soit i) de développer des méthodes analytiques spécifiques pour quantifier les biomarqueurs d'intérêt du captan, à savoir le tétrahydrophtalimide (THPI), et du folpet, à savoir le phtalimide (PI) et l'acide phtalique, dans le plasma et l'urine; ii) de déterminer la toxicocinétique des deux fongicides en exposant desvolontaires de façon aigüe à de faibles doses de captan ou de folpet par voie orale et cutanée dans des conditions semi-contrôlées et en quantifiant les biomarqueurs dans chacune des deux matrices, excepté l'acide phtalique qui a été mesuré seulement dans l'urine; iii) de valider les biomarqueurs d'exposition sélectionnés et d'évaluer l'exposition réelle des travailleurs et les voies prédominantes d'exposition au captan et au folpet en collectant des données biologiques chez des travailleurs en arboriculture et en viticulture lors d'activités de traitement et d'effeuillage pendant sept jours consécutifs.Selon ces travaux, le THPI et le PI sont deux biomarqueurs valides et spécifiques pour quantifier l'exposition au captan et au folpet, respectivement, chez l'humain. En effet, les méthodes développées pour ces deux métabolites sont robustes avec des limites de détection plus sensibles que celles rapportées dans la littérature, un taux de recouvrement de 90% pour le THPI et de 75% pour le PI, une très bonne linéarité (R2>0,99) et une bonne stabilité avec des variations intra- et inter-journalières faibles (RSD<15%). Elles ont permis de déterminer les profils cinétiques des deux métabolites chez les volontaires et chez les travailleurs. Ces derniers indiquent d'ailleurs une élimination rapide, avec une demi-vie d'élimination dans l'urine de 11,7 h et 18,7 h pour le THPI et de 27,3 h et 28,8 h pour le PI, respectivement après une absorption par voie orale et cutanée, ainsi qu'une faible absorption cutanée lorsque les valeurs sont comparées pour les deux voies d'exposition. Des profils parallèles sont aussi observés entre le PI et l'acide phtalique pour les volontaires et les agriculteurs, mais le folpet se retrouve davantage métabolisé sous forme d'acide phtalique que de PI. Quant à l'étude des agriculteurs, elle montre que la voie principale d'exposition de ces travailleurs est la voiecutanée. Il est aussi souligné qu'il est important 1) de favoriser les collectes d'urines complètes sur 24 h au urines ponctuelles, 2) de mesurer plusieurs métabolites, et 3) d'associer les données de surveillance biologique à la toxicocinétique. Ainsi, les connaissances acquises par cette étude peuvent s'appliquer à d'autres fongicides, voire d'autres substances.

Haemodialysis acutely reduces the plasma levels of ADMA without reversing impaired NO-dependent vasodilation

Rapport de synthèse : Introduction: la prévalence de l'insuffisance rénale chronique (IRC) augmente et malgré les traitements de remplacement rénal telle que la transplantation ou la dialyse, la mortalité chez des patients atteints d'une IRC reste très élevée. Les maladies cardiovasculaires sont la cause principale de mortalité chez ces patients, et le risque de décès dú à une complication cardiovasculaire est chez eux accru de 10 à 20 fois par rapport à la population générale. Méme si les facteurs de risque cardiovasculaires «traditionnels », principalement l'hypertension artérielle et le diabète sont très prévalents chez les patients avec IRC, ils sont insuffisants pour expliquer l'excès de mortalité cardiovasculaire. D'autres facteurs de risques « nontraditionnels » comme l'accumulation du diméthylarginine asymétrique (ADMA), un inhibiteur endogène de la synthase d'oxyde d'azote (NO), semblent aussi être importants. Chez les patients avec IRC, des taux élevés d'ADMA sont un puissant facteur prédictif indépendant de la mortalité cardiovasculaire. Il a également été démontré chez des souris que l'ADMA peut étre une cause directe de dysfonction endothéliale. Cette dernière joue un rôle primordial dans le développement de l'athérosclérose, cause principale des complications cardiovasculaires. Le but du présent travail est de tester l'hypothèse qu'une réduction du taux d'ADMA après une séance unique d'hémodialyse améliore la dysfonction endothéliale. Méthodes: la dysfonction endothéliale peut être évaluée dans les microvaisseaux de la péan de façon non invasive par fluxmétrie laser Doppler. La vasodilatation cutanée induite par un échauffement local de 34° à 41 °C (hyperémie thermique) est connue pour être dépendante de la production endothéliale de NO et a été utilisée dans plusieurs études cliniques pour évaluer la dysfonction endothéliale. Nous avons recruté 24 patients traités par hémodialyse chronique et également 24 sujets contrôles du même âge et sexe. Chez les patients dialysés, l'hyperémie thermique est mesuré une fois directement avant une séance d'hémodialyse, et une fois directement après une autre séance, toutes deux distantes de 2 à 7 jours. En même temps, les taux plasmatiques d'ADMA sont mesurés par la méthode de spectrométrie de masse en tandem. Chez les sujets contrôle, l'hyperémie thermique est également mesurée à deux reprises, à un intervalle de 2 à 7 jours comme chez les patients dialysés et les taux d'ADMA sont déterminés qu'une seule fois. Résultats: chez les patients dialysés, les réactions d'hyperémie thermique étaient superposables avant et après dialyse, mais moindre que chez les sujets contrôles. Par contre, les taux d'ADMA étaient plus élevés avant qu'après dialysé. Les taux d'ADMA après dialyse étaient similaires aux taux chez les sujets contrôles. Conclusion: cette étude montre que la vasodilatation dépendante de la production endothéliale de NO dans la microcirculation cutanée n'est pas influencée par les taux plasmatiques d'ADMA chez les patients dialysés. Ces résultats suggèrent que d'autres mécanismes sont responsables de la dysfonction endothéliale chez ces patients. Ceci met en question le concept que l'accumulation d'ADMA est un facteur causal du risque cardiovasculaire élevé et suggère que l'ADMA est juste un marqueur du milieu très athérogénique causé par l'IRC.

Pollution stress on aquatic microbial communities

Thousands of chemical compounds enter the natural environment but many have unknown effects and consequences, in particular at low concentrations. This thesis work contributes to our understanding of pollution effects by using bacteria as test organisms. Bacteria are important for this question because some of them degrade and transform pollutants into less harmful compounds, but secondly because they themselves can be inhibited in their reproduction by exposure to toxic compounds. When inhibitory effects occur this may change the composition of the microbial com¬munity in the long run, leading to altered or diminished ecosystem services by those communities. As a result chemicals of anthropogenic origin may accumulate and per¬sist in the environment, and finally, affect higher organisms as well. In addition to acquiring basic understanding of pollutant effects at low concentrations on bacterial communities an applied goal of this thesis work was to develop bacteria-based tests to screen new organic chemicals for toxicity and biodégradation. In the first part of this work we developed a flow cytometry-based assay on SYT09 plus ethidium-bromide or propidium-iodide stained cells of Pseudomonas ûuorescens exposed or not to a variety of pollutants under oligotrophic growth conditions. Flow cytometry (FC) allows fast and accurate counting of bacterial cells under simul¬taneous assessment of their physiological state, in particular in combination with different fluorescent dyes. Here we employed FC and fluorescent dyes to monitor the effect that pollutants may exert on Pseudomonas ûuorescens SV3. First we designed an oligotrophic growth test, which enabled us to follow population growth at low densities (104 - 10 7 cells per ml) using 0.1 mM sodium acetate as carbon source. Cells in the oligotrophic milieu were then exposed or not to a variety of common pollutants, such as 2-chlorobiphenyl (2CBP), naphthalene (NAH), 4-chlorophenol (4CP), tetradecane (TD), mercury chloride (HgCl2) or benzene, in different dosages. Exposed culture samples were stained with SYT09 (green fluorescent dye binding nucleic acids, generally staining all cells) in combination with propidium iodide (PI) or ethidium bromide (EB), both dyes being membrane integrity indicators. We ob- served that most of the tested compounds decreased population growth in a dosage- dependent manner. SYT09/PI or SYT09/EB staining then revealed that chemical exposure led to arisal of subpopulations of live and injured or dead cells. By modeling population growth on the total cell numbers in population or only the subpopulation of live cells we inferred that even in stressed populations live cells multiply at rates no different to unexposed controls. The net decrease in population growth would thus be a consequence of more and more cells being not able to multiply at all, rather than all cells multiplying at slower rates. In addition, the proportion of injured cells correlated to the compound dosage. We concluded that the oligotrophic test may be useful to asses toxicity of unknown chemicals on a variety of model bacteria. Mul¬tiple tests can be run in parallel and effects are rapidly measured within a period of 8 hours. Interestingly, in the same exposure tests with P. fluorescens SV3 we observed that some chemicals which did not lead to a reduction of net population growth rates did cause measurable effects on live cells. This was mainly observed in cells within the live subpopulation as an increase of the EB fluorescence signal. We showed that SYT09/EB is a more useful combination of dyes than SYT09/PI because PI fluorescence tend to increase only when cells are effectively dead, but not so much in live cells (less then twofold). In contrast, EB geometric mean fluorescence in live cells increased up to eightfold after exposure to toxic compounds. All compounds even at the lowest concentration caused a measurable increase in EB geometric mean fluorescence especially after 2 h incubation time. This effect was found to be transient for cells exposed to 2CBP and 4CP, but chronic for cells incubated with TD and NAH (ultimately leading to cell death). In order to understand the mechanism underlying the observed effects we used known membrane or energy uncouplers. The pattern of EB signal increase in chemical-exposed populations resembled mostly that of EDTA, although EB fluorescence in EDTA-treated or pasteurized cells was even higher than after exposure to the four test chemicals. We conclude that the ability of cells to efflux EB under equilibrium conditions is an appropriate measure for the potential of a chemical to exert toxicity. Since most bacterial species possess efflux systems for EB that all require cellular energy, our test should be more widely relevant to infer toxicity effects of chemical exposure on the physiological status of the bacterial cell. To better understand the effect of toxicant exposure on efflux defense systems, we studied 2-hydroxybiphenyl toxicity to Pseudomonas azeiaica HBP1. We showed that 2-HBP exerts toxicity even to P. azelaica HBP1, but only at concentrations higher than 0.5 mM. Above this concentration transient loss of membrane polarization and integrity occurred, which we conclude from staining of growing cells with fluorescent dyes. Cells finally recover and resume growth on 2HBP. The high resistance of P. azelaica HBP1 to 2-HBP was found to be the result of an efficient MexABOprM- type efflux pump system counteracting passive influx of this compound into the membrane and cellular interior. Mutants with disrupted mexA, mexB and oprM genes did no longer grow on 2-HBP at concentrations above 100 μΜ, whereas below this concentration we found 2-HBP-concentration dependent decrease of growth rate. The MexAB-OprM system in P. azeiaica HBP1 is indeed an efflux pump for ethidium bromide as well. By introducing gfp reporter fusions responsive to intracellular 2- HBP concentrations into HBP1 wild-type or the mutants we demonstrated that 2HBP enters into the cells in a similar way. In contrast, the reporter system in the wild-type cells does not react to 2-HBP at an outside concentration of 2.4 μΜ, whereas in mutant cells it does. This suggests that wild-type cells pump 2-HBP to the outside very effectively preventing accumulation of 2-HBP. 2HBP metabolism, therefore, is not efficient enough to lower the intracellular concentration and prevent toxicity. We conclude that P. azelaica HBP1 resistance to 2-HBP is mainly due to an efficient efflux system and that 2HBP in high concentrations exerts narcotic effects on the bacterial membrane. In the part of this thesis, we investigated the possibilities of bacteria to degrade pollutants at low concentrations (1 mg per L and below). As test components we used 2-hydroxybiphenyl, antibiotics and a variety of fragrances, many of which are known to be difficult to biodegrade. By using accurate counting of low numbers of bacterial cells we could demonstrate that specific growth on these compounds is possible. We demonstrated the accuracy of FC counting at low cell numbers (down to 103 bacterial cells per ml). Then we tested whether bacterial population growth could be specifically monitored at the expense of low substrate concentrations, us¬ing P. azelaica HBP1. A perfect relationship was found between growth rate, yield and 2-HBP concentrations in the range of 0.1 up to 5 mg per L. Mixing P. azelaica within sludge, however, suggested that growth yields in a mixed community can be much lower than in pure culture, perhaps because of loss of metabolic intermediates. We then isolated new strains from activated sludge using 2-HBP or antibiotics (Nal, AMP, SMX) at low concentrations (0.1-1 mg per L) as sole carbon and energy sub¬strate and PAO microdishes. The purified strains were then examined for growth on their respective substrate, which interestingly, showed that all strains can not with¬stand higher than 1 or 10 mg per L concentrations of target substrate. Thus, bacteria must exist that contribute to compound degradation at low pollutant concentrations but are inhibited at higher concentrations. Finally we tested whether specific biomass growth (in number of cells) at the expense of pollutants can also be detected with communities as starting material. Hereto, we focused on a number of fragrance chemicals and measured community biomass increase by flow cytometry cell counting on two distinct starter communities: (i) diluted Lake Geneva water, and dilute activated sludge from a wastewater treatment plant. We observed that most of the test compounds indeed resulted in significant biomass increase in the starter community compared to a no-carbon added control, but activated sludge and lake Geneva water strongly differed (almost mutually ex¬clusive) in their capacity to degrade the test chemicals. In two cases for activated sludge the same type of microbial community developed upon compound exposure, as concluded from transcription fragment length polymorphism analysis on community purified and PCR amplified 16S rRNA gene fragments. To properly test compound biodegradability it is thus important to use starter communities of different origin. We conclude that FC counting can be a valuable tool to screen chemicals for their biodegradability and toxicity. - Des milliers de produits chimiques sont libérés dans l'environnement mais beaucoup ont des effets inconnus, en particulier à basses concentrations. Ce travail de thèse contribue à notre comprehension des effets de la pollution en utilisant des bacteries comme des organismes-tests. Les bacteries sont importantes pour etudier cette ques¬tion car certaines d'entre elles peuvent degrader ou transformer les polluants, mais également parce qu'elles-mmes peuvent tre inhibees dans leur reproduction après avoit ete exposees à ces composes toxiques. Quand des effets inhibiteurs ont lieu, la composition de la communauté microbienne peut tre changee à long terme, ce qui mène à une reduction du service d'ecosystème offert par ces communautés. En consequence, après leur liberation dans l'environnement, les produits chimiques d'origine anthropogenique peuvent soit s'y accumuler et per¬sister, exerant ainsi des effets encore inconnus sur les organismes vivants. En plus d'acquérir des connaissances de base sur les effets des polluants à basses concentra¬tions sur les communautés microbiennes, un but applique de cette thèse était de développer des tests bases sur les bacteries afin d'identifier de nouveau composes pour leur toxicité ou leur biodégradation. Dans la première partie de ce travail, nous avons developpe un test base sur la cytometrie de flux (FC) sur des cellules de Pseudomonas fluorescens colorees par du bromure d'ethidium ou de l'iodure de propidium et exposees ou non à une palette de polluants sous des conditions de croissance oligotrophique. La cytometrie de flux est une technique qui connaît de nombreuses applications dans la microbiologie environ¬nementale. Cela est principalement du au fait qu'elle permet un comptage rapide et precis ainsi que l'évaluation de l'état physiologique, en particulier lorsqu'elle est combinée h des colorations fluorescentes. Ici, nous avons utilise la technique FC et des colorants fluorescents afin de mesurer l'effet que peuvent exercer certains pollu¬ants sur Pseudomonas ûuorescens SV3 . D'abord nous avons conu des tests oligo- trophiques qui nous permettent de suivre la croissance complète de cellules en culture h des densites faibles (104 -10 7 cellules par ml), sur de l'acetate de sodium à 0.1 mM, en presence ou absence de produits chimiques (2-chlorobiphenyl (2CBP), naphthalène (NAH), 4-chlorophenol (4CP), tetradecane (TD), chlorure de mercure(II) (HgCl2)) à différentes concentrations. Afin de montrer le devenir des bacteries tant au niveau de la cellule individuelle que celui de la population globale, après exposition à des series de composes chimiques, nous avons compte les cellules colorees avec du SYT09 (col¬orant fluorescent vert des acides nucléiques pour la discrimination des cellules par rapport au bruit de fond) en combinaison avec l'iodure de propidium (PI) ou le bromure d'ethidium (EB), indicateurs de l'intégrité de la membrane cellulaire avec FC. Nous avons observe que de nombreux composes testes avaient un effet sur la croissance bacterienne, resultant en une baisse du taux de reproduction de la pop¬ulation. En outre, la double coloration que nous avons utilisee dans cette etude SYT09/PI ou SYT09/EB a montre que les produits chimiques testes induisaient une reponse heterogène des cellules dans la population, divisant celle-ci en sous- populations "saine", "endommagee" ou "morte". Les nombres de cellules à partir du comptage et de la proportion de celles "saines" et "endommagees/mortes" ont ensuite ete utilises pour modeliser la croissance de P. ûuorescens SV3 exposee aux produits chimiques. La reduction nette dans la croissance de population est une consequence du fait que de plus en plus de cellules sont incapables de se reproduire, plutt que du fait d'une croissance plus lente de l'ensemble de la population. De plus, la proportion de cellules endommagees est correllee au dosage du compose chimique. Les résultats obtenus nous ont permis de conclure que le test oligotrophique que nous avons developpe peut tre utilise pour l'évaluation de la toxicité de produits chimiques sur différents modèles bacteriens. Des tests multiples peuvent tre lances en parallèle et les effets sont mesures en l'espace de huit heures. Par ailleurs, nous en déduisons que les produits chimiques exercént un effet sur la croissance des cellules de P. ûuorescens SV3, qui est heterogène parmi les cellules dans la population et depend du produit chimique. Il est intéressant de noter que dans les mmes tests d'exposition avec P. ûuorescens SV3, nous avons observe que certains composes qui n'ont pas conduit à une reduction du taux de la croissance nette de la population, ont cause des effets mesurables sur les cellule saines. Ceci a ete essentiellement observe dans la portion "saine" des cellules en tant qu'augmentation du signal de la fluorescence de 1ΈΒ. D'abord nous avons montre que SYT09/EB était une com¬binaison de colorants plus utile que celle de SYT09/PI parce que la fluorescence du PI a tendance à augmenter uniquement lorsque les cellules sont effectivement mortes, et non pas dans les cellules saines (moins de deux fois plus). Par opposi¬tion, la fluorescence moyenne de l'EB dans les cellules saines augmente jusqu'à huit fois plus après exposition aux composes toxiques. Tous les composes, mme aux plus basses concentrations, induisent une augmentation mesurable de la fluorescence moy¬enne de 1ΈΒ, plus particulièrement après deux heures d'incubation. Cet effet s'est revele tre transitoire pour les cellules exposees aux 2CNP et 4CP, mais est chro¬nique pour les cellules incubees avec le TD et le NAH (entranant la mort cellulaire). Afin de comprendre les mécanismes qui sous-tendent les effets observes, nous avons utilise des decoupleurs d'energie ou de membrane. L'augmentation du signal EB dans les populations causee par des produits chimiques ressemblait à celle exerce par le chelateur des ions divalents EDTA. Cependant, les intensités du signal EB des cellules exposees aux produits chimiques testees n'ont jamais atteint les valeurs des cellules traitees avec l'EDTA ou pasteurises. Nous en concluons que le test oli- gotrophique utilisant la coloration (SYT09/)EB des cellules exposees ou non à un produit chimique est utile afin d'evaluer l'effet toxique exerce par les polluants sur la physiologie bacterienne. Afin de mieux comprendre la reaction d'un système de defense par pompe à efflux après exposition à une toxine, nous avons étudié la toxicité du 2-hydroxybiphenyl (2-HBP) sur Pseudomonas azeiaica HBP1. Nous avons montre que le 2-HBP exerce une toxicité mme sur HBP1, mais uniquement à des concentrations supérieures à 0.5 mM. Au-dessus de cette concentration, des pertes transitoires d'intégrité et de polarization membranaire ont lieu, comme cela nous a ete montre par coloration des cellules en croissance. Les cellules sont finalement capables de se rétablir et de reprendre leur croissance sur 2-HBP. La forte resistance de P. azeiaica HBP1 h 2-HBP physiologie bacterienne s'est revele tre le résultat d'un système de pompe h efflux de type MexABOprM qui contre-balance l'influx passif de ce compose h travers la membrane. Nous avons montre, en construisant des mutants avec des insertions dans les gènes mexA, mexB and oprM et des fusions avec le gène rapporteur gfp, que l'altération de n'importe quelle partie du système d'efflux conduisait à accroître l'accumulation de 2-HBP dans la cellule, en comparaison avec la souche sauvage HBP1, provoquant une diminution de la resistance au 2-HBP ainsi qu'une baisse du taux de reproduction des cellules. Des systèmes d'efflux similaires sont répandus chez de nombreuses espèces bactériennes. Ils seraient responsables de la resistance aux produits chimiques tels que les colorants fluorescents (bromure d'ethidium) et des antibiotiques. Nous concluons que la resistance de P. azelaica HBP1 à 2-HBP est principalement due à un système d'efflux efficace et que 2-HBP, à des concentrations elevees, exerce un effet deletère sur la membrane bacterienne. En se basant sur le comptage des cellules avec la FC, nous avons developpe ensuite une methode pour evaluer la biodegradabilite de polluants tels que le 2-HBP ainsi que les antibiotiques (acide nalidixique (Nal), ampicilline (AMP) ou sulfamethoxazole (SMX)) à de faibles concentrations lmg par L et moins), par le suivi de la croissance spécifique sur le compose de cultures microbiennes pures et mixtes. En utilisant un comptage precis de faibles quantités de cellules nous avons pu demontrer que la croissance spécifique sur ces composes est possible. Nous avons pu illustrer la precision du comptage par cytometrie de flux à faible quantité de cellules (jusqu'à 10 3 cellules par ml). Ensuite, nous avons teste s'il était possible de suivre dynamiquement la croissance de la population de cellules sur faibles concentrations de substrats, en utilisant P. azelaica HBP1. Une relation parfaite a ete trouvee entre le taux de croissance, le rendement et les concentrations de 2-HBP (entre 0.1 et 5 mg par L). En mélangeant HBP1 à de la boue active, nous avons pu montrer que le rendement en communauté mixtes pouvait tre bien inférieur qu'en culture pure. Ceci étant peut tre le résultat d'une perte d'intermédiaires métaboliques. Nous avons ensuite isole de nouvelles souches à partir de la boue active en utilisant le 2-HBP ou des antibiotiques (Nal, AMP, SMX) h basses concentrations (0.1-1 mg par L) comme seules sources de carbone et d'energie. En combinaison avec ceci, nous avons également utilise des microplaques PAO. Les souches purifiees ont ensuite ete examinees pour leurs croissances sur leurs substrats respectifs. De faon intéressante, toutes ces souches ont montre qu'elles ne pouvaient pas survivre à des concentrations de substrats supérieures à 1 ou 10 mg par L. Ainsi, il existe des bacteries qui contribuent à la degradation de composes à basses concentrations de polluant mais sont inhibes lorsque ces concentrations deviennent plus hautes. Finalement, nous avons cherche à savoir s'il est possible de detecter une croissance spécifique à une biomasse au depend d'un polluant, en partant d'une communauté microbienne. Ainsi, nous nous sommes concentre sur certains composes et avons mesure l'augmentation de la biomasse d'une communauté grce à la cytometrie de flux. Nous avons compte deux communautés de depart distinctes: (i) une dilution d'eau du Lac Léman, et une dilution de boue active d'une station d'épuration. Nous avons observe que la plupart des composes testes ont entrane une augmentation de la biomasse de depart par rapport au control sans addition de source de carbone. Néanmoins, les échantillons du lac Léman et de la station d'épuration différaient largement (s'excluant mutuellement l'un l'autre) dans leur capacité à degrader les composes chimiques. Dans deux cas provenant de la station d'épuration, le mme type de communauté microbienne s'est developpe après exposition aux composes, comme l'a démontré l'analyse TRFLP sur les fragments d'ARN 16S purifie de la communauté et amplifie par PCR. Afin de tester correctement la biodegradabilite d'un compose, il est donc important d'utiliser des communautés de depart de différentes origines Nous en concluons que le comptage par cytometrie de flux peut tre un outil de grande utilité pour mettre en valeur la biodegradabillite et la toxicité des composes chimiques.

Functional diversity of CD8+ T-cell subsets in chronic infection

Certains pathogènes tels que le virus de l'hépatite C ainsi que le virus de l'immunodéficience humaine sont capables de détourner les mécanismes de défense du système immunitaire adaptatif afin d'établir des infections chroniques chez l'homme. La souche clone-13 du virus de la chorioméningite lymphocytaire est utilisée comme modèle d'études d'infection virale chronique chez la souris. Les raisons qui expliqueraient la persistance de certains virus ne sont pas encore bien définies. Toutefois, il a été montré qu'une exposition prolongée à un environnement inflammatoire ainsi que la présence prolongée de l'antigène sont des facteurs qui vont déclencher un procédé de différentiation particulier des lymphocytes T CD8+. Ces cellules sur-expriment alors des récepteurs inhibiteurs tels que PD-1 tandis que leur capacité à produire des cytokines diminue. Ce procédé de différentiation est appelé « exhaustion » et serait à l'origine de la génération de réponses lymphocytaires non ou peu fonctionnelles entraînant de ce fait la persistance de l'infection. Néanmoins, il a également été démontré que ces lymphocytes maintiennent des fonctions effectrices et qu'ils permettent de limiter la réplication du virus. Afin d'étudier la fonction effectrice résiduelle de ces lymphocytes T, nous avons transféré des cellules provenant de souris infectées chroniquement dans des souris receveuses naïves qui ont à leur tour été infectées avec le virus. Grâce à ces expériences, nous avons démontré que les cellules transférées contiennent des cellules qui sont capables de i) re-proliférer, ii) de protéger les souris contre une infection virale, et de iii) survivre en l'absence d'antigène. Nous avons remarqué que les cellules stimulées de façon chronique maintiennent le même phénotype lorsqu'elles sont transférées dans des souris naïves soumises à une infection virale aiguë. Nous avons de ce fait conclu que les cellules stimulées chroniquement contiennent une sous-population de cellules qui comporte des attributs de cellules T mémoire. D'autre part, nous avons pu identifier le facteur de transcription Tcf-1 comme l'élément essential pour la génération des cellules T ressemblant à des cellules mémoires. D'autre part, nous avons étudié l'impact du niveau de stimulation via le récepteur des cellules T (TCR) sur le phénotype adopté par les lymphocytes T au cours d'une infection chronique. Dans ce but, nous avons généré des souches de virus recombinants qui expriment un épitope modifié de manière à réduire le niveau de stimulation via le TCR. D'autre part, nous avons utilisé un mélange de deux souches virales de manière à moduler spécifiquement la quantité d'un épitope tout en conservant la même charge virale. Nous avons montré que la quantité d'antigène avait plus d'influence sur le phénotype des lymphocytes T que la force d'interaction entre le complexe peptide-CMH et le TCR. De plus, l'apparition de ce phénotype ne semble pas avoir d'impact sur la prolifération des cellules en réponse à une infection primaire ou secondaire. Ainsi, nous proposons un modèle par lequel le procédé d'« exhaustion » des cellules T correspond à une différentiation cellulaire particulière qui est indépendante de la capacité de prolifération des cellules. De manière générale, ces découvertes apportent de nouvelles connaissances sur les sous-catégories de lymphocytes T CD8+ qui sont générés pendant une infection virale chronique. Nous pensons que la réponse effectrice du système immunitaire est maintenue pendant de longues périodes grâce à la présence de cellules par partagent certaines caractéristiques avec des cellules mémoires. L'étude approfondie de ces cellules peut avoir des implications importantes sur l'optimisation des stratégies utilisant l'immunothérapie pour combattre les infections chroniques et cancers.

Discovery of novel arenavirus receptors and entry factors

Arenaviruses are enveloped negative-strand RNA viruses that contain a bi-segmented genome. They are rodent-borne pathogens endemic to the Americas and Africa, with the exception of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) that is world-wide distributed. The arenaviruses include numerous important human pathogens including the Old World arenavirus Lassa virus (LASV), the causative agent of a severe viral hemorrhagic fever in humans with several hundred thousand infections per year in Africa and thousands of deaths. Viruses are obligatory intracellular parasites, strictly depending on cellular processes and factors to complete their replication cycle. The binding of a virus to target cells is the first step of every viral infection, and is mainly mediated by viral proteins that can directly engage cellular receptors, providing a key determinant for viral tropism. This early step of infection represents a promising target to block the pathogen before it can take control over the host cell. Old World arenaviruses, such as LASV and LCMV, bind to host cells via attachment to their main receptor, dystroglycan (DG), an ubiquitous receptor for extracellular matrix proteins. The engagement of DG by LASV results in a fast internalization and transfer the virus to late endosomal compartment suggesting that the virus binding to DG causes marked changes in the dynamics of the receptor. These events could result in the clustering of the receptor and subsequent induction of signaling that could be modulated by the virus. Recently, numerous findings also suggest the presence of alternative receptor(s) for LASV in absence of the main DG receptor. In my first project, I was interested to investigate the effects of virus-receptor binding on the tyrosine phosphorylation of the cytoplasmic domain of DG and to test if this post-translational modification was crucial for the internalization of the LASV-receptor complex. We found that engagement of cellular DG by a recombinant LCMV expressing the envelope GP of LASV in human epithelial cells induced tyrosine phosphorylation of the cytoplasmic domain of DG. LASV GP binding to DG further resulted in dissociation of the adapter protein utrophin from virus-bound DG. Virus-induced dissociation of utrophin and consequent virus internalization were affected by the broadly specific tyrosine kinase inhibitor genistein. We speculate that the detachment of virus- bound DG from the actin-based cytoskeleton following DG phosphorylation may facilitate subsequent endocytosis of the virus-receptor complex. In the second project, I was interested to characterize the newly indentified LASV alternative receptor Axl in the context of productive arenavirus infection. In a first step, we demonstrated that Axl supports productive infection by rLCMV-LASVGP in a DG-independent manner. In line with previous studies, cell entry of rLCMV-LASVGP via Axl was less efficient when compared to functional DG. Interestingly, Axl-mediated infection showed rapid kinetics similar to DG-dependent entry. Using a panel of inhibitors, we found that Axl-mediated cell entry of rLCMV-LASVGP involved a clathrin-independent pathway that critically depended on actin and dynamin and was sensitive to EIPA but not to PAK inhibitors, compatible with a macropinocytosis-like mechanism of entry. In a next step, we aimed to investigate the molecular mechanism by which rLCMV-LASVGP recognizes Axl. Phosphatidylserine (PS) is the natural ligand of Axl via the adaptor protein Gas6. We detected the presence of PS in the envelope of Old World arenaviruses, suggesting that PS could mediate Axl-virus binding, in a mechanism of apoptotic mimicry already described for other viruses. Whether envelope PS and/or the GP of LASV plays any role in virus entry via Axl is still an open question. The molecular mechanisms underlying host cell-virus interaction are of particular interest to answer basic scientific questions as well as to apply key findings to translational research. Understanding pathogen induced-signaling and its link to invasion of the host cell is of great importance to develop drugs for therapeutic intervention against highly pathogenic viruses like LASV. - Les Arenavirus sont des virus enveloppés à ARN négatifs organisés sous forme de génome bisegmenté. Ils sont véhiculés par les rongeurs et se retrouvent de manière endémique aux Amériques et en Afrique avec l'exception du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV) qui lui est distribué mondialement. De nombreux pathogènes humains font parti de la famille des Arenavirus dont le virus de l'Ancien Monde Lassa (LASV), un agent responsable de fièvres hémorragiques sévères chez les humains. Le virus de Lassa cause plusieurs centaines de milliers d'infections par année en Afrique ainsi que des milliers de morts. De manière générale, les virus sont des parasites intracellulaires obligatoires qui dépendent strictement de processus et facteurs cellulaires pour clore leur cycle de réplication. L'attachement d'un virus à sa cellule cible représente la première étape de chaque infection virale et est principalement dirigée par des protéines virales qui interagissent directement avec leur récepteurs cellulaires respectifs fournissant ainsi un indicateur déterminant pour le tropisme d'un virus. Cette première étape de l'infection représente aussi une cible prometteuse pour bloquer le pathogène avant qu'il ne puisse prendre le contrôle de la cellule. Les Arenavirus de l'Ancien Monde comme LASV et LCMV s'attachent à la cellule hôte en se liant à leur récepteur principal, le dystroglycan (DG), un récepteur ubiquitaire pour les protéines de la matrice extracellulaire. La liaison du DG par LASV résulte en une rapide internalisation transférant le virus aux endosomes tardifs suggérant ainsi que l'attachement du virus au DG peut provoquer des changements marqués dans la dynamique moléculaire du récepteur. Ces événements sont susceptibles d'induire un regroupement du récepteur à la surface cellulaire, ainsi qu'une induction subséquente qui pourrait être, par la suite, modulée par le virus. Récemment, plusieurs découvertes suggèrent aussi la présence d'un récepteur alternatif pour LASV en l'absence du récepteur principal, le DG. Concernant mon premier projet, j'étais intéressée à étudier les effets de la liaison virus- récepteur sur la phosphorylation des acides aminés tyrosines se trouvant dans la partie cytoplasmique du DG, le but étant de tester si cette modification post-translationnelle était cruciale pour Γ internalisation du complexe LASV-DG récepteur. Nous avons découvert que l'engagement du récepteur DG par le virus recombinant LCMV, exprimant la glycoprotéine de LASV, dans des cellules épithéliales humaines induit une phosphorylation de résidu(s) tyrosine se situant dans le domaine cytoplasmique du DG. La liaison de la glycoprotéine de LASV au DG induit par la suite la dissociation de la protéine adaptatrice utrophine du complexe virus-DG récepteur. Nous avons observé que cette dissociation de l'utrophine, induite par le virus, ainsi que son internalisation, sont affectées par l'inhibiteur à large spectre des tyrosines kinases, la génistéine. Nous avons donc supposé que le détachement du virus, lié au récepteur DG, du cytosquelette d'actine suite à la phosphorylation du DG faciliterait l'endocytose subséquente du complexe virus-récepteur. Dans le second projet, j'étais intéressée à caractériser le récepteur alternatif Axl qui a été récemment identifié dans le contexte de l'infection productive des Arenavirus. Dans un premier temps, nous avons démontré que le récepteur alternatif Axl permet l'infection des cellules par le virus LCMV recombinant LASV indépendamment du récepteur DG. Conformément aux études publiées précédemment, nous avons pu observer que l'entrée du virus recombinant LASV via Axl est moins efficace que via le récepteur principal DG. De façon intéressante, nous avons aussi remarqué que l'infection autorisée par Axl manifeste une cinétique virale d'entrée similaire à celle observée avec le récepteur DG. Utilisant un éventail de différents inhibiteurs, nous avons trouvé que l'entrée du virus recombinant rLCMV-LASVGP via Axl implique une voie d'entrée indépendante de la clathrine et dépendant de manière critique de l'actine et de la dynamine. Cette nouvelle voie d'entrée est aussi sensible à l'EIPA contrairement aux inhibiteurs PAK indiquant un mécanisme d'entrée compatible avec un mécanisme de macropinocytose. L'étape suivante du projet a été d'investiguer le mécanisme moléculaire par lequel le virus recombinant rLCMV-LASVGP reconnaît le récepteur alternatif Axl. La phosphatidylsérine (PS) se trouve être un ligand naturel pour Axl via la protéine adaptatrice Gas6. Nous avons détecté la présence de PS dans l'enveloppe des Arenavirus du Vieux Monde suggérant que la PS pourrait médier la liaison du virus à Axl dans un mécanisme de mimétisme apoptotique déjà observé et décrit pour d'autres virus. Cependant, il reste encore à déterminer qui de la PS ou de la glycoprotéine de l'enveloppe virale intervient dans le processus d'entrée de LASV via le récepteur alternatif Axl. Les mécanismes moléculaires à la base de l'interaction entre virus et cellule hôte sont d'intérêts particuliers pour répondre aux questions scientifiques de base ainsi que dans l'application de découvertes clés pour la recherche translationnelle. La compréhension de la signalisation induite par les pathogènes ainsi que son lien à l'invasion de la cellule hôte est d'une importance considérable pour le développement de drogues pour l'intervention thérapeutique contre les virus hautement pathogènes comme LASV.