Lenguas y genes: aplicaciones a la prehistoria de la lengua vasca

Homenaje a Ignacio Barandiarán Maestu / coord. por Javier Fernández Eraso, Juan Santos Yanguas.

Estudo fenotípico e molecular de resistência aos antimicrobianos em amostras clínicas e ambientais de enterobactérias

Buscamos detectar evidências da presença de genes envolvidos na produção de Enzimas Modificadoras de Aminoglicosídeos (EMAs), Beta-lactamases de espectro estendido (ESBLs) e Mecanismos Plasmidiais de Resistência a Quinolonas (PMQRs) em cepas de K. pneumoniae, K. ozaenae e E. coli isoladas de amostras de água de rios afluentes da Baía de Guanabara e de materiais clínicos de origem hospitalar, além de avaliar o "status sanitário" dos corpos aquáticos abordados no tocante à contaminação fecal recente e indicações de contaminação hospitalar e por outros ambientes de alta seletividade. As cepas de materiais clínicos foram selecionadas entre Maio e Julho de 2010, a partir da semeadura em meio de cultura contendo 8g/mL de gentamicina. As amostras de água foram coletadas em Abril e em Julho de 2009. Realizamos testes de colimetria, empregando para tal, a metodologia convencional e outra, na qual adicionamos 32g/mL de cefalotina e 8g/mL de gentamicina aos caldos Lactosado e Escherichia coli (caldo EC), a fim de detectar e quantificar coliformes resistentes. Para o isolamento das cepas empregamos meios de cultura contendo 32g/mL de cefalotina e 8g/mL de gentamicina. As cepas foram identificadas e submetidas a testes de susceptibilidade aos antimicrobianos (TSA), testes presuntivos para presença de ESBLs, extração de DNA plasmidial e ensaios de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) para a detecção dos genes. A utilização de agentes antimicrobianos nos testes de colimetria nos permitiu detectar a presença e quantificar coliformes totais e fecais resistentes nas amostras de água analisadas nos diferentes pontos. O TSA das cepas isoladas de amostras de água exibiu perfis de multirresistência, compatíveis com o de bactérias de origem hospitalar, semelhante ao encontrado nas cepas isoladas de materiais clínicos. Todas as cepas isoladas de amostras de água e 90% das cepas de materiais clínicos apresentaram pelo menos uma banda plasmidial. Os ensaios de PCR evidenciaram a presença de produtos de amplificação para EMAs, ESBLs e PMQRs, sendo que 7,4% das cepas de amostras de água e 20% das cepas de materiais clínicos apresentaram produtos de amplificação para as três classes de antimicrobianos. A realização de testes de colimetria empregando antimicrobianos, como gentamicina e cefalotina, pode ser uma ferramenta adicional importante ao teste convencional, quando o interesse for, o monitoramento e a prevenção de contaminação ambiental, especialmente associada a microrganismos carreando genes de resistência. O uso criterioso de antimicrobianos em atividades de cunho hospitalar e veterinário e medidas no sentido de prevenção de lançamento de esgoto e/ou tratamento dos efluentes, são fundamentais para o controle da disseminação de elementos genéticos de resistência transferíveis entre os microrganismos. A detecção e identificação de microrganismos apresentando elementos de resistência em ambiente extra-hospitalar como em água e solo, em particular, o emprego de testes de colimetria empregando antimicrobianos, se faz necessária, como forma de prevenção e controle de disseminação destes microrganismos com potencial de causar infecções em humanos e outros animais que eventualmente entram em contato com estes ambientes.

Distribuição e conservação dos genes que codificam as proteínas VgrG e Hcp em espécies de Aeromonas

Aeromonas spp. são bastonetes Gram negativos amplamente distribuídos nos ambientes aquáticos, com relatos de isolamento em água de abastecimento público e alimentos. Este micro-organismo possui potencial de causar doenças intestinais e extraintestinais cuja patogenicidade está associada a sua virulência multifatorial. Diversos determinantes de virulência de Aeromonas já foram identificados, incluindo sistemas de secreção de proteínas. O sistema de secreção tipo VI (SST6) é o mais recente sistema de secreção de proteínas identificado em bactérias cuja presença em estirpes no gênero Aeromonas pode implicar atividades de citotoxicidade para o hospedeiro, pois esse sistema é capaz de injetar moléculas efetoras dentro da célula, interferindo diretamente nos processos celulares. A fim de determinar a presença e analisar a distribuição dos genes hcp e vgrG codificadores das proteínas efetoras do SST6 em Aeromonas spp. o presente estudo examinou 119 cepas isoladas de diversas origens pela técnica da PCR após o desenho de oligonucleotídeos iniciadores específicos. Objetivamos ainda analisar a variabilidade genética interespecífica dos genes hcp e vgrG a partir de dados de sequenciamento. Os resultados obtidos indicaram a distribuição dos genes vgrG e hcp em 46% das cepas de Aeromonas hydrophila e Aeromonas caviae de diferentes origens. Entre as cepas de A. hydrophila a maior frequência foi observada nas cepas isoladas de humanos, onde todas foram positivas para os iniciadores que amplificaram um produto de 541 pb do gene vgrG e 418 pb do gene hcp. Entre as cepas de A. caviae, a incidência de genes vgrG e hcp foi mais elevada nas cepas isoladas de alface (60%) e peixes (50%). As cepas analisadas de origem ambiental apresentaram índice total de 36% de positividade, apresentando frequência de 60% e 22% em A. hydrophila e A. caviae, respectivamente. Os dados obtidos da análise de cepas de origem alimentar mostraram a presença dos genes vgrG e hcp em 67% (A. hydrophila) e 60% (A. caviae) das cepas isoladas de folhas de alface. Nas cepas isoladas de queijo os genes foram encontrados em 67% e 12,5% das cepas de A. hydrophila e de A. caviae, respectivamente. O alinhamento múltiplo entre as sequências dos segmentos dos genes hcp e vgrG obtidas no sequenciamento indicou grau de identidade nucleotídica de 75 a 100% entre as sequências de hcp e 80 a 100% entre as sequências de vgrG. Em conclusão, nossos resultados indicaram que os iniciadores desenhados foram capazes de detectar suas sequências alvo em cepas de A. caviae e outras espécies de Aeromonas, sugerindo a existência de homologia entre os genes nas diferentes espécies, confirmada após sequenciamento de DNA. Os dados indicaram que esses genes estão distribuídos em várias espécies de Aeromonas e em cepas isoladas de diversas fontes. Ressaltamos a prevalência de cepas de A. hydrophila PCR-positivas em isolados clínicos, sugerindo a participação do SST6 no complexo universo da virulência multifatorial que permeia esse micro-organismo

Alterações em genes relacionados à via glicolítica em tumores de carcinoma epidermoide de esôfago

O carcinoma epidermoide de esôfago (CEE) representa 90% dos casos de câncer de esôfago no Brasil. O CEE tem detecção tardia, um comportamento extremamente agressivo e baixa sobrevida, sendo, portanto, um alvo interessante para o estudo dos mecanismos envolvidos em sua carcinogênese, a fim de se identificar possíveis alvos terapêuticos ou marcadores moleculares que ajudem na prática clínica. Mudanças no metabolismo energético da célula tumoral parecem ter papel de destaque na transformação maligna. Sabe-se que células tumorais consomem glicose avidamente produzindo ácido lático, mesmo em condições de normóxia. Dentre os fatores que podem contribuir para o estímulo da glicólise em células tumorais destacam-se as alterações em enzimas da via glicolítica tais como: as piruvato-cinases M1 e M2 (PKM1 e PKM2), a hexocinase II (HKII), isofoma 1 do transportador de glicose, GLUT-1, e o fator de transcrição induzido por hipóxia (HIF1α), responsável pela transcrição das proteínas citadas. O objetivo do estudo é avaliar a relação entre a expressão de HIF1α, HK2, PKM2, PKM1 e GLUT-1 e dados clínico-patológicos no CEE. Para tal, foram avaliados tumores conservados em parafina de 44 pacientes com CEE matriculados no INCA e no Hospital das Clínicas de Porto Alegre. Além disso, foram coletadas amostras de biópsia de esôfago em 67 pacientes sem doença esofágica, que foram submetidos à endoscopia no Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE). A expressão das proteínas foi avaliada nos tecidos por imuno-histoquímica, enquanto que a expressão do mRNA de GLUT-1 também foi avaliada nas amostras controle. Foi observado que as amostras controle expressam HK2, PKM1, PKM2, HIF1α nas camadas do epitélio esofágico. Já GLUT-1 e Ki-67 são vistos apenas na camada basal. Além disso, a expressão do mRNA de GLUT-1 não teve correlação com fatores etiológicos da doença. Em CEE a expressão de HK2, PKM2 e GLUT-1 foi vista em todos os tumores, já a expressão de HIF1α e PKM1 foi variável. Além disso, observou-se que maior expressão de HIF-1α apresenta correlação com invasão linfonodal e diferenciação, enquanto que a expressão de HK2 tem relação com sobrevida e PKM1 com diferenciação. As correlações clínicas encontradas sugerem que alterações no metabolismo energético é um alvo de estudo interessante para desenvolvimento de marcadores moleculares que auxiliem a prática clínica.

Perfil genético de Enteroccocus faecalis isolados de infecção endodôntica primária no Brasil comparados a isolados orais e não-orais do Reino Unido e do Japão

Enterococcus faecalis (E. faecalis), conhecidamente patógeno oportunista, tem sido frequentemente associado a infecções sistêmicas graves. É também encontrado na cavidade oral, com destaque em infecção endodôntica refratária. O objetivo deste estudo foi avaliar características moleculares de E. faecalis isolados de infecção endodôntica primária no Brasil e comparar com isolados orais e não orais de pacientes do Reino Unido e do Japão, assim como E. faecalis resistentes à vancomicina. O presente estudo também investigou o relacionamento entre E. faecalis de diferentes origens (oral e não oral) e de diferentes áreas geográficas para obter uma melhor compreensão do envolvimento dos diferentes reservatórios no surgimento e propagação de clones virulentos, aqueles que possuem genes que conferem infectividade e virulência, assim como resistência aos antibióticos. Para tal, foram estudados E. faecalis isolados em infecções endodônticas no Brasil (n = 20) e orais no Reino Unido (n = 10), e em infecções não orais no Japão (n = 9). Além disso, 20 E. faecalis isolados ambientais do Hospital Universitário de Gales (Cardiff, Reino Unido), classificados como Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE) também foram examinados. A Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos isolados do Brasil foi obtida pelo método de diluição em agar de acordo com as recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reação em cadeia da polimerase (inglês - PCR) foi a técnica empregada para detectar os genes de virulência e aqueles associados à resistência aos antibióticos, enquanto Reação de Amplificação Aleatória de DNA Polimórfico (inglês - RAPD-PCR) foi escolhida para a tipagem molecular. Dentre os genes de virulência examinados, o gene que codifica a gelatinase gelE foi o mais prevalente entre os isolados (77-100%). Entre isolados orais, foram detectados os genes agg de substâncias de agregação, esp de proteína de evasão imune, cylB de citolisina, genes de resistência à tetraciclina tetM e tetL e à eritromicina ermB com diferentes prevalências. Os isolados clínicos hospitalares do Japão apresentaram perfil genético similar aos isolados orais, mas com maior prevalência de ermB e cylB. Todas as amostras de VRE foram positivas para os genes gelE, esp, agg, vanA, ermB e tetM, 95% foram positivos para cylB e 17% positivo para tetL. Todas as amostras foram negativas para ermA, asa373, vanB, vanC1 e vanC2/3. RAPD-PCR revelou agrupamento de VRE em comparação com outros isolados. Neste estudo, os isolados de E. faecalis de infecções orais apresentaram genes de resistência à tetraciclina, um antimicrobiano frequentemente usado no tratamento local de infecções dentárias, abrindo um debate muito importante sobre o papel e a eficácia desta droga para infecções orais. Claramente, são necessários mais estudos nesta área principalmente em relação à expressão de fatores de virulência entre isolados endodônticos para melhor nortear as estratégias de tratamento. As pressões externas no microambiente dos canais radiculares podem ser responsáveis pela seleção de espécies mais resistentes e virulentas. Por fim, embora isolados orais apresentem genes de virulência fundamentais para a patogenicidade, estes foram detectados em menor incidência em comparação com os isolados não-orais e VRE.

Análisis bioinformático de los genes de lacasas YfiH en clones virulentos de Acinetobacter baumannii

[ES] Acinetobacter baumannii es una bacteria Gram negativa, patógena y multirresistente. Su alta capacidad de supervivencia en hospitales y su resistencia a químicos puede deberse a la producción de lacasas. Estas enzimas son capaces de oxidar un sinfín de compuestos como los fenoles utilizados en hospitales para la desinfección de superficies. En este estudio se ha realizado un análisis de actividad lacasa en aislamientos altamente virulentos de los clones internaciones I y II, observando que estas cepas presentan actividad lacasa. Paralelamente, se ha realizado un análisis bioinformático con el que se ha determinado la similitud de los genes de estas lacasas con las ya descritas de la familia “YfiH” y con otras enzimas procedentes de otras especies, demostrando su similitud de secuencia con la lacasa RL5, procedente de una muestra de rumen bovino. Estos hechos suponen un avance en el estudio de lacasas bacterianas en Acinetobacter baumannii cuya caracterización podría desembocar en nuevas líneas de lucha contra dicho patógeno.

Gen LPP : Avances en el conocimiento de uno de los genes candidato de la enfermedad celíaca

[ES] La enfermedad celíaca (EC) es una enteropatía autoinmune de predisposición genética, producida por la ingestión en la dieta de péptidos derivados de cereales como el trigo o la cebada. Aunque se creía que afectaba casi de forma exclusiva a los individuos europeos (1%), actualmente se conocen casos en todo el mundo. El modelo patogénico se centra en los mecanismos de la inmunidad adaptativa dependientes de la estimulación de linfocitos T CD4+ reactivos, pero existe además un efecto tóxico directo del gluten sobre el epitelio intestinal, dependiente de la inmunidad innata. La participación de la Genética en la susceptibilidad a la enfermedad es conocida desde hace tiempo, siendo el locus HLA el que explica aproximadamente el 40% del componente genético de la enfermedad. Para tratar de identificar otros genes con susceptibilidad, se han venido realizando múltiples esfuerzos durante los últimos años. Uno de los últimos, llevado a cabo en 2011, fue el Proyecto Immunochip. En él, se analizaron más de 200.000 variantes y se descubrieron 13 nuevos loci de riesgo para la EC, que junto con los descubiertos en anteriores trabajos y el locus HLA, daban un total de 40 loci de riesgo. Entre ellos, se encontraba la región que ocupa el gen LPP . Localizado en el cromosoma 3, un estudio reciente lo vincula con los procesos de adhesión celular en el intestino. En el presente trabajo, se ha estudiado el efecto de la gliadina sobre la expresión del gen de interés (LPP ) y el posible efecto de un silenciamiento del mismo sobre dos genes relacionados con las uniones celulares (ACTB y TJP1). En el caso de la gliadina, no se halló un cambio significativo en la expresión del gen. Mientras, los resultados del efecto del silenciamiento fueron dispares, no siendo concluyentes para el gen ACTB, pero encontrando una posible asociación entre los genes LPP y TJP1.

Genetic Variants in MiRNA Processing Genes and Pre-MiRNAs Are Associated with the Risk of Chronic Lymphocytic Leukemia

Genome wide association studies (GWAS) have identified several low-penetrance susceptibility alleles in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Nevertheless, these studies scarcely study regions that are implicated in non-coding molecules such as microRNAs (miRNAs). Abnormalities in miRNAs, as altered expression patterns and mutations, have been described in CLL, suggesting their implication in the development of the disease. Genetic variations in miRNAs can affect levels of miRNA expression if present in pre-miRNAs and in miRNA biogenesis genes or alter miRNA function if present in both target mRNA and miRNA sequences. Therefore, the present study aimed to evaluate whether polymorphisms in pre-miRNAs, and/or miRNA processing genes contribute to predisposition for CLL. A total of 91 SNPs in 107 CLL patients and 350 cancer-free controls were successfully analyzed using TaqMan Open Array technology. We found nine statistically significant associations with CLL risk after FDR correction, seven in miRNA processing genes (rs3805500 and rs6877842 in DROSHA, rs1057035 in DICER1, rs17676986 in SND1, rs9611280 in TNRC6B, rs784567 in TRBP and rs11866002 in CNOT1) and two in pre-miRNAs (rs11614913 in miR196a2 and rs2114358 in miR1206). These findings suggest that polymorphisms in genes involved in miRNAs biogenesis pathway as well as in pre-miRNAs contribute to the risk of CLL. Large-scale studies are needed to validate the current findings.

Eficácia de um protocolo de higiene bucal com utilização de solução de clorexidina a 0,12% na prevenção de pneumonias associadas à ventilação mecânica (PAVM) e os efeitos sobre a microbiota da mucosa bucal de pacientes internados em unidades de terapia intensiva

A presente investigação teve como objetivo avaliar a prática de cirurgiões dentistas em uma unidade de terapia intensiva (UTI) de um hospital militar, o estabelecimento de um protocolo de higiene oral e os seus efeitos sobre a redução de pneumonias associadas à ventilação mecânica (PAVM). As percepções da equipe da UTI sobre as atividades dos cirurgiões dentistas também foram avaliadas por meio de um questionário. O perfil de colonização microbiana da mucosa oral antes e depois do estabelecimento das medidas de higiene oral também foi avaliado tanto por diluição e plaqueamento em meios de cultura microbiológicos seletivos e enriquecidos e através da amplificação pelo método de PCR e eletroforese em gel desnaturante em gradiente (DGGE), subsequente ao sequenciamento dos amplicons. A carga microbiana foi avaliada após a contagem de placas de agar e através da amplificação por PCR em tempo real (qPCR) do gene rrs nas amostras. O protocolo de higiene oral, realizado pelos cirurgiões dentistas, foi capaz de reduzir a incidência de PAVM (p <0,05). O questionário revelou que a modificação da halitose foi percebida por 93,33% dos participantes. A redução da ocorrência das úlceras orais e dos lábios durante a internação dos pacientes foi observada por 80% da equipe da UTI. Foi observada a redução da produção das secreções nasais e bucais por 70% da equipe dos profissionais da UTI. Para 86,66% dos participantes a assistência aos pacientes tornou-se mais agradável após a instituição dos cuidados bucais. O protocolo, realizado com a utilização de solução 0,12% de clorexidina, não foi capaz de evitar a colonização da mucosa oral por patógenos microbianos usualmente encontrados no ambiente hospitalar tais como os bastonetes Gram-negativos entéricos e não fermentadores, nem foi capaz de eliminá-los quando tais micro-organismos já se encontravam presentes antes dos procedimentos de higiene bucal. Alguns Bastonetes Gram-positivos (Lactobacillus sp e corinebactérias) e Staphylococcus epidermidis permaneceram após a realização dos procedimentos. O protocolo de higiene oral permitiu a redução da carga microbiana na mucosa oral de 50% dos pacientes considerando-se o método de contagem microbiana e para 35% dos pacientes pela avaliação dos números de cópias de genes rrs através de qPCR. Em conclusão, o protocolo de higiene oral desenvolvido pelos cirurgiões dentistas foi capaz de reduzir a incidência de PAV na UTI, embora não tenha sido capaz de prevenir a colonização da mucosa oral por supostos patógenos microbianos. O protocolo de higiene oral com a participação ativa dos cirurgiões dentistas foi bem aceito pelos profissionais da UTI e foi capaz de melhorar a qualidade da assistência aos pacientes críticos.