Encontros nas práticas de saúde: um outro ponto de vista

prestados às mulheres em situação de aborto, em um hospital público, vale pontuar, que no processo de amadurecimento da pesquisa, durante o trabalho de campo, optamos em incluir, mulheres em suspeita de aborto e demais observações das práticas dos referidos profissionais. A discussão do aborto é polêmica, difícil e está em pauta em distintos cenários, sendo esta discussão reflexo do debate presente na sociedade e assim, considerando que mulheres em situação de aborto, necessitam serem atendidas nos serviços de saúde com respeito e responsabilidade por todos os profissionais, a postura do profissional de saúde no atendimento prestado é fundamental, logo, este estudo buscou analisar as práticas dos profissionais nestes atendimentos. A metodologia adotada foi da observação participante, onde o setor escolhido foi a emergência da unidade, chamada de admissão, que é a porta de entrada, um setor de grande rotatividade, tanto de profissionais, como de pessoas a serem atendidas. Buscou-se desvendar a partir dos encontros que acontecem na admissão, as normas, rotinas e o perfil dos atendimentos prestados às mulheres em situação de aborto. O estudo apontou para processos vividos no cotidiano das práticas, que expomos através das secções: É charminho?; Invisibilidade Ninguém percebe; Não Julgar, é?; Silenciamento; Sabe que é errado...; Diálogo entre os sentados; Como garantir o atendimento? - O lado artístico da população Eles vão ter que resolver isso... e A evocação do direito; Pares?; Ser bom? Você viu quantos papéis temos que preencher? Identificou questões de tensionamento sobre o não dito, algo que encontra-se naturalizado no cotidiano das práticas. Um diagnóstico da situação de invisibilidade do outro e de suas questões, bem como de silenciamento dos profissionais de saúde. Somente foi possível o encontro com esta percepção, através do estranhamento daquilo que nos era familiar, sendo esta vivência um espaço de tensionamento de posturas tomadas por nós profissionais no cotidiano das práticas.

Gen LPP : Avances en el conocimiento de uno de los genes candidato de la enfermedad celíaca

[ES] La enfermedad celíaca (EC) es una enteropatía autoinmune de predisposición genética, producida por la ingestión en la dieta de péptidos derivados de cereales como el trigo o la cebada. Aunque se creía que afectaba casi de forma exclusiva a los individuos europeos (1%), actualmente se conocen casos en todo el mundo. El modelo patogénico se centra en los mecanismos de la inmunidad adaptativa dependientes de la estimulación de linfocitos T CD4+ reactivos, pero existe además un efecto tóxico directo del gluten sobre el epitelio intestinal, dependiente de la inmunidad innata. La participación de la Genética en la susceptibilidad a la enfermedad es conocida desde hace tiempo, siendo el locus HLA el que explica aproximadamente el 40% del componente genético de la enfermedad. Para tratar de identificar otros genes con susceptibilidad, se han venido realizando múltiples esfuerzos durante los últimos años. Uno de los últimos, llevado a cabo en 2011, fue el Proyecto Immunochip. En él, se analizaron más de 200.000 variantes y se descubrieron 13 nuevos loci de riesgo para la EC, que junto con los descubiertos en anteriores trabajos y el locus HLA, daban un total de 40 loci de riesgo. Entre ellos, se encontraba la región que ocupa el gen LPP . Localizado en el cromosoma 3, un estudio reciente lo vincula con los procesos de adhesión celular en el intestino. En el presente trabajo, se ha estudiado el efecto de la gliadina sobre la expresión del gen de interés (LPP ) y el posible efecto de un silenciamiento del mismo sobre dos genes relacionados con las uniones celulares (ACTB y TJP1). En el caso de la gliadina, no se halló un cambio significativo en la expresión del gen. Mientras, los resultados del efecto del silenciamiento fueron dispares, no siendo concluyentes para el gen ACTB, pero encontrando una posible asociación entre los genes LPP y TJP1.

Efeito da p53 sobre a expressão e atividade da enzima de reparo de DNA Timina-DNA Glicosilase

O câncer de esôfago é uma malignidade altamente freqüente e letal. Uma característica específica das áreas de alta incidência de câncer de esôfago é a grande proporção de duplas mutações no gene TP53, sendo, ao menos uma delas, uma transição G para A em sítios CpG. Essas transições resultam de malpareamentos GT causados pela desaminação espontânea da 5-metilcitosina em ilhotas CpG. A enzima de reparo de DNA Timina-DNA Glicosilase (TDG) é responsável pelo primeiro passo na remoção da timina de malpareamentos GT em CpG. A alta proporção de mutações em sítios CpG em câncer de esôfago das áreas de alta incidência sugere que a via de reparo de DNA iniciada pela TDG pode estar prejudicada. A presença de duplas mutações, sendo ao menos uma delas em CpG, levantou a hipótese de que a primeira mutação no TP53 reduz a atividade da via de reparo iniciada pela TDG, que acarretaria a segunda mutação em sítios CpG. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi analisar o efeito da p53 sobre a expressão e atividade da TDG. Os resultados obtidos mostram que a expressão de TDG é regulada transcricionalmente pela p53 numa gama de linhagens celulares e é induzida pelo dano ao DNA, de forma p53-dependente. Além disto, os resultados apontam um possível papel da proteína p53 ativa na migração nuclear e atividade da TDG. Estes resultados ainda nos levam à conclusão de que o silenciamento de TDG aumenta a sensibilidade à morte celular induzida por MMS quando a p53 é encontrada na forma selvagem, mas não quando esta proteína é mutada, e de que o status mutacional de TP53 parece afetar a expressão de TDG em CEE primários. Juntos esses resultados sugerem que a p53 regula o reparo de DNA mediado pela TDG e que a inativação de p53 em células tumorais pode contribuir para a aquisição de um mutator phenotype.

Estudo da adesão, sobrevivência e tubulogênese endotelial em modelo de células de glioma silenciadas para a expressão de Tenascina-C

Recentemente, nosso grupo demonstrou que a matriz extracelular de astrocitomas promove a seleçãode células endoteliais altamente proliferativas, porém com reduzida capacidade tubulogênica, além de determinar a morte de uma segunda sub-população endotelial, por desaderência ou anoikis. Estratégias de simulação dos teores de tenascina-C (TN-C) e fibronectina (FN) nas matrizes de astrocitomas, realizados com ambas as proteínas purificadas na forma de substratos definidos, sugeriram que o balanço TN-C:FN estava relacionado com os fenótipos endoteliais observados. No entanto, este procedimento não permitia abordar a participação de outros componentes da matriz tumoral nativa neste processo. Com objetivo de estudar a modulação do fenótipo angiogênico das células endoteliais por matrizes de astrocitoma, realizamos o silenciamento da expressão de TN-C na linhagem de astrocitoma U-373 MG. O silenciamento foi confirmado por western blotting, PCR em tempo real e ELISA, que permitiram concluir que, no período pós-transfecção (120h) necessário para se obter matrizes tumorais nativas para ensaios funcionais com células endoteliais, as células U-373 MG mantiveram-se silenciadas em índices superiores a 90%. A diminuição de TN-C nas matrizes tumorais resultou em um pequeno (≅18%, em média), porém significativo aumento na taxa de adesão endotelial. HUVECs incubadas com a matriz secretadas por células silenciadas apresentaram uma redução de ≅35% do número de núcleos picnóticos, quando comparadas a HUVECs incubadas com a matriz de células U-373 MG (selvagens ou transfectadas com siRNA controle). O silenciamento da expressão da TN-C na matriz nas células U-373 MG restaurou ainda o defeito tubulogênico das células endoteliais, que passaram a apresentar formação de tubos comparável à obtida quando HUVECs foram incubadas com sua matriz autóloga, rica em FN. Tais resultados apoiam observações anteriores do grupo, que já sugeriam que a maior proporção de FN na matriz autóloga, comparada a matriz do astrocitoma, seria o fator principal para a seleção dos fenótipos angiogênicos observados, demonstrando mais uma vez a importância do balanço FN:TN-C na regulação de processos angiogênicos. Dados anteriores sugeriam ainda que a sub-população endotelial que morre por anoikisapós contato prolongado (24 horas) com matrizes de astrocitomas corresponde a células que já haviam entrado na fase S do ciclo celular, no início da incubação. A fim de nos aprofundarmos sobre a participação do ciclo celular neste processo, a expressão da proteína p27, um inibidor de quinases dependentes de ciclinas (CKI), também foi analisada. HUVECs incubadas com a matriz de astrocitoma apresentaram um aumento de 2 a 3 vezes na expressão de p27, quando comparada com HUVECs provenientes de sua matriz autóloga. No entanto, células endoteliais incubadas com matriz secretada por células U-373 MG silenciadas apresentaram um nível de expressão de p27 comparável ao das HUVECs incubadas com matriz secretada por células selvagens, indicando que a expressão de TN-C não modula, ou não está diretamente correlacionada à expressão da proteína p27. Este resultado sugere que outros componentes da matriz tumoral devam estar envolvidos na modulação do ciclo celular endotelial.

Religiosidade na escola: afirmações e silenciamentos

Com base no debate sobre diferença, o estudo analisa o modo como a questão da religiosidade é significada e tratada nas práticas escolares. Abordando religião como processo de construção cultural, vale dizer, de significação discursiva que se desenvolve no âmbito de relações de poder, o estudo busca compreender os espaços que diferentes manifestações religiosas ocupam no ambiente escolar; como as disputas hegemônicas por significação acontecem e quais são as práticas de afirmação e silenciamento das diferenças religiosas na escola. A pesquisa traz a contribuição de Stuart Hall para a compreensão de cultura numa dimensão intercultural para além dos binarismos fixos estruturalistas. Analisa os processos de negociação da diferença a partir da abordagem de Chantal Mouffe sobre constituição do social; consenso conflituoso e democracia agonística, o que possibilita descolar as identidades da rigidez suposta ou imposta pela polaridade nós-outros construída no pensamento universalista. Uma importante referência, ainda, advém da conceituação nomeada de inculturação das religiões de Joanildo Burity. Dessa forma, procura refletir sobre processos educacionais orientados pela perspectiva pedagógica proposta por Aura Helena Ramos, segundo a qual a Educação em Direitos Humanos tem como referência a constituição de espaços de manifestação do dissenso, de negociação da diferença e de produção curricular, o que indica uma abordagem que se contrapõe a processos de silenciosamente de códigos culturais da hegemonia religiosa cristã ocidental.

A obrigatoriedade da educação infantil: governamentalidade e refinamento das técnicas de governo

O presente trabalho coloca em análise a obrigatoriedade da educação infantil no Brasil com foco na institucionalização da criança desde a tenra idade, buscando correlacionar infância, educação, governamentalidade e o refinamento das técnicas de governo. Entendemos a infância não como fato natural, mas como acontecimento sócio e culturalmente produzido, organizado por regulações potentes que instituem maneiras de cuidar e educar a criança seja na família ou nos demais espaços, como a escola. De certo, as ações da educação infantil permanecem promovendo processos de subjetivação, seja ao determinar, enquadrar e controlar os comportamentos das crianças por meio de técnicas de dominação seja ao estimulá-las para que operem de acordo com os padrões estabelecidos, formando condutas resilientes, imobilizando-as em papéis, silenciando-as. Deste modo, imergirmos nas práticas que caminham pela vertente da institucionalização de crianças, a partir dos estudos de Michel Foucault, estabelecendo relações entre os campos de saber, tipos de normatividade e formas de subjetividade na educação infantil. Elegemos a análise genealógica proposta por Foucault e a análise institucional de acordo com Lourau, como metodologias para a compreensão dos processos em curso, tensionando as práticas diárias, dando visibilidade a diferentes formas do fazer cotidiano e percebendo as resistências como potência. Entendemos como desafio a criação de espaços de discussão, que não sejam construídos pelo sujeito da falta, mas que possam perceber como potência o que é visto como ausência no outro. Necessitamos desta forma, estabelecer regiões limítrofes de existência única, de experiência vivida, existência anárquica de qualquer criança e não só de espaços de capturas, ordenações e silenciamentos. Assim, linhas de fuga como proposto por Deleuze e Guattari insurgirão como possibilidade, tendo como horizonte uma vida não fascista, como convida Foucault, para os fazeres e saberes de e na educação infantil.

烟草NtFAD2基因的沉默及功能研究

油酰磷脂酰胆碱去饱和酶（FAD2）是一种重要的植物脂肪酸去饱和酶，位于内质网中，催化油酸生成亚油酸。亚油酸等多不饱和脂肪酸含量过高的植物油脂不稳定，易氧化，不易贮藏，而且氧化产物对人体有害。因此油脂改良的一个重要目的是提高种子油脂的油酸含量，降低多不饱和脂肪酸含量。另外，关于FAD2的结构、功能和表达调控等问题目前还不清楚，有待深入研究。近年发展起来的RNAi技术可有效地沉默目标基因，研究植物FAD2基因沉默后膜脂和油脂的变化及温度对基因沉默的影响，有助于深入理解FAD2酶的功能、表达调控方式和有效地利用基因沉默技术改变膜脂组成、提高植物油脂品质。本研究的主要目的是，首先采用RNAi技术抑制烟草FAD2基因（NtFAD2）的表达以降低NtFAD2酶活性，得到膜脂不饱和度改变的烟草转基因株系。然后研究NtFAD2基因沉默后脂肪酸去饱和过程的变化及其机理，以及温度对NtFAD2基因沉默的影响。研究中首先用PCR方法克隆烟草NtFAD2基因，用其编码区的一个片段构建表达发卡RNA的沉默结构，用农杆菌介导的方法转化烟草，从第一代转基因植株中筛选出油酸含量高的突变体。然后对其中一个转基因株系S61进行脂肪酸分析，发现叶片总脂和质体外单脂PC和PE中的油酸含量大幅度增加。此外，NtFAD2基因沉默对叶片甘油脂的影响有多效性，即质体内的单脂油酸含量也有显著增加，有些单脂中软脂酸含量有所下降。烟草NtFAD2基因沉默后，在叶片和种子中油酸含量变化最大，说明NtFAD2基因在不同器官中的沉默效果不同：沉默结构对NtFAD2酶活性较高的器官抑制程度更大，内源基因没有表现均一的沉默效果。沉默植株的多种组织中NtFAD2基因的mRNA降解程度相似，说明油酸含量与NtFAD2转录本的丰度没有直接关系。 植物脂肪酸的不饱和程度受温度调控，因此研究FAD2基因沉默株系的油酸含量受温度影响情况及其调控规律对RNAi技术在油脂改良方面的实际应用具有十分重要的意义。研究结果表明，随着生长温度的下降，野生烟草叶片膜脂油酸含量降低，多不饱和脂肪酸含量随之增加;转基因烟草中油酸和多不饱和脂肪酸有相似的变化趋势，但是变化幅度远远大于野生烟草。低温下转基因烟草叶片油酸含量之所以大幅度下降，其中一个重要原因是被抑制的NtFAD2酶受低温的调节而活性升高。然而研究发现，与常温条件下相比，低温下转基因烟草NtFAD2基因的mRNA丰度不变，说明低温没有影响沉默结构对NtFAD2基因的mRNA的降解。低温环境下NtFAD2基因沉默植株的多不饱和脂肪酸含量有所回升可能是植物对低温的一种适应性响应。转基因烟草种子油脂的油酸含量也受温度影响：常温下表现高油酸性状，低温下油酸含量下降。因此种植这种高油酸品系时，需要考虑温度的影响。如果在适宜的地域和季节种植，避免转基因植株开花结实时遭遇持续低温，就可以利用转基因植株的遗传优势，生产富含油酸的优质植物油。

二脂酰甘油酰基转移酶基因(DGAT1)的沉默对烟草油脂合成的影响

二脂酰甘油酰基转移酶 (DGAT; EC 2.3.1.20) 是催化三脂酰甘油（TAG）合成的最后也是最关键步骤的酶。TAG是真核细胞中最重要的能量存储形式。在植物中，TAG主要在种子、花粉和许多物种的果实中积累。然而，DGAT1基因的转录本也存在于植物的其它器官中，这些器官包括根、茎、叶、花瓣、花粉囊、未成熟的角果、幼苗以及正在发芽的种子等。迄今为止，许多针对DGAT1基因的研究都集中于DGAT1基因的表达在对种子油脂的积累以及对种子中TAG的脂肪酸组成所起的作用上。在本研究中，我们通过构建烟草DGAT1基因带有内含子的发卡RNA（hpRNA）结构，使之在转基因烟草植株中表达双链RNA（dsRNA），利用RNAi原理达到使烟草内源DGAT1基因沉默的目的。转基因沉默烟草植株的获得将会为更好地研究DGAT1基因的功能奠定基础。本实验不仅研究分析了DGAT1基因的抑制对烟草种子油脂积累的影响，还对表现出沉默性状的转基因植株Sil7的不同器官中TAG的含量以及DGAT1的转录水平等进行了研究分析。此外，通过对转基因烟草不同株系种子中的主要贮藏物质——油脂、蛋白质和糖的含量测定，初步揭示出在烟草种子中三者生物合成代谢之间存在的相关性。主要研究结果如下： 采用烟草DGAT1基因的第615～1293碱基之间679bp的片段构建了能表达发卡RNA（hpRNA）结构的表达载体，并转化烟草（Nicotiana tabacum）Wisconsin 38。Northern杂交分析发现,与野生型对照烟草（WT）相比，在沉默植株的花和发育状态种子中DGAT1基因的转录水平有很大降低，这表明该发卡结构能够高效率地引起烟草DGAT1基因的沉默。此外，在对Sil1至Sil12共12株转基因烟草进行油脂含量分析的结果表明，其中有8株表现出油脂降低的性状，转基因沉默效率达到67％。这表明：利用RNAi的方法可对目标基因进行特异降解来研究基因的功能，因此是一个在研究基因的表达功能上十分有效的方法，而且已成为植物基因工程的有力工具。 为了研究DGAT1基因的沉默对转基因植株不同器官的影响，本实验分析了转基因植株Sil7的不同器官中TAG的含量和脂肪酸组成，并采用RT-PCR方法对野生型对照和转基因植株中DGAT1基因的转录水平进行了比较分析。研究发现，转基因植株不同器官中DGAT1基因转录水平的降低与各器官中TAG含量的减少呈正相关。由此看来，植物中DGAT1的表达水平与植物的各个器官内TAG的含量之间存在着一定的对应关系。此外，在转基因植株Sil7不同器官中依然能够产生TAG，这说明或者DGAT1酶活性丧失而由其它的酶（如DGAT2和PDAT）参与TAG的合成，或者DGAT1酶活性只是部分地受到影响。本实验还对Sil7的根、茎、叶、花瓣和种子中TAG的脂肪酸组成进行了分析，结果发现，与烟草野生型对照相比，在Sil7的这些器官中，除种子中TAG的脂肪酸组成无明显变化外，其余器官中TAG的18:3/18:2脂肪酸比例均有明显升高。 对其中8株转基因烟草种子进行油脂含量分析发现，在转基因烟草中由于DGAT1基因的沉默引起种子中TAG含量的减少，从而引起了种子平均千粒重的下降。而在TAG含量和种子平均千粒重下降的同时，种子中其它贮藏物质－蛋白质和糖类的含量却增加了。该实验结果表明：在烟草种子中TAG的生物合成与蛋白质和糖类物质的合成之间存在着负的相关性。

RNAi沉默光合膜磷脂合成酶基因的研究

磷脂是动物和植物非光合组织细胞膜系统的主要组成成分，在细胞生命过程中扮演着重要角色。尽管绿色植物光合膜的的甘油脂主要是糖脂，但是它仍然含有大约10％的磷脂，说明磷脂在光合膜的结构和功能中起重要作用。构成生物膜的磷脂有多种，但是，光合膜只含有磷脂酰甘油（PG）一种磷脂。光合膜中的PG有其特殊性，即：在PG的sn-2位上总连着一个棕榈酸（16:0）或者反式十六碳烯酸（16:1trans），说明了这种具有特殊结构的甘油脂在维持类囊体膜的结构和功能方面具有重要的作用。 叶绿体中有两个重要酶参与了PG的生物合成，它们分别是胞嘧啶二脂酰甘油合成酶（CDS）和磷脂酰甘油合成酶（PGS）。本实验以烟草和马铃薯为材料，利用RNAi技术，对CDS和PGS基因的表达进行抑制，通过PG缺失突变体，研究其功能。 对转含有PGS片段的沉默结构的转基因烟草叶片膜脂进行了分析，结果表明，与野生型烟草相比较，其PG含量下降了约20%，同时，SQDG和PC的含量增加。PG含量的降低没有引起MGDG和DGDG含量的变化。另外，我们还对转基因植株目的基因片段的RNA表达水平进行了RT-PCR分析，发现其表达量大幅度降低。这些结果表明，在转基因株系中，PGS基因的表达受到了抑制，说明我们获得了PG部分缺失的烟草PGS突变体。 对烟草PG缺失体的PG脂肪酸组成进行分析，表明其特征性脂肪酸反式十六碳烯酸含量明显下降，比野生型降低了44%，C18:0、C18:1和C18:2的相对含量增加，整个变化与总脂脂肪酸变化基本一致。 为了研究PG缺失对光合作用的影响，我们分析了多种光合指标。对叶绿素含量的分析表明，PG含量的降低影响了光合色素的组成。PG部分缺失的转基因烟草中的叶绿素总的含量下降，其中叶绿素b含量下降更为明显，结果，叶绿素a与叶绿素b的比值较野生型高。转基因植株净光合速率下降，二氧化碳利用率降低;PSII的最大光化学效率（Fv/Fm）和实际光化学效率（фPSII）降低，光化学猝灭下降，非光化学猝灭增加，尤其老叶的变化更为明显。这些结果说明了PG的部分缺失影响了植株的光合能力，捕光色素蛋白复合体的结构受到了影响，PSII功能遭受损伤。 同时，我们根据已经报道的马铃薯CDS基因，克隆了一个片段，构建沉默结构，并对沉默结构进行了转化。通过抗性基因的筛选以及RT-PCR检测，证明了沉默结构转化成功，目的基因的表达受到抑制，获得了马铃薯CDS转基因植株。 对马铃薯野生型和CDS转基因植株进行膜脂和脂肪酸分析表明，转基因植株叶片的PE、PG和PC等磷脂含量降低，SQDG和DGDG含量增加;C16:1（3t）、C16:2、C16:3、C18:1和C18:2含量下降，C16:0和C18:3含量增加，而C16:1和C18:0变化不明显。马铃薯CDS转基因植株的叶绿素荧光分析表明，PSII最大光化学效率降低，从野生型的0.82下降到0.77。

Xenopus RCOR2 (REST corepressor 2) interacts with ZMYND8, which is involved in neural differentiation

Regulation of neuronal gene expression is critical to nervous system development. REST (RE1-silencing transcription factor) regulates neuronal gene expression through interacting with a group of corepressor proteins including REST corepressors (RCOR). Here we show that Xenopus RCOR2 is predominantly expressed in the developing nervous system. Through a yeast two-hybrid screen, we isolated Xenopus ZMYND8 (Zinc finger and MYND domain containing 8) as an XRCOR2 interacting factor. XRCOR2 and XZMYND8 bind each other in co-immunoprecipitation assays and both of them can function as transcriptional repressors. XZMYND8 is co-expressed with XRCOR2 in the nervous system and overexpression of XZMYND8 inhibits neural differentiation in Xenopus embryos. These data reveal a RCOR2/ZMYND8 complex which might be involved in the regulation of neural differentiation. (C) 2010 Elsevier Inc. All rights reserved.

An ARGONAUTE4-containing nuclear processing center colocalized with Cajal bodies in Arabidopsis thaliana.

ARGONAUTE4 (AGO4) and RNA polymerase IV (Pol IV) are required for DNA methylation guided by 24 nucleotide small interfering RNAs (siRNAs) in Arabidopsis thaliana. Here we show that AGO4 localizes to nucleolus-associated bodies along with the Pol IV subunit NRPD1b; the small nuclear RNA (snRNA) binding protein SmD3; and two markers of Cajal bodies, trimethylguanosine-capped snRNAs and the U2 snRNA binding protein U2B''. AGO4 interacts with the C-terminal domain of NRPD1b, and AGO4 protein stability depends on upstream factors that synthesize siRNAs. AGO4 is also found, along with the DNA methyltransferase DRM2, throughout the nucleus at presumed DNA methylation target sites. Cajal bodies are conserved sites for the maturation of ribonucleoprotein complexes. Our results suggest a function for Cajal bodies as a center for the assembly of an AGO4/NRPD1b/siRNA complex, facilitating its function in RNA-directed gene silencing at target loci.

Genome-wide high-resolution mapping and functional analysis of DNA methylation in arabidopsis.

Cytosine methylation is important for transposon silencing and epigenetic regulation of endogenous genes, although the extent to which this DNA modification functions to regulate the genome is still unknown. Here we report the first comprehensive DNA methylation map of an entire genome, at 35 base pair resolution, using the flowering plant Arabidopsis thaliana as a model. We find that pericentromeric heterochromatin, repetitive sequences, and regions producing small interfering RNAs are heavily methylated. Unexpectedly, over one-third of expressed genes contain methylation within transcribed regions, whereas only approximately 5% of genes show methylation within promoter regions. Interestingly, genes methylated in transcribed regions are highly expressed and constitutively active, whereas promoter-methylated genes show a greater degree of tissue-specific expression. Whole-genome tiling-array transcriptional profiling of DNA methyltransferase null mutants identified hundreds of genes and intergenic noncoding RNAs with altered expression levels, many of which may be epigenetically controlled by DNA methylation.

Role of RNA polymerase IV in plant small RNA metabolism.

In addition to the three RNA polymerases (RNAP I-III) shared by all eukaryotic organisms, plant genomes encode a fourth RNAP (RNAP IV) that appears to be specialized in the production of siRNAs. Available data support a model in which dsRNAs are generated by RNAP IV and RNA-dependent RNAP 2 (RDR2) and processed by DICER (DCL) enzymes into 21- to 24-nt siRNAs, which are associated with different ARGONAUTE (AGO) proteins for transcriptional or posttranscriptional gene silencing. However, it is not yet clear what fraction of genomic siRNA production is RNAP IV-dependent, and to what extent these siRNAs are preferentially processed by certain DCL(s) or associated with specific AGOs for distinct downstream functions. To address these questions on a genome-wide scale, we sequenced approximately 335,000 siRNAs from wild-type and RNAP IV mutant Arabidopsis plants by using 454 technology. The results show that RNAP IV is required for the production of >90% of all siRNAs, which are faithfully produced from a discrete set of genomic loci. Comparisons of these siRNAs with those accumulated in rdr2 and dcl2 dcl3 dcl4 and those associated with AGO1 and AGO4 provide important information regarding the processing, channeling, and functions of plant siRNAs. We also describe a class of RNAP IV-independent siRNAs produced from endogenous single-stranded hairpin RNA precursors.

Epigenetic inheritance in plants.

The function of plant genomes depends on chromatin marks such as the methylation of DNA and the post-translational modification of histones. Techniques for studying model plants such as Arabidopsis thaliana have enabled researchers to begin to uncover the pathways that establish and maintain chromatin modifications, and genomic studies are allowing the mapping of modifications such as DNA methylation on a genome-wide scale. Small RNAs seem to be important in determining the distribution of chromatin modifications, and RNA might also underlie the complex epigenetic interactions that occur between homologous sequences. Plants use these epigenetic silencing mechanisms extensively to control development and parent-of-origin imprinted gene expression.

Tandem repeats upstream of the Arabidopsis endogene SDC recruit non-CG DNA methylation and initiate siRNA spreading.

Plants use siRNAs to target cytosine DNA methylation to both symmetrical CG and nonsymmetrical (CHG and CHH) sequence contexts. DNA methylation and siRNA clusters most frequently overlap with transposons in the Arabidopsis thaliana genome. However, a significant number of protein-coding genes also show promoter DNA methylation, and this can be used to silence their expression. Loss of the majority of non-CG DNA methylation in drm1 drm2 cmt3 triple mutants leads to developmental phenotypes. We identified the gene responsible for these phenotypes as SUPPRESSOR OF drm1 drm2 cmt3 (SDC), which encodes an F-box protein and possesses seven promoter tandem repeats. The SDC repeats show a unique silencing requirement for non-CG DNA methylation directed redundantly by histone methylation and siRNAs, and display spreading of siRNAs and methylation beyond the repeated region. In addition to revealing the complexity of DNA methylation control in A. thaliana, SDC has important implications for how plant genomes utilize gene silencing to repress endogenous genes.