Microhomology-mediated end joining is the principal mediator of double-strand break repair during mitochondrial DNA lesions

Mitochondrial DNA (mtDNA) deletions are associated with various mitochondrial disorders. The deletions identified in humans are flanked by short, directly repeated mitochondrial DNA sequences; however, the mechanism of such DNA rearrangements has yet to be elucidated. In contrast to nuclear DNA (nDNA), mtDNA is more exposed to oxidative damage, which may result in double-strand breaks (DSBs). Although DSB repair in nDNA is well studied, repair mechanisms in mitochondria are not characterized. In the present study, we investigate the mechanisms of DSB repair in mitochondria using in vitro and ex vivo assays. Whereas classical NHEJ (C-NHEJ) is undetectable, microhomology-mediated alternative NHEJ efficiently repairs DSBs in mitochondria. Of interest, robust microhomology-mediated end joining (MMEJ) was observed with DNA substrates bearing 5-, 8-, 10-, 13-, 16-, 19-, and 22-nt microhomology. Furthermore, MMEJ efficiency was enhanced with an increase in the length of homology. Western blotting, immunoprecipitation, and protein inhibition assays suggest the involvement of CtIP, FEN1, MRE11, and PARP1 in mitochondrial MMEJ. Knock-down studies, in conjunction with other experiments, demonstrated that DNA ligase III, but not ligase IV or ligase I, is primarily responsible for the final sealing of DSBs during mitochondrial MMEJ. These observations highlight the central role of MMEJ in maintenance of mammalian mitochondrial genome integrity and is likely relevant for deletions observed in many human mitochondrial disorders.

Trans-dichlorooxovandium (IV) complex as a novel photoinducible DNA interstrand crosslinker for cancer therapy

Although DNA interstrand crosslinking (ICL) agents such as mitomycin C, cisplatin and psoralen serve as potent anticancer drugs, these agents are known to have dose-limiting toxic effects on normal cells. Moreover, tumor resistance to these agents has been reported. Here, we show that trans-dichlorooxovanadium (IV) complex of pyrenyl terpyridine (VDC) is a novel photoinducible DNA crosslinking agent. By a combination of in vitro and ex vivo experiments including plasmid-based assays, we find that VDC forms monoadducts on the DNA and can be activated by UV-A and visible light to generate DNA interstrand crosslinks. VDC efficiently activates Fanconi anemia (FA) pathway of DNA interstrand crosslink repair. Strikingly, photoinduction of VDC induces prolonged activation of cell cycle checkpoint and a high degree of cell death in homologous recombination (HR)/ICL repair defective cells. Moreover, VDC specifically targets cells that express pathological RAD51C mutants. These data imply that VDC can be potentially used for cancer therapy and suggest that tumors arising in patients with gene mutations in FA and HR repair pathway can be specifically targeted by a photoactivatable VDC.

Design and synthesis of biofunctional magnetic/fluorescent glyco-nanoparticles and quantum dots and their application as specific molecular imaging probes

206 p.

Deep tissue fluorescence imaging with time-reversed light

Advances in optical techniques have enabled many breakthroughs in biology and medicine. However, light scattering by biological tissues remains a great obstacle, restricting the use of optical methods to thin ex vivo sections or superficial layers in vivo. In this thesis, we present two related methods that overcome the optical depth limit—digital time reversal of ultrasound encoded light (digital TRUE) and time reversal of variance-encoded light (TROVE). These two techniques share the same principle of using acousto-optic beacons for time reversal optical focusing within highly scattering media, like biological tissues. Ultrasound, unlike light, is not significantly scattered in soft biological tissues, allowing for ultrasound focusing. In addition, a fraction of the scattered optical wavefront that passes through the ultrasound focus gets frequency-shifted via the acousto-optic effect, essentially creating a virtual source of frequency-shifted light within the tissue. The scattered ultrasound-tagged wavefront can be selectively measured outside the tissue and time-reversed to converge at the location of the ultrasound focus, enabling optical focusing within deep tissues. In digital TRUE, we time reverse ultrasound-tagged light with an optoelectronic time reversal device (the digital optical phase conjugate mirror, DOPC). The use of the DOPC enables high optical gain, allowing for high intensity optical focusing and focal fluorescence imaging in thick tissues at a lateral resolution of 36 µm by 52 µm. The resolution of the TRUE approach is fundamentally limited to that of the wavelength of ultrasound. The ultrasound focus (~ tens of microns wide) usually contains hundreds to thousands of optical modes, such that the scattered wavefront measured is a linear combination of the contributions of all these optical modes. In TROVE, we make use of our ability to digitally record, analyze and manipulate the scattered wavefront to demix the contributions of these spatial modes using variance encoding. In essence, we encode each spatial mode inside the scattering sample with a unique variance, allowing us to computationally derive the time reversal wavefront that corresponds to a single optical mode. In doing so, we uncouple the system resolution from the size of the ultrasound focus, demonstrating optical focusing and imaging between highly diffusing samples at an unprecedented, speckle-scale lateral resolution of ~ 5 µm. Our methods open up the possibility of fully exploiting the prowess and versatility of biomedical optics in deep tissues.

Synthesis and biological activity of anticoagulant heparan sulfate glycopolymers

Heparin has been used as an anticoagulant drug for more than 70 years. The global distribution of contaminated heparin in 2007, which resulted in adverse clinical effects and over 100 deaths, emphasizes the necessity for safer alternatives to animal-sourced heparin. The structural complexity and heterogeneity of animal-sourced heparin not only impedes safe access to these biologically active molecules, but also hinders investigations on the significance of structural constituents at a molecular level. Efficient methods for preparing new synthetic heparins with targeted biological activity are necessary not only to ensure clinical safety, but to optimize derivative design to minimize potential side effects. Low molecular weight heparins have become a reliable alternative to heparin, due to their predictable dosages, long half-lives, and reduced side effects. However, heparin oligosaccharide synthesis is a challenging endeavor due to the necessity for complex protecting group manipulation and stereoselective glycosidic linkage chemistry, which often result in lengthy synthetic routes and low yields. Recently, chemoenzymatic syntheses have produced targeted ultralow molecular weight heparins with high-efficiency, but continue to be restricted by the substrate specificities of enzymes.

To address the need for access to homogeneous, complex glycosaminoglycan structures, we have synthesized novel heparan sulfate glycopolymers with well-defined carbohydrate structures and tunable chain length through ring-opening metathesis polymerization chemistry. These polymers recapitulate the key features of anticoagulant heparan sulfate by displaying the sulfation pattern responsible for heparin’s anticoagulant activity. The use of polymerization chemistry greatly simplifies the synthesis of complex glycosaminoglycan structures, providing a facile method to generate homogeneous macromolecules with tunable biological and chemical properties. Through the use of in vitro chromogenic substrate assays and ex vivo clotting assays, we found that the HS glycopolymers exhibited anticoagulant activity in a sulfation pattern and length-dependent manner. Compared to heparin standards, our short polymers did not display any activity. However, our longer polymers were able to incorporate in vitro and ex vivo characteristics of both low-molecular-weight heparin derivatives and heparin, displaying hybrid anticoagulant properties. These studies emphasize the significance of sulfation pattern specificity in specific carbohydrate-protein interactions, and demonstrate the effectiveness of multivalent molecules in recapitulating the activity of natural polysaccharides.

Mitigating Scarring and Inflammation during Corneal Wound Healing using Nanofiber-Hydrogel Scaffolds

Due to the universal lack of donor tissue, there has been emerging interest in engineering materials to stimulate living cells to restore the features and functions of injured organs. We are particularly interested in developing materials for corneal use, where the necessity to maintain the tissue’s transparency presents an additional challenge. Every year, there are 1.5 – 2 million new cases of monocular blindness due to irregular healing of corneal injuries, dwarfing the approximately 150,000 corneal transplants performed. The large gap between the need and availability of cornea transplantation motivates us to develop a wound-healing scaffold that can prevent corneal blindness.

To develop such a scaffold, it is necessary to regulate the cells responsible for repairing the damaged cornea, namely myofibroblasts, which are responsible for the disordered and non-refractive index matched scar that leads to corneal blindness. Using in vitro assays, we identified that protein nanofibers of certain orientation can promote cell migration and modulate the myofibroblast phenotype. The nanofibers are also transparent, easy to handle and non-cytotoxic. To adhere the nanofibers to a wound bed, we examined the use of two different in situ forming hydrogels: an artificial extracellular matrix protein (aECM)-based gel and a photo-crosslinkable heparin-based gel. Both hydrogels can be formed within minutes, are transparent upon gelation and are easily tunable.

Using an in vivo mouse model for epithelial defects, we show that our corneal scaffolds (nanofibers together with hydrogel) are well-tolerated (no inflammatory response or turbidity) and support epithelium regrowth. We developed an ex vivo corneal tissue culture model where corneas that are wounded and treated with our scaffold can be cultured while retaining their ability to repair wounds for up to 21 days. Using this technique, we found that the aECM-based treatment induced a more favorable wound response than the heparin-based treatment, prompting us to further examine the efficacy of the aECM-based treatment in vivo using a rabbit model for stromal wounds. Results show that treated corneas have fewer myofibroblasts and immune cells than untreated ones, indicating that our corneal scaffold shows promise in promoting a calmer wound response and preventing corneal haze formation.

An in vitro biomolecular breadboard for prototyping synthetic biological circuits

Biomolecular circuit engineering is critical for implementing complex functions in vivo, and is a baseline method in the synthetic biology space. However, current methods for conducting biomolecular circuit engineering are time-consuming and tedious. A complete design-build-test cycle typically takes weeks' to months' time due to the lack of an intermediary between design ex vivo and testing in vivo. In this work, we explore the development and application of a "biomolecular breadboard" composed of an in-vitro transcription-translation (TX-TL) lysate to rapidly speed up the engineering design-build-test cycle. We first developed protocols for creating and using lysates for conducting biological circuit design. By doing so we simplified the existing technology to an affordable ($0.03/uL) and easy to use three-tube reagent system. We then developed tools to accelerate circuit design by allowing for linear DNA use in lieu of plasmid DNA, and by utilizing principles of modular assembly. This allowed the design-build-test cycle to be reduced to under a business day. We then characterized protein degradation dynamics in the breadboard to aid to implementing complex circuits. Finally, we demonstrated that the breadboard could be applied to engineer complex synthetic circuits in vitro and in vivo. Specifically, we utilized our understanding of linear DNA prototyping, modular assembly, and protein degradation dynamics to characterize the repressilator oscillator and to prototype novel three- and five-node negative feedback oscillators both in vitro and in vivo. We therefore believe the biomolecular breadboard has wide application for acting as an intermediary for biological circuit engineering.

Quantificação da área ocupada pela guta-percha e pelo Resilon em canais achatados após termoplastificação

O presente trabalho teve por objetivo quantificar, comparativamente, a área de preenchimento de dois materiais obturadores sólidos, cones de guta-percha (GP) e cones de Resilon (R), no terço apical de incisivos inferiores humanos, ex vivo, obturados pela técnica da onda contínua de condensação. Os espécimes foram submetidos a um protocolo, desde a cirurgia de acesso até o final do preparo químico-mecânico e divididos aleatoriamente em dois grupos, de 21 dentes cada, de acordo com o material utilizado. Não foi utilizado cimento endodôntico em nenhuma das amostras. Após a obturação, as amostras foram seccionadas transversalmente em dois níveis, a 3 e a 5mm do ápice, e subdivididas em grupos de acordo com a altura de corte e do material obturador, sendo estabelecido: GP3 (guta-percha com corte a 3mm), GP5 (guta-percha com corte a 5mm), R3 (Resilon com corte a 3mm) e R5 (Resilon com corte a 5mm). Posteriormente, as amostras foram submetidas a um processo de lixamento e polimento e examinadas em microscópio óptico por reflexão com aumento de 50x a 100x. Para a análise e processamento digital das imagens, foi utilizado o sistema de imagens Axio Vision 4.6 para Windows, sendo obtidas as medidas para cada área observada em micrômetros (μm); uma da área da cavidade, e outra da área de material obturador. Foi aferido o grau de circularidade de cada amostra, por uma fórmula matemática utilizada automaticamente pelo programa, onde 1 (um) é considerado o círculo perfeito e, quanto mais achatado o canal, mais tendente a 0 (zero) nesta escala. Obteve-se a área do canal, a circularidade de 0 a 1, a área preenchida pelo material obturador e, a porcentagem da área de preenchimento do material obturador em relação à área do canal. Foi realizado o cruzamento dos grupos dois a dois pelo teste t de Student, sendo verificada diferença estatisticamente significante entre os grupos GP3 e R3, tendo o grupo R3 apresentado maior porcentagem de área do canal radicular preenchida pelo material obturador em suas amostras (p<0,05). Na relação da circularidade com a quantidade de preenchimento, com o teste de Correlação de Pearson, não foi observada forte correlação entre a forma final do canal (relação de circularidade) e a quantidade de preenchimento do canal radicular pelos materiais obturadores testados. Conclui-se que houve grande variação de preenchimento mínimo e máximo em todos os grupos testados e o Resilon apresentou maior porcentagem de preenchimento de área do canal radicular em suas amostras.

Avaliação da eficácia da desinfecção de instrumentos usados durante o período transoperatório do tratamento endodôntico

Esta investigação objetivou a eficácia antimicrobiana de agentes desinfetantes utilizados na desinfecção dos instrumentos endodônticos, durante o período transoperatório do tratamento endodôntico. A atividade antimicrobiana dos desinfetantes álcool isopropílico, acetona e ácido peracético (PAA) foi avaliada sobre microrganismos planctônicos através de teste de contato (time kill assay), utilizando inóculo de 9,9 X 109 a 1,2 X 1012 unidades formadoras de colônia (UFC) e por determinação da concentração bactericida mínima (CBM), usando inóculo de aproximadamente 106 UFC. Os agentes químicos também foram avaliados sobre Enterococcus faecalis (E. faecalis) ATCC 29212 cultivada em matriz de dentina (ex vivo) visando a formação de biofilme. O biofilme (organismos sésseis) microbiano foi removido com limas tipo Kerr (LK), até as lâminas estarem visualmente preenchidas. As LK contaminadas foram usadas como carreadores (logo após a contaminação ou secas dentro de uma câmara de fluxo laminar por 10 minutos). As LK carreadoras foram imersas em álcool isopropílico ou acetona ambos a 80%, ou em Ácido peracético 2%, por 30 ou 60 segundos. As limas foram posteriormente colocadas em tubos de ensaio contendo caldo Enterococcosel para observar o crescimento dos enterococos viáveis. Depois, os experimentos in vivo foram realizados com LK contaminadas por material necrótico pulpar da região cervical de dentes indicados para tratamento endodôntico. As LK contaminadas foram imersas, por 30 ou 60 segundos, em 80% de acetona ou 80% de álcool isopropílico ou 2% de PAA. As limas foram então inoculadas em tubos de ensaio contendo meio tioglicolato. Os organismos que cresceram, foram identificados após o tratamento com PAA. A corrosão mediada pelos agentes químicos também foi testada, após a incubação de LK de aço inoxidável e de NiTi por 60 minutos, medindo o peso das LK antes e depois da imersão e por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Todos os agentes químicos foram capazes de eliminar ou reduzir a viabilidade das bactérias de espécies planctônicas Gram-negativas e Gram-positivas, embora a atividade dos produtos químicos sobre E. faecalis sésseis em testes de carreadores de LK demonstrou que o álcool isopropílico ou acetona foram incapazes de eliminar a contaminação bacteriana, especialmente, quando as limas foram secas previamente à exposição aos produtos químicos, por 15 ou 30 segundos. O PAA demonstrou a melhor atividade antimicrobiana e eliminou a viabilidade das células sésseis E. faecalis de ambas as limas endodônticas tipo K úmidas ou secas, após exposição por 15 segundos (100% de eliminação). Os experimentos desenvolvidos in vivo demonstraram que o PAA foi o agente mais eficaz (p<0,05), capaz de eliminar a viabilidade dos organismos em 92% das LK imersas depois de 60 segundos, quando comparado com acetona (64%) ou com álcool isopropílico (50%). O crescimento microbiano após o contato com o PAA demonstrou que somente o grupo dos Lactobacillus sp foi resistente a essa substância química. Os agentes químicos não demonstraram ser corrosivos, após a imersão por 1 hora, tanto por pesagem quanto por MEV. Foi observado que o PAA foi o agente mais eficaz para ser utilizado como desinfetante de instrumentos, durante o período transoperatório do tratamento endodôntico.

Exploring new labelling strategies for boronated compounds: towards fast development and efficient assessment of BNCT drug candidates

208 p.

Serological and Genetic Evidence for Altered Complement System Functionality in Systemic Lupus Erythematosus: Findings of the GAPAID Consortium

Systemic lupus erythematosus is a chronic autoimmune disease with multifactorial ethiopathogenesis. The complement system is involved in both the early and late stages of disease development and organ damage. To better understand autoantibody mediated complement consumption we examined ex vivo immune complex formation on autoantigen arrays. We recruited patients with SLE (n = 211), with other systemic autoimmune diseases (n = 65) and non-autoimmune control subjects (n = 149). Standard clinical and laboratory data were collected and serum complement levels were determined. The genotype of SNP rs1143679 in the ITGAM gene was also determined. Ex vivo formation of immune complexes, with respect to IgM, IgG, complement C4 and C3 binding, was examined using a functional immunoassay on autoantigen microarray comprising nucleic acids, proteins and lipids. Complement consumption of nucleic acids increased upon binding of IgM and IgG even when serum complement levels were decreased due to consumption in SLE patients. A negative correlation between serum complement levels and ex vivo complement deposition on nucleic acid autoantigens is demonstrated. On the contrary, complement deposition on tested protein and lipid autoantigens showed positive correlation with C4 levels. Genetic analysis revealed that the non-synonymous variant rs1143679 in complement receptor type 3 is associated with an increased production of anti-dsDNA IgG antibodies. Notwithstanding, homozygous carriers of the previously reported susceptible allele (AA) had lower levels of dsDNA specific IgM among SLE patients. Both the non-synonymous variant rs1143679 and the high ratio of nucleic acid specific IgG/IgM were associated with multiple organ involvement. In summary, secondary complement deficiency in SLE does not impair opsonization of nucleic-acid-containing autoantigens but does affect other antigens and potentially other complement dependent processes. Dysfunction of the receptor recognizing complement opsonized immune complexes promotes the development of class-switched autoantibodies targeting nucleic acids.

Influência do limite e do calibre apical após a instrumentação mecanizada com instrumentos reciprocantes na extrusão bacteriana apical

O objetivo deste estudo foi avaliar ex vivo a extrusão bacteriana apical após instrumentação com um sistema de instrumento único reciprocante e verificar a influência de diferentes limites e diâmetros apicais nesta. Sessenta e quatro raízes de pré-molares foram utilizadas. Os dentes foram acessados e seus canais radiculares foram contaminados com uma suspensão de Enterococcus faecalis e incubados por 30 dias possibilitando crescimento bacteriano em biofilme. Os dentes contaminados foram divididos em quatro grupos com 15 espécimes cada. O calibre dos instrumentos utilizados e comprimento de trabalho de cada grupo foram respectivamente R25 à 0mm do forame, R25 aquém 1mm, R40 a 0mm e R40 aquém 1mm. Foram feitos grupos controle de crescimento bacteriano positivo e negativo. As bactérias extruídas apicalmente durante a instrumentação foram coletadas em frascos de vidro contendo 0,9% de NaCl. As amostras microbiológicas foram retiradas destes frascos e incubadas em meio BHI ágar, durante 24 horas. O crescimento bacteriano foi contado e os resultados foram expressos em unidades formadoras de colônia (UFC). Os dados foram analisados pelo teste estatístico de Kruskal-Wallis. Não houve diferença estatisticamente significante no número de UFC entre os quatro grupos (p>0,05). A partir da análise dos resultados e dentro das limitações deste estudo foi possível concluir que independente do comprimento de trabalho e da ampliação foraminal haverá similar quantidade de extrusão bacteriana.

Avaliação da extrusão bacteriana apical após instrumentação mecanizada com sistemas reciprocantes de instrumento único comparados a um sistema rotatório multi-instrumento

O objetivo deste estudo foi avaliar ex vivo a extrusão bacteriana apical após instrumentação mecanizada com sistemas reciprocantes de instrumento único e movimento reciprocante (WaveOne and Reciproc) comparados a um sistema multi-instrumentos (BioRaCe). Quarenta e cinco incisivos inferiores humanos unirradiculares, ovais e de anatomia semelhante foram utilizados. Os dentes foram acessados e seus canais radiculares foram contaminados com uma suspensão de Enterococcus faecalis e incubados por 30 dias possibilitando crescimento bacteriano em biofilme. Os dentes contaminados foram divididos em três grupos com 15 espécimes cada (RE - Reciproc, WO -WaveOne e BR - BioRaCe). Foram utilizados oito dentes para grupos controle de crescimento bacteriano positivo e negativo. As bactérias extruídas apicalmente durante a instrumentação foram coletadas em frascos de vidro contendo 0,9% de NaCl. As amostras microbiológicas foram retiradas dos frascos e incubadas em meio BHI ágar, durante 24 horas. O crescimento bacteriano foi contado e os resultados foram expressos em unidades formadoras de colônia (UFC). Os dados foram analisados pelos testes estatísticos de Wilcoxon e Kruskal-Wallis. Não houve diferença estatisticamente significante no número de UFC entre os dois sistemas reciprocantes (p>0,05). Em contrapartida, o sistema de instrumentos rotatórios mostrou uma quantidade de UFC significativamente maior do que os dois outros grupos (p <0,05). A partir da análise dos resultados e dentro das limitações deste estudo foi possível concluir que todos os sistemas de instrumentação testados extruem bactérias apicalmente. No entanto, ambos os sistemas de instrumento único e movimento reciprocante extruem menos bactérias apicalmente do que o sistema rotatório multi-instrumentos de referência.

Análise da penetrabilidade de duas substâncias irrigadoras: estudo em canais simulados

O objetivo do estudo foi verificar ex vivo a penetração de duas substâncias irrigantes hipoclorito de sódio 5% e Chlor-Xtra (Vista Dental Products, Racine, WI) através da adição de corante em canais simulados de dentes clarificados. Sessenta caninos inferiores unirradiculares humanos foram utilizados. As raízes foram seccionados em 16mm e instrumentadas com limas rotatórias do sistema Protaper até a F2 no comprimento de trabalho de 15mm. As amostras foram submetidas ao processo de clarificação para ficarem transparentes e durante o processo foram criados os canais simulados no terço apical. As raízes foram divididas aleatoriamente em três grupos ( NaOCl 5%, Chlor-Xtra e água) contendo 20 espécime por grupo. As amostras foram irrigadas com 1,5mL de solução contraste( tinta chinesa junto com a solução irrigante do respectivo grupo). E cada amostra foi fotografada e analisada. Os dados foram analisados estatisticamente pelos testes Kruskal-Wallis e Student-Neuman-Keuls. Não houve diferença estatística entre as substâncias irrigantes testadas (p>0,05). A partir da análise dos dados, foi possível concluir que apesar da presença de agentes surfactantes na solução irrigante de Chlor-Xtra não houve uma melhor penetrabilidade nos canais simulados em comparação ao hipoclorito de sódio(NaOCl).

Neurochemical changes in brain induced by chronic morphine treatment: NMR studies in thalamus and somatosensory cortex of rats

To investigate the effects of chronic morphine treatment and its cessation on thalamus and the somatosensory cortex, an ex vivo high resolution (500 MHz) H-1 nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMRS), in the present study, was applied to detect multi