Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO:O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ---------------------------- ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites.3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

Conservação de recursos genéticos de plantas medicinais em banco ativo de germoplasma

Em agosto de 1983, o Centro Nacional de Recursos Genéticos (GENARGEN) iniciou um projeto de estabelecimento de um Banco Ativo de Germoplasma de Plantas Medicinais. Sua finalidade é a conservação permanente de importantes espécies de plantas bem como o estudo de aspectos biológicos relacionados ao melhoramento genético. Uma coleção ativa de plantas no campo, já ocupa uma área de 6.000m2, contendo mais de duzentos acessos. As espécies sendo conservadas são aquelas usadas pela população do Distrito Federal, mas serão também conservadas as 10-20 espécies mato importantes de cada região do país, além de 20 espécies introduzidas. A coleção ativa está sendo estudada para se obter suficientes informações e material a ser distribuído aos centros de pesquisas farmacológicos, agronômicos e outros relacionados. As informações sendo obtidas incluem biologia reprodutiva e tecnologia de sementes. Rotinas de manipulação de germoplasma tal como documentação, registro, fitossanidade, quarentena e empacotamento de sementes estão sendo empregadas. Espera-se que esse banco ativo de germoplasma seja um protótipo para outros que deverão ser criados ροr todo o país, para evitar o desaparecimento de espécies importantes de plantas produtoras de drogas.

Avaliação por Imagem de Ressonância Magnética das alterações estruturais e fisiológicas dos músculos da perna após exercício

Esta dissertação tem como objectivo principal avaliar por IRM as alterações arquitectónicas e funcionais dos músculos mais importantes da perna quando submetidos a um protocolo de exercício intenso. Para esse fim, foram utilizadas técnicas avançadas de imagem específicas tais como o DTI, o BOLD e a relaxometria T2. Estas técnicas forneceram-nos de forma não-invasiva diversas informações in vivo e em tempo real sobre os tecidos musculares. Para além destas, também foram utilizadas sequências ponderadas em DP que serviram de referência anatómica e das quais também foram retirados dados arquitectónicos. Participaram neste estudo seis jovens atletas saudáveis do sexo feminino. Os músculos analisados foram o tibial anterior, os gastrocnémios (medial e lateral) e o solear. As diversas sequências de imagem foram adquiridas em duas fases distintas: pré e pós-exercício. O protocolo de exercício constou numa série de saltos unipedais realizados até à exaustão. Depois de adquiridas, as imagens foram processadas e tratadas com scripts dedicados e/ou software especializado. Os valores obtidos através da delimitação de ROIs, manipulação das imagens em 3D e execução de tractografias permitiram-nos apreciar as alterações ocorridas nos músculos exercitados. Após tratamento estatístico, verificou-se um comportamento semelhante entre os músculos nas várias técnicas de imagem. O ADC, o sinal BOLD e o valor de T2 variaram de forma equivalente nos músculos gastrocnémios e solear (agonistas no exercício praticado), enquanto que no tibial anterior estas variações foram menores ou inclusivamente negativas. Quanto aos dados arquitectónicos registados de forma directa na imagem ou obtidos através do DTI, não verificamos alterações estatisticamente significativas na maior parte das variáveis, à excepção do comprimento médio das fibras, do CSA e do ângulo de penação de alguns músculos. A IRM consegue assim avaliar a estrutura e função do músculo, complementando ou substituindo cada vez mais outras técnicas mais invasivas ou ineficazes.

Fotografia-História, o pensamento em imagens : Contributos para a leitura de «História da Imagem Fotográfica em Portugal, 1839-1997» (António Sena, 1998) como um hiperdocumento

Com esta investigação pretende-se caracterizar a relação indissociável entre História e Fotografia, reconhecendo as múltiplas formas de manipulação e respectivos mecanismos de hierarquização de poder, que não apenas determinam o desenvolvimento da sua produção, arquivo e recepção, como desvendam uma constelação de ligações disciplinares, técnicas e políticas que potenciam e moldam o seu sentido. Esta problemática é analisada no contexto português, a partir das práticas de exposição, publicação e colecção fotográfica e consequente ajuste do discurso teórico e crítico nas décadas de 1980 e 1990, adoptando como eixo de pesquisa o trabalho de investigação e historiografia desenvolvido entre 1973 e 1998 por António Sena e, especificamente, o modo como aplica a História (de um meio) como hiperdocumento. O filme Olho de Vidro, uma História da Fotografia (1982), realizado por António Sena e Margarida Gil, as iniciativas fotográficas desenvolvidas pela associação ether/vale tudo menos tirar olhos entre 1982 e 1994, a criação da base de dados Luzitânia/ ether pix database e as publicações Uma História de Fotografia (1991) e História da Imagem Fotográfica em Portugal, 1839-1997 (1998) da autoria de António Sena, formam o corpus do nosso estudo de caso.

Contributos para um Plano de Preservação no Arquivo Intermédio da Câmara Municipal de Sintra

Os aquivos municipais preservam a documentação definida legalmente como de conservação permanente, a memória e a experiência da Administração Local e, como tal, são agentes imprescindíveis à preservação dos direitos municipais. A preocupação com a preservação da documentação deve constituir um dos pilares principais do arquivo desde o início da sua criação. E não somente quando a documentação é transferida para o Arquivo Histórico, deve estar presente durante todo o ciclo de vida da documentação. Com a criação do PARAM (Programa de Apoio à Rede de Arquivos Municipais), os arquivos municipais ganham um novo incremento, não só a nível técnico como a nível financeiro, sendo-lhe reconhecido o seu devido valor e importância, na sua dupla dimensão, administrativa e cultural. Uma das funções do arquivo é disponibilizar a documentação que têm à sua guarda e que se encontra armazenada nos depósitos. Para tal é fundamental criar condições a curto, a médio e a longo prazo, implementando toda uma política integrada de preservação, envolvendo os demais serviços da instituição, fazendo-se o controlo do estado de conservação da documentação, aplicando uma metodologia da manipulação de documentos para disponibilizá-los tanto aos clientes internos como externos. O Arquivo Intermédio da Câmara Municipal de Sintra não possui plano de preservação documental, nem ações de preservação extensíveis aos objetos digitais, daí que a presente tese de mestrado pretenda ser um proposta de um contributo de um plano de preservação, que tenha em consideração os demais aspetos desde a localização e construção ou manutenção do edifício onde se encontra o arquivo, questões de segurança, de controlo ambiental, de luz/fotodegradação, o controlo integrado de pragas, danos causados por água, os desastres naturais, a poluição, a limpeza e vigilância na zona de depósitos e armazenamento e manuseamento dos documentos.

From user browsing behaviour to user demographics

A Internet conta hoje com mais de 3 mil milhões de utilizadores e esse valor não para de aumentar. Desta forma, proporcionar uma experiência online agradável aos seus utilizadores é cada vez mais importante para as empresas. De modo a tirar partido dos benefícios deste crescimento, as empresas devem ser capazes de identificar os seus clientes-alvo dentro do total de utilizadores; e, subsequentemente, personalizar a sua experiência online. Existem diversas formas de estudar o comportamento online dos utilizadores; no entanto, estas não são ideais e existe uma ampla margem para melhoria. A inovação nesta área pode comportar um grande potencial comercial e até ser disruptiva. Com isto em mente, proponho-me a estudar a possível criacão de um sistema de aprendizagem automática (machine learning) que permita prever informa ações demográficas dos utilizadores estritamente com base no seu comportamento online. Tal sistema poderia constituir uma alternativa às atuais opções, que são mais invasivas; mitigando assim preocupações ao nível da proteção de dados pessoais. No primeiro capítulo (Introdução) explico a motivação para o estudo do comportamento dos utilizadores online por parte de empresas, e descrevo as opções disponíveis atualmente. Apresento também a minha proposta e o contexto em que assenta. O capítulo termina com a identicação de limitações que possam existir a priori. O segundo capítulo (Machine Learning) fornece uma introdução sobre machine learning, com o estudo dos algoritmos que vão ser utilizados e explicando como analisar os resultados. O terceiro capítulo (Implementação) explica a implementação do sistema proposto e descreve o sistema que desenvolvi no decorrer deste estudo, e como integra-lo em sistemas já existentes. No quarto capítulo (Análise e manipulação dos dados), mostro os dados compilados e explico como os recolhi e manipulei para testar a hipótese. No quinto capítulo (Análise de dados e discussão) vemos como e que os dados recolhidos foram usados pelos vários algoritmos para descobrir como se correlacionam com dados dos utilizadores e analiso e discuto os resultados observados. Por fim, o sexto e último capítulo apresenta as conclusões. Dependendo dos resultados, mostro como a hipótese poderia ser melhor testada, ou então discuto os próximos passos para tornar o sistema realidade.

Aprendizagem baseada na resolução de problemas: uma experiência pedagógica com alunos de um Curso de Especialização Tecnológica

Relatório de estágio de mestrado em Ensino de Informática

O sentido espacial das crianças de 3 e 4 anos

Relatório de estágio de mestrado em Educação Pré-Escolar e Ensino do 1ºCiclo do Ensino Básico

Monitoring and analysis of queries in distributed databases

Dissertação de Mestrado em Engenharia Informática

Exploring chemical conversions in metabolic networks by tracing atoms transitions

Dissertação de mestrado em Bioinformática

Relação entre o desenvolvimento motor das crianças, quanto ao desempenho motor no controlo de objetos e as suas caraterísticas empreendedoras

Relatório de estágio de mestrado em Ensino de Educação Física nos Ensinos Básico e Secundário

Improvement of in silico strain engineering methods in Saccharomyces cerevisiae

PhD thesis in Bioengineering

Uma proposta de avaliação integrada de risco do uso de agrotóxicos no estado do Amazonas, Brasil

Durante os últimos 30 anos, o aumento da população humana no Amazonas introduziu a necessidade de produção adicional de alimentos e levou o governo do estado a desenvolver programas para aumentar e melhorar a produção agrícola. A produção de hortaliças não tradicionais apresentou vários problemas desconhecidos para os agricultores da região, uma vez que estas culturas não são bem adaptadas às condições locais. A suscetibilidade a insetos, fungos e outras pragas, e a competição com vegetação nativa vem forçando os agricultores a usar intensivamente os agrotóxicos. Os agricultores não estavam preparados para o uso adequado desta tecnologia ignorando os riscos dos agrotóxicos para saúde humana e o ambiente. Os agricultores não usam equipamento de proteção individual, porque é caro, desconfortável e inadequado para o clima quente da região. A falta treinamento e o escasso conhecimento sobre os perigos dos agrotóxicos contribuem para a manipulação incorreta durante a preparação, aplicação e disposição das embalagens vazias. Nestas condições, a exposição dos agricultores, suas famílias, consumidores e ambiente é alta. Como um primeiro passo para o entendimento deste problema e a proposição de soluções é proposta a realização de uma avaliação integrada de risco. As três fases do processo, formulação de problema, avaliação da exposição, e caracterização de risco são detalhadas. Programas de educação, treinamento e informação fazem parte das estratégias para a redução do risco do uso de agrotóxicos permitindo o desenvolvimento de uma agricultura ambientalmente sustentável.

Biologia reprodutiva de Cattleya eldorado, uma espécie de Orchidaceae das campinas amazônicas

As Orchidaceae são muito apreciadas por suas flores exóticas e exuberantes. É a maior família de plantas apresentando mais de 24000 espécies, o que denota uma alta diversidade de formas e adaptações a diferentes ambientes, como também para atração, engano e manipulação de visitantes na realização da polinização cruzada. Cattleya eldorado ocorre em áreas de campinas, que são formações vegetais típicas da região amazônica, que se encontram sob forte ação antrópica. Este trabalho tem como um de seus principais objetivos conhecer parte dos processos biológicos de C. eldorado fornecendo subsídios para conservá-la e manejá-la em seu habitat natural. Este estudo foi desenvolvido na Reserva Biológica de Campina, de 2000 a 2006, durante a sua floração. C. eldorado é uma espécie epifítica que apresenta a síndrome de melitofilia, estando adaptada ao seu polinizador, a abelha Eulaema mocsaryi, que reconhece suas flores pelo odor e pelo estímulo visual através de sua coloração e reflexão de luz ultravioleta. C. eldorado é uma espécie autocompatível, embora necessite de um agente polinizador para a transferência do polinário até sua deposição na cavidade estigmática da flor.

Aplicação de celulases e xilanases na reciclagem de fibras de papel

Tese de Doutoramento em Engenharia Química e Biológica (área de conhecimento em Engenharia Enzimática e das Fermentações)