Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Estudo dos solos da região metropolitana de Fortaleza para aplicação na engenharia rodoviária

O trabalho aqui apresentado é resultado de uma pesquisa onde se procurou caracterizar os solos da Região Metropolitana de Fortaleza (RMF). Inicialmente, o objetivo deixou de ser principal devido às limitações desse método quando aplicado aos solos da RMF. O objetivo principal do trabalho passou a ser estudar mais detalhadamente os solos que ocorrem na Região Metropolitana de Fortaleza à luz de métodos convencionais e não convencionais, para aplicação na engenharia rodoviária. Para tanto, foram estudados sessenta solos pertencentes às classes pedológicas que ocorrem na RMF. Esses solos foram submetidos a um programa experimental que envolveu a execução de ensaios \"convencionais\" e \"não convencionais\". A partir dos resultados experimentais foram estabelecidas correlações entre os valores de algumas propriedades de interesse à pavimentação realizadas em cilindro convencional e miniatura. Tentou-se determinar o valor de CBR de um solo, dispondo das cargas calculadas no ensaio mini-CBR, mas essa tarefa não logrou êxito. As amostras foram classificadas pelas classificações HBR e MCT para verificação da qualidade da previsão das propriedades dos solos obtidas por esses métodos e aqueles resultantes da execução dos ensaios de laboratório. Foi proposto, a partir da execução de ensaio de adsorção de azul de metileno, a inclusão no ábaco de três zonas para se caracterizar o comportamento dos solos da RMF. Os resultados experimentais permitiram, também, concluir que pode-se identificar os materiais com potencial de uso na pavimentação de sua classe pedológica.

Ocorrência e caracterização de Giardia e Cryptosporidium em águas captadas para abastecimento público no município de Cajamar-SP e avaliação do risco

Introdução: O risco à saúde humana ocasionado pela contaminação biológica de águas captadas para abastecimento público é realçado pela ocorrência de surtos de doenças associadas aos protozoários Giardia e Cryptosporidium, que possuem baixas doses infecciosas e alta capacidade de sobrevivência no ambiente, além de serem capazes de resistir ao processo tradicional de desinfecção da água (cloração). Partindo-se da hipótese de que há um risco elevado de infecção por estes protozoários pela ingestão de água tratada por métodos convencionais e que fazem uso de mananciais superficiais impactados por contaminação biológica, resultando num possível incremento da incidência de diarréias, este estudo se propôs a verificar a ocorrência destes protozoários em águas captadas para abastecimento público no município de Cajamar-SP, caracterizar sua patogenicidade e avaliar o risco associado ao seu consumo através da água tratada. Métodos: Foram coletadas 48 amostras do ribeirão dos Cristais no ponto de captação da estação de tratamento de água, semanalmente, durante 12 meses (de 16/05/2013 a 21/05/2014). A detecção e a análise da concentração dos protozoários foram realizadas de acordo com Método 1623.1 da United States Environmental Protection Agency e a extração e caracterização dos espécies/genótipos de Giardia e Cryptosporidium foi realizada através metodologias moleculares e seqüenciamento. O risco de infecção pela ingestão de cistos de Giardia e oocistos de Cryptosporidium presentes na água tratada foi calculado usando a ferramenta da Avaliação Quantitativa do Risco Microbiológico, a partir dos dados de concentração dos patógenos obtidos pelo Método 1623.1, eficiência de remoção dos (oo)cistos durante o processo convencional de tratamento da água, modelo dose-resposta e taxa de ingestão diária de água para indivíduos menores de 5 anos e maiores de 21 anos. Resultados: Cistos de Giardia foram detectados em 83,3% das amostras (40/48), com concentrações variando desde o limite de detecção (<0,1) até 8,6 cistos/L. Oocistos de Cryptosporidium foram etectados em 37,5% das amostras (18/48), com concentrações variando desde o limite de detecção (<0,1) até 2 oocistos/L. As espécies/genótipos encontrados (Giardia intestinalis A e B e Cryptosporidium parvum e hominis) são característicos de contaminação antrópica e são frequentemente identificados em estudos epidemiológicos como responsáveis por surtos. A estimativa do risco anual de infecção por Giardia foi de 3,3x10-3 (IC95% 4,6x10-3) para crianças e de 11,5x10-3 (IC95% 13,3x10-3) para adultos, enquanto o risco por Cryptosporidium foi de 1,1x10-3 (IC95% 1,7x10-3) para crianças e de 3,9x10-3 (IC95% 5,0x10-3) para adultos. O incremento da incidência de diarréias foi observado no cenário de estudo após um acidente que resultou em transbordamento de esgotos não tratados no manancial, coincidindo com o aumento na detecção de (oo)cistos. Conclusão: Os resultados evidenciaram que a vulnerabilidade do ribeirão dos Cristais a contaminações biológicas pode culminar em um risco elevado de infecção e adoecimento por Giardia e Cryptosporidium através da ingestão de água tratada. Portanto, o caso é preocupante, tanto do ponto de vista do tratamento e abastecimento de água potável, quanto da degradação e contaminação do manancial, evidenciando a necessidade de se estabelecer medidas de intervenção direcionadas a promover a qualidade da água e garantir sua segurança

Stabilisation of low softening point petroleum pitch fibres by HNO3

This paper deals with the stabilisation of low softening point pitch fibres obtained from petroleum pitches using HNO3 as oxidising agent. This method presents some advantages compared with conventional methods: pitches with low softening point (SP) can be used to prepare carbon fibres (CF), the stabilisation time has been reduced, the CF yields are similar to those obtained after general methods of stabilisation, and the initial treatments to increase SP when low SP pitches are used to prepare CF, are avoided. The parent pitches were characterised by different techniques such as diffuse reflectance infrared Fourier transform spectroscopy (DRIFTS), elemental analysis and solvent extraction with toluene and quinoline. The interaction between HNO3 and the pitch fibres, as well as the changes occurring during the heat treatment, have been followed by DRIFTS.

Stabilisation of low softening point petroleum pitch fibres by iodine treatment

A method using iodine has been developed for the stabilisation of low softening point (SP) pitch fibres that avoids air stabilisation in the production of carbon fibres (CF). The interaction between iodine and petroleum pitches has been studied by following the changes in the hydrogen content, aromatic or aliphatic, during the heat treatment of iodine-treated pitch fibres. Two low SP petroleum pitches were used and the iodine-treated pitch fibres were analysed by TGA, DSC, DRIFT, XPS and SEM. The results confirm that using this novel method pitches with low SP can be used to prepare CF with two advantages, compared with conventional methods. The stabilisation time is considerably reduced and treatments to increase the SP, usually required when low SP pitches are used to prepare CF, can be avoided.

Ion balance in waters through inductively coupled plasma optical emission spectrometry

Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry (ICP-OES) has been employed to carry out the determination of both major anions and cations in water samples. The anion quantification has been performed by means of a new automatic accessory. In this device chloride has been determined by continuously adding a silver nitrate solution. As a result solid silver chloride particles are formed and retained on a nylon filter inserted in the line. The emission intensity is read at a silver characteristic wavelength. By plotting the drop in silver signal versus the chloride concentration, a straight line is obtained. As regards bicarbonate, this anion has been on-line transformed into carbon dioxide with the help of a 2.0 mol L−1 nitric acid stream. Carbon signal is linearly related with bicarbonate concentration. Finally, information about sulfate concentration has been achieved by means of the measurement of sulfur emission intensity. All the steps have been simultaneously and automatically performed. With this setup detection limits have been 1.0, 0.4 and 0.09 mg L−1 for chloride, bicarbonate and sulfate, respectively. Furthermore, it affords good precision with RSD below 6 %. Cation (Ca, Mg, Na and K) concentration, in turn, has been obtained by simultaneously reading the emission intensity at characteristic wavelengths. The obtained limits of detection have been 8 × 10−3, 2 × 10−3, 8 × 10−4 and 10−2 mg L−1 for sodium, potassium, magnesium and calcium, respectively. As regards sample throughput, about 30 samples h−1 can be analysed. Validation results have revealed that the obtained concentrations for these anions are not significantly different as compared to the data provided by conventional methods. Finally, by considering the data for anions and cations, precise ion balances have been obtained for well and mineral water samples.

Towards Accurate and Efficient Description of Excited States

Thesis (Ph.D.)--University of Washington, 2016-06

A PCR method for the identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) from screening swabs

Aim: The aim of this study was to assess the discriminatory power and potential turn around time ( TAT) of a PCR-based method for the detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) from screening swabs. Methods: Screening swabs were examined using the current laboratory protocol of direct culture on mannitol salt agar supplemented with oxacillin (MSAO-direct). The PCR method involved pre-incubation in broth for 4 hours followed by a multiplex PCR with primers directed to mecA and nuc genes of MRSA. The reference standard was determined by pre-incubation in broth for 4 hours followed by culture on MSAO (MSAO-broth). Results: A total of 256 swabs was analysed. The rates of detection of MRSA using MSAO-direct, MSAO-broth and PCR were 10.2, 13.3 and 10.2%, respectively. For PCR, the sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive values were 66.7% (95% CI 51.9 - 83.3%), 98.6% ( 95% CI 97.1 - 100%), 84.6% ( 95% CI 76.2 - 100%) and 95.2% ( 95% CI 92.4 - 98.0%), respectively, and these results were almost identical to those obtained from MSAO-direct. The agreement between MSAO-direct and PCR was 61.5% ( 95% CI 42.8 - 80.2%) for positive results, 95.6% ( 95% CI 93.0 - 98.2%) for negative results and overall was 92.2% ( 95% CI 88.9 - 95.5%). Conclusions: ( 1) The discriminatory power of PCR and MSAO-direct is similar but the level of agreement, especially for true positive results, is low. ( 2) The potential TAT for the PCR method provides a marked advantage over conventional methods. ( 3) Further modifications to the PCR method such as increased broth incubation time, use of selective broth and adaptation to real-time PCR may lead to improvement in sensitivity and TAT.

Stickiness measurement techniques for food powders: a review

The importance of sticky behaviour of amorphous food powders has been recognized over many decades in the food industry due to its influence on process and handling abilities and quality of the powders. This paper emphasizes the role of stickiness in the food powder industry as well as reviews the stickiness characterization techniques developed to date. This paper also attempts to correlate the stickiness behaviour of food powders to the instrumental analysis such as glass transition temperature. (C) 2004 Elsevier B.V All rights reserved.

Local liquid holdups and hysteresis in a 2-D packed bed using X-ray radiography

An X-ray visualization technique has been used for the quantitative determination of local liquid holdups distribution and liquid holdup hysteresis in a nonwetting two-dimensional (2-D) packed bed. A medical diagnostic X-ray unit has been used to image the local holdups in a 2-D cold model having a random packing of expanded polystyrene beads. An aqueous barium chloride solution was used as a fluid to achieve good contrast on X-ray images. To quantify the local liquid holdup, a simple calibration technique has been developed that can be used for most of the radiological methods such as gamma ray and neutron radiography. The global value of total liquid holdup, obtained by X-ray method, has been compared with two conventional methods: drainage and tracer response. The X-ray technique, after validation, has been used to visualize and quantify, the liquid hysteresis phenomena in a packed bed. The liquid flows in preferred paths or channels that carry droplets/rivulets of increasing size and number as the liquid flow rate is increased. When the flow is reduced, these paths are retained and the higher liquid holdup that persists in these regions leads to the holdup hysteresis effect. Holdup in some regions of the packed bed may be an order of magnitude higher than average at a particular flow rate. (c) 2005 American Institute of Chemical Engineers

Use of the Vector (TM) scaling unit in supportive periodontal therapy: a subjective patient evaluation

Background: Patient discomfort is one reason for poor compliance with supportive periodontal therapy (SPT). The aim of this study was to compare the levels of discomfort during SPT, using the Vector (TM) system and treatment with a conventional ultrasonic scaler. Methods: Forty-six patients with an SPT programme were debrided using both the Vector (TM) system and a conventional piezo-electric scaler (Sirona (TM)) in a split mouth design. A visual analogue scale was used to evaluate of pain scores upon completion of treatment. A verbal response scale(VRS) was used to assess discomfort, vibration and noise associated with the scaling system, as well as the volume and taste of the coolant used by these systems. Results: Patients instrumented with the Vector (TM) system experienced approximately half the amount of pain compared with the conventional ultrasonic scaling system. The VRS showed that the Vector (TM) system caused less discomfort than the conventional ultrasonic scaling system when assessed for pain, vibration, noise and volume of coolant. These findings were all statistically significant. There was, however, no statistically significant difference between the two systems when assessed for taste. Conclusion: During SPT the Vector (TM) system caused reduced discomforting sensations compared with conventional methods and may be useful in improving compliance with SPT programmes.

The combined SPE : ToxY-PAM phytotoxicity assay; application and appraisal of a novel biomonitoring tool for the aquatic environment

Mounting concerns regarding the environmental impact of herbicides has meant a growing requirement for accurate, timely information regarding herbicide residue contamination of, in particular, aquatic systems. Conventional methods of detection remain limited in terms of practicality due to high costs of operation and the specialised information that analysis provides. A new phytotoxicity bioassay was trialled for the detection of herbicide residues in filter-purified (Milli-Q) as well as natural waters. The performance of the system, which combines solid-phase extraction (SPE) with the ToxY-PAM dual-channel yield analyser (Heinz Walz GmbH), was tested alongside the traditional method of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). The assay methodology was found to be highly sensitive (LOD 0.1 ng L-1 diuron) with good reproducibility. The study showed that the assay protocol is time effective and can be employed for the aquatic screening of herbicide residues in purified as well as natural waters.

Application of nox-restriction fragment length polymorphism for the differentiation of Brachyspira intestinal spirochetes isolated from pigs and poultry in Australia

Sixty-nine intestinal spirochetes isolated from pigs and poultry in eastern Australia were selected to evaluate the effectiveness of a species-specific PCR-based restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of the Brachyspira nox gene. For comparative purposes, all isolates were subjected to species-specific PCRs for the pathogenic species Brachyspira hyodysenteriae and Brachyspira pilosicoli, and selected isolates were examined further by sequence analysis of the nox and 16S ribosomal RNA genes. Modifications to the original nox-RFLP method included direct inoculation of bacterial cells into the amplification mixture and purification of the PCR product, which further optimized the nox-RFLP for use in a veterinary diagnostic laboratory, producing sufficient product for both species identification and future comparisons. Although some novel profiles that prevented definitive identification were observed, the nox-RFLP method successfully classified 45 of 51 (88%) porcine and 15 of 18 (83%) avian isolates into 5 of the 6 recognized species of Brachyspira. This protocol represents a significant improvement over conventional methods currently used in veterinary diagnostic laboratories for rapid specific identification of Brachyspira spp. isolated from both pigs and poultry.

New concepts for distinguishing the hidden patterns of linkage disequilibrium which underlie association between genotypes and complex phenotypes

A disappointing feature of conventional methods for detecting association between DNA variation and a phenotype of interest is that they tell us little about the hidden pattern of linkage disequilibrium (LD) with the functional variant that is actually responsible for the association. This limitation applies to case-control studies and also to the transmission/disequilibrium test (TDT) and other family-based association methods. Here we present a fresh perspective on genetic association based on two novel concepts called 'LD squares' and 'equi-risk alleles'. These describe and characterize the different patterns of gametic LD which underlie genetic association. These concepts lead to a general principle - the Equi-Risk Allele Segregation Principle - which captures the way in which underlying LD patterns affect the transmission patterns of genetic variants associated with a phenotype. This provides a basis for distinguishing the hidden LD patterns and might help to locate the functional variants responsible for the association.

Surgical correction of astigmatism during cataract surgery

High levels of corneal astigmatism are prevalent in a significant proportion of the population. During cataract surgery pre-existing astigmatism can be corrected using single or paired incisions on the steep axis of the cornea, using relaxing incisions or with the use of a toric intraocular lens. This review provides an overview of the conventional methods of astigmatic correction during cataract surgery and in particular, discusses the various types of toric lenses presently available and the techniques used in determining the correct axis for the placement of such lenses. Furthermore, the potential causes of rotation in toric lenses are identified, along with techniques for assessing and quantifying the amount of rotation and subsequent management options for addressing post-operative rotation.