Studio della reazione di isomerizzazione del d-glucosio

I carboidrati, come il D-glucosio, sono i principali costituenti della biomasse e potrebbero rappresentare un’alternativa concreta alla chimica tradizionale del petrolio per la produzione dei building-blocks, utili quest’ultimi per lo sviluppo della filiera produttiva della chimica industriale. Dal D-glucosio è possibile ottenere epimeri importanti per la medicina o zuccheri largamente utilizzati in campo alimentare come il D-fruttosio tramite isomerizzazione strutturale del D-glucosio. Attualmente, la maggior parte dei metodi di sintesi di questa molecole prevedono l’utilizzo enzimi, o la catalisi omogenea con impiego di grandi quantità di basi e acidi minerali dannosi per l’ambiente. Lo scopo di questo lavoro è stato lo studio di innovativi catalizzatori eterogenei capaci operare in soluzione acquosa la conversione acido catalizzata del D-glucosio in prodotti di epimerizzazione e isomerizzazione strutturale. I catalizzatori dei nostri test sono stati caratterizzati tramite tecniche BET, ATR-IR, DRUv-Vis e XRD. Lo studio, quindi, è stato focalizzato sulle valutazioni delle prestazioni catalitiche di questi sistemi e sull’individuazione, tramite caratterizzazione strumentale, degli ioni costituenti questi solidi responsabili delle alte selettività nelle reazioni di riarrangiamento strutturale del D-glucosio. Gli studi condotti hanno portato alla conclusione che, grazie all’utilizzo di questi sistemi inorganici è possibile ottenere con alte selettività prodotti di riarrangiamento strutturale del D-glucosio, evitando al contempo la degradazione del substrato che in genere accompagna queste reazioni in condizioni di catalisi acida. Ulteriori studi riguardanti questi catalizzatori apriranno con buone probabilità la strada allo sviluppo di un nuovo processo industriale per la sintesi di questi zuccheri derivati, rendendo possibile una via produttiva sostenibile da un punto di vista economico che ambientale.

Alchilazione in fase gassosa del fenolo con reagenti "green" in catalisi basica eterogenea

L’alchilazione del fenolo (PhOH) è un processo di grande rilevanza. I prodotti, alchilfenoli (dall’alchilazione del carbonio d’anello) ed eteri fenilici (dall’alchilazione dell’ossigeno fenolico), sono usati nella produzione di resine fenoliche ed in sintesi organica. I carbonati organici sono atossici, biodegradabili, ottenibili da fonti rinnovabili ed hanno un ottimo potere solvente per i composti organici e aromatici. Con un opportuno catalizzatore sono reattivi per l’alchilazione del PhOH, e potrebbero sostituire gli alchilanti usati industrialmente: quelli per la O- alchilazione, alchilioduro e dialchilsolfato, sono estremamente tossici, mentre gli alcoli, impiegati per la C-alchilazione, decompongono estesamente sui catalizzatori industriali. In questo lavoro di tesi, le prestazioni del dietilcarbonato (DEC) come agente etilante del PhOH sono state indagate a fondo al variare dei parametri operativi, e sono state poi confrontate con quelle dell’etanolo, dimostrando che il carbonato è molto più reattivo: sui catalizzatori basici il DEC mostra una chemoselettività prettamente orientata alla O-alchilazione e la conversione del PhOH può essere massimizzata agendo sui parametri operativi senza grandi variazioni nella selettività del prodotto di interesse; sui sistemi acido/base (ossido misto di Mg e Al) si è invece dimostrato possibile orientare l’alchilazione alternativamente all’ossigeno (fenetoli) o al carbonio (etilfenoli) aumentando la temperatura.

Processi di degassamento di laghi craterici iperacidi: analisi del fenomeno attraverso i dati di prove di laboratorio e confronto con dati empirici.

Le condizioni iperacide presenti nelle acque di alcuni laghi craterici, combinate con altre proprietà chimico-fisiche quali densità e temperatura, possono favorire processi di degassamento anche di specie ad elevata solubilità e geochimicamente conservative in acque “normali”. In questa tesi si sono studiati i meccanismi e l’influenza di tali proprietà nel processo di degassamento attraverso la ricostruzione in laboratorio delle condizioni iperacide che caratterizzano i laghi iperacidi in natura. Particolare attenzione è posta al comportamento dello ione Cl-, diffusamente presente nelle acque crateriche e considerato fin ora tipicamente “conservativo”. In condizioni di estrema acidità questo ione modifica la sua tendenza conservativa, attivando le sue caratteristiche di base coniugata. In tali condizioni infatti esso si lega agli ioni H+ presenti formando acido cloridrico molecolare (HCl), parte del quale inevitabilmente degassa. Lo studio di soluzioni preparate in laboratorio e poste a condizioni di temperatura, densità ed acidità iniziale differenti, sono stati raccolti una serie di dati relativi al pH e alle variazioni della concentrazione dello ione Cl- imputabile a fenomeni di degassamento. I dati così ottenuti, sono stati poi confrontati con le caratteristiche chimico-fisiche di una serie di laghi craterici iperacidi esistenti in varie parti del mondo. Questo confronto ha consentito di definire più in dettaglio le cause ed i meccanismi che portano al degassamento di acidi forti (HCl) da acque iperacide e il grado di influenza delle varie proprietà sopra citate in questo fenomeno naturale.

Smart texile: biosensori elettronici indossabili

In questo lavoro verra presentata la realizzazione e la caratterizzazione di transistor organici basati su un polimero conduttore, il poli(3,4-etilenediossitiofene) polistirene sulfonato, o PEDOT:PSS. Tali transistor rientrano nella categoria degli OECT o transistor elettrochimici organici e hanno la capacita di poter rilevare ed analizzare sostanze chimiche di diverso genere presenti in soluzione. I dispositivi implementati in questa tesi sono stati ottenuti tramite la deposizione del materiale organico conduttivo su substrato tessile al fine di creare un device completamente integrabile in un capo di abbigliamento o in un qualsiasi utilizzo in campo tessile. In particolare questi transistor sono stati studiati per la rilevazione di sostanze quali acido ascorbico, dopamina e adrenalina. Gli ultimi due analiti sono di importanza particolare poiche facenti parte della famiglia dei neurotrasmettitori. Inoltre in questa tesi sono stati creati fili di cotone conduttivi, sempre tramite l'utilizzo di PEDOT:PSS. Tali fili infatti sono risultati ottimi candidati per il trasporto di un segnale elettrico e per questo sono stati implementati nella costruzione di un OECT. La realizzazione dei fili conduttivi potra permettere un ulteriore avanzamento nella completa integrabilita dell'elettronica con il settore tessile. Una peculiarita aggiuntiva di questo lavoro e stata quella di utilizzare il sudore artificiale come elettrolita, oltre al normale PBS che costituisce ormai uno standard in questo tipo di ricerche. L'utilizzo del sudore artificiale rientra nell'ottica futura di un utilizzo di questi sensori come rilevatori di sostanze chimiche emesse dal corpo umano sfruttabili diversi ambiti, ovvero dall'attivita sportiva alla prevenzione, in ambito medico, di diverse malattie.

Transistor elettrochimici organici per biosensoristica

I transistor elettrochimici a base organica (OECT) hanno attratto sempre maggior interesse e sono oggetto di molti studi dagli anni '70 no ai nostri giorni. Questo lavoro di tesi ha come oggetto la realizzazione e la caratterizzazione di OECT a base di poli(3,4-etilen-diossi-tiofene) complessato con l'acido stirensolfonico (PSS). Questi dispositivi sono stati costruiti utilizzando solamente semiconduttori organici come materiali conduttivi ovvero senza l'uso di metalli, quindi risultano essere biocompatibili, economici e di semplice realizzazione. Questo tipo di sensori presenta un elevata sensibilità agli analiti e necessita di un'elettronica di controllo molto più semplice rispetto a metodi elettrochimici tradizionali che utilizzano un potenziostato ed un elettrodo di riferimento. Sono state studiate diverse geometrie e spessori di polimero depositato per ottimizzare le condizioni di lavoro per avere alta sensibilità e guadagno in corrente attraverso l'uso di misure di corrente di drain in funzione del tempo con aggiunte successive di analita. Questi dispositivi sono stati utilizzati come sensori di analiti quali la dopamina, l'acido ascorbico e l'acido urico. Attraverso scansioni in transcaratteristica, si è studiata la risposta dei transistor relativa agli analiti ed attraverso lo studio della transconduttanza si è ottenuta una nuova metodologia di lavoro in grado di separare i contributi relativi ai vari composti. Inoltre, in questa modalità, è stato possibile ottenere una selettività dei sensori ai vari analiti, problema principale dell'utilizzo di transistor elettrochimici, ed attraverso la modulazione della velocità di scansione dello strumento, è stata ottenuta una risposta alla sola dopamina, analita di maggior interesse per applicazioni biosensoristiche. In conclusione si può affermare che questo tipo di dispositivo possiede ottime proprietà e caratteristiche per ulteriori studi e sviluppi in applicazioni reali.

Tratamiento con ácido sulfúrico de semillas de Gymnocladus Dioica L. cosechadas en Mendoza

En este trabajo se exponen los resultados obtenidos en pruebas de germinación realizadas durante los años 1947, 1948 y 1949 de semillas de Gymnocladus dioica L. producidas en esta región, previamente tratadas con ácido sulfúrico concentrado (d. 1,84) . Estos ensayos fueron efectuados con el objeto de lograr una buena germinación, ya que la aplicación del tratamiento empleado por Wiesehugel (1935) resultó ineficaz. Los porcentajes más altos de germinación, 72% y 75%, se obtuvieron con inmerciones de las semillas en ácido, durante 16 y 18 horas.

Tratamiento de superficie de las restauraciones de porcelana feldespática y su implicancia en la propagación de las fallas estructurales propias del material

Durante el proceso de elaboración de las porcelanas feldespáticas se producen en su interior micro rajaduras las cuales se propagan a través de la matriz vítrea aumentando la fragilidad del material cuando se lo expone a los esfuerzos mecánicos. Las restauraciones rígidas de porcelanas feldespáticas son sometidas a distintos tratamientos en su superficie para aumentar la adhesión a las estructuras dentarias cuando son cementadas. Estos tratamientos son acondicionamiento con ácido fluorhídrico y microarenado. Objetivos de este trabajo: 1. Evaluar la resistencia flexural de este material mediante ensayo mecánico en máquina Instron, previo tratamiento en su superficie con ácido fluorhídrico y microarenado. 2. Observar al MEB las alteraciones de superficie producidas por el microarenado y el ácido fluorhídrico. Los resultados obtenidos demostraron que el tratamiento de microarenado produjo una reducción de la resistencia flexural. El MEB confirmó la presencia de mayor cantidad de microgrietas que podrían ser responsables de la disminución de la resistencia flexural.

Integración temporal de las señales fotoperiódicas

El fotoperíodo es la cantidad de horas de luz solar en un ciclo de 24 h. La percepción del fotoperíodo permite a las plantas ubicarse en las estaciones del año y ajustar la ocurrencia de procesos en los momentos más favorables, evitando los más adversos. Muchas plantas utilizan el fotoperíodo como señal ambiental que regula el cambio de la fase vegetativa hacia la fase reproductiva definiendo el tiempo a floración y determinando si el cultivar es de ciclo corto o largo. El objetivo de esta tesis es identificar los mecanismos que utilizan las plantas para integrar el paso de sucesivos ciclos con fotoperíodos inductores de la floración, como así también identificar otros procesos (además de la floración) controlados por las señales fotoperiódicas. Plantas de Arabidopsis thaliana cultivadas en días cortos fueron transferidas a días largos (ciclos inductores) y se analizaron los cambios en la expresión de genes a medida que los ciclos sucesivos de días largos inducían más fuertemente la expresión. Proponemos un modelo en que la permanencia de los ciclos inductores actúa manteniendo niveles altos y relativamente estables de expresión del gen FLOWERING LOCUS T (FT), más que incrementando los niveles máximos de expresión de FT con el correr de los ciclos. Además, demostramos que la señal fotoperiódica controla las defensas de las plantas a través de la señalización del ácido jasmónico (JA) y también el aborto de granos por medio de un mecanismo que involucra a las proteínas con arabinogalactanos (AGP).

Modelos de computación lógica con ADN

La computación molecular es una disciplina que se ocupa del diseño e implementación de dispositivos para el procesamiento de información sobre un sustrato biológico, como el ácido desoxirribonucleico (ADN), el ácido ribonucleico (ARN) o las proteínas. Desde que Watson y Crick descubrieron en los años cincuenta la estructura molecular del ADN en forma de doble hélice, se desencadenaron otros descubrimientos como las enzimas que cortan el ADN o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), contribuyendo más que signi�cativamente a la irrupción de la tecnología del ADN recombinante. Gracias a esta tecnología y al descenso vertiginoso de los precios de secuenciación y síntesis del ADN, la computación biomolecular pudo abandonar su concepción puramente teórica. En 1994, Leonard Adleman logró resolver un problema de computación NP-completo (El Problema del Camino de Hamilton Dirigido) utilizando únicamente moléculas de ADN. La gran capacidad de procesamiento en paralelo ofrecida por las técnicas del ADN recombinante permitió a Adleman ser capaz de resolver dicho problema en tiempo polinómico, aunque a costa de un consumo exponencial de moléculas de ADN. Utilizando algoritmos similares al de �fuerza bruta� utilizado por Adleman se logró resolver otros problemas NP-completos (por ejemplo, el de Satisfacibilidad de Fórmulas Lógicas / SAT). Pronto se comprendió que la computación con biomolecular no podía competir en velocidad ni precisión con los ordenadores de silicio, por lo que su enfoque y objetivos se centraron en la resolución de problemas biológicos con aplicación biomédica, dejando de lado la resolución de problemas clásicos de computación. Desde entonces se han propuesto diversos modelos de dispositivos biomoleculares que, de forma autónoma (sin necesidad de un bio-ingeniero realizando operaciones de laboratorio), son capaces de procesar como entrada un sustrato biológico y proporcionar una salida también en formato biológico: procesadores que aprovechan la extensión de la Polimerasa, autómatas que funcionan con enzimas de restricción o con deoxiribozimas, circuitos de hibridación competitiva. Esta tesis presenta un conjunto de modelos de dispositivos de ácidos nucleicos escalables, sensibles al tiempo y energéticamente e�cientes, capaces de implementar diversas operaciones de computación lógica aprovechando el fenómeno de la hibridación competitiva del ADN. La capacidad implícita de estos dispositivos para aplicar reglas de inferencia como modus ponens, modus tollens, resolución o el silogismo hipotético tiene un gran potencial. Entre otras funciones, permiten representar implicaciones lógicas (o reglas del tipo SI/ENTONCES), como por ejemplo, �si se da el síntoma 1 y el síntoma 2, entonces estamos ante la enfermedad A�, o �si estamos ante la enfermedad B, entonces deben manifestarse los síntomas 2 y 3�. Utilizando estos módulos lógicos como bloques básicos de construcción, se pretende desarrollar sistemas in vitro basados en sensores de ADN, capaces de trabajar de manera conjunta para detectar un conjunto de síntomas de entrada y producir un diagnóstico de salida. La reciente publicación en la revista Science de un autómata biomolecular de diagnóstico, capaz de tratar las células cancerígenas sin afectar a las células sanas, es un buen ejemplo de la relevancia cientí�ca que este tipo de autómatas tienen en la actualidad. Además de las recién mencionadas aplicaciones en el diagnóstico in vitro, los modelos presentados también tienen utilidad en el diseño de biosensores inteligentes y la construcción de bases de datos con registros en formato biomolecular que faciliten el análisis genómico. El estudio sobre el estado de la cuestión en computación biomolecular que se presenta en esta tesis está basado en un artículo recientemente publicado en la revista Current Bioinformatics. Los nuevos dispositivos presentados en la tesis forman parte de una solicitud de patente de la que la UPM es titular, y han sido presentados en congresos internacionales como Unconventional Computation 2010 en Tokio o Synthetic Biology 2010 en París.

Mejora del valor proteico para rumiantes de la harina de girasol mediante tratamientos combinados con ácidos (málico y fosfórico) y calor = Improvement of the protein value for ruminants of sunflower meal by combined treatments with acids (malic and orthophosphoric) and heat

El objetivo principal de esta tesis fue incrementar el valor proteico para rumiantes de la harina de girasol mediante tratamientos combinados con ácidos y calor para proteger sus proteínas frente a la degradación ruminal. Estos estudios comprenden dos experimentos realizados sobre ovinos mediante tecnologías in vitro (experimento 1) o in situ e in vivo (experimento 2), empleando siempre dos ácidos: málico u ortofosfórico. Aprovechando este último experimento, también se consideraron otros objetivos de carácter metodológico con el fin de mejorar la precisión de las estimas de i) la degradabilidad ruminal y la digestibilidad intestinal de la proteína y los aminoácidos (AAs) de los alimentos y ii) la síntesis microbiana ruminal y su contribución al flujo post-ruminal de nutrientes al animal. En el experimento 1 (capítulo 2) se efectuaron cuatro ensayos in vitro para estudiar la influencia de distintos factores que puedan afectar la eficacia de estos tratamientos. En cada ensayo se utilizó una réplica por tratamiento (dos para el tratamiento control) y dos bolsas vacías (empleadas para corregir la contaminación microbiana) en cada una de las cuatro botellas del incubador (ANKOM Daisy II). Cada botella contenía 2 l de medio de incubación, saturado con CO2 para asegurar la anaerobiosis. Este medio consistió en una mezcla de solución McDougall y liquido ruminal filtrado en relación 4:1. El liquido ruminal fue obtenido de 2 corderos canulados en rumen, utilizándose bien solo o mezclado con el del otro cordero en una relación 3:1. Así, cada botella de incubación contenía un inoculo ruminal diferente. Las incubaciones se realizaron a 39 ºC durante 20 h, siendo las bolsas lavadas con agua corriente y almacenadas a -20 ºC. Tras ser descongeladas, se lavaron 3 veces durante 5 min en una mini-lavadora de turbina, se desecaron a 80 ºC durante 48 h y se destinaron íntegras al análisis de N-Kjeldahl. En el ensayo 1 se estudió el efecto del volumen de disolución de dos dosis de ácido ortofosfórico (0,4 y 1,2 equivalentes gramo (eq)/kg de harina de girasol), testando cinco volúmenes de disolución (80, 160, 240, 320 and 400 ml/kg de harina) para cada dosis, desecándose las harinas a 60 ºC hasta sequedad al tacto. La proteína bruta (PB) indegradada se incremento con la dosis de ácido empleada y también (como tendencia, P < 0,1) con el volumen de dilución. En base a ello en los siguientes ensayos se utilizo el volumen de dilución mayor (400 ml/kg). En el ensayo 2 se estudió el efecto de la dosis y del tipo de ácido a cuatro dosis (1,2; 2,4; 3,6 y 4,8 eq/kg), secándose igualmente las muestras tratadas a 60 ºC. La PB indegradada aumentó con la dosis de ácido, siendo también mayor para el ácido málico, tanto en este ensayo como en los posteriores. En el ensayo 3 se estudiaron los efectos de los dos ácidos, cuatro concentraciones (0,6; 1,2; 1,8 y 2,4 eq/kg) y tres tratamientos térmicos para el secado de las muestras (100, 150 and 200 ºC durante 60, 30 y 20 minutos, respectivamente). Con los tratamientos térmicos a 100 y 150 ºC no hubo un incremento de protección para concentraciones superiores a 0,8 eq/kg para ambos ácidos. Para incrementar la protección fue necesario aumentar la temperatura a 200 ºC y la dosis a 1,2 eq/kg, no observándose un aumento de protección a dosis mayores. En el ensayo 4 se estudiaron los efectos sobre la lisina disponible, la solubilidad de la PB en saliva artificial de McDougall y la PB indegradada in vitro de tratar la harina solo con agua o con disoluciones de ambos ácidos a dosis de 0,8 eq/kg y temperaturas de secado de 100 ó 150 ºC en las mismas condiciones que en el ensayo 3. No se apreciaron efectos sobre la lisina disponible para ninguno de los tratamientos. El efecto específico de los ácidos quedo demostrado tanto por la fuerte reducción de la solubilidad de la PB como por el aumento de la PB indegradada frente al tratamiento con agua. En conjunto, los resultados de este experimento mostraron que la eficacia de estos tratamientos depende del tipo y dosis de ácido y de su dilución, así como de las condiciones de secado. Como tratamiento de mayor interés a aplicar posteriormente en el experimento 2 se consideró una dosis de 0,8 eq/kg de harina, aplicada en un volumen de 400 ml/kg (correspondiente a soluciones 1 M y 0,67 M para los ácidos málico y ortofosfórico, respectivamente) y desecación a 150 ºC. El experimento 2 (capítulos 3 a 7) se realizó con un diseño en cuadrado latino 3x3, empleando tres corderos canulados en rumen y duodeno y tres dietas isoproteicas: U, M y P, que incluían harinas de girasol sin tratar (control) y tratadas con acido málico u ortofosfórico, respectivamente. La harina de girasol se trató en las condiciones ya indicadas siendo necesarias 6 horas para su secado en estufa. Las dietas incluían 40% de heno de raigrás italiano y 60% de concentrado a base de harina de girasol (tratada y/o sin tratar), trigo y corrector vitamínico-mineral, siendo suministradas a 75 g/kg P0.75 (equivalente a 2,3 × mantenimiento). La relación harina de girasol sin tratar y tratada fue de 100:0 en la dieta U y entorno a 40:60 en las dietas M y P. Tras 10 días de adaptación a la dieta, se estudiaron sucesivamente: i) el tránsito hasta el duodeno de las partículas del heno (solo en la dieta control) y de la harina de girasol marcadas previamente con europio e iterbio, respectivamente; ii) la fermentación ruminal durante el periodo postprandial, iii) la degradación ruminal in situ de la harina de girasol específica de cada dieta (y del trigo y el heno en la dieta control) y iv) la magnitud y composición del contenido ruminal mediante el vaciado manual del rumen-retículo. Durante todo el periodo experimental se infundio de forma continua una solución de sulfato amónico enriquecido en 15N (98 átomos %) para corregir la contaminación microbiana ruminal en los estudios in situ y para establecer las diferencias de composición química entre las bacterias libres (BAL) y adherentes (BAS) del rumen. Esta solución incluyó en los dos últimos días Li-Cr- EDTA para determinar la tasa de dilución ruminal. Posteriormente, y tras un periodo de al menos 10 días para eliminar el enriquecimiento en 15N de la digesta, se estudió la digestibilidad intestinal de los distintos alimentos mediante la técnica de bolsas móviles. La determinación del bypass (BP) o de la degradabilidad efectiva (DE) de la materia seca (MS) y de la PB se realizó por el método tradicional de integración matemática; estos valores se obtuvieron también para la PB y los AAs generando una muestra representativa del flujo post-ruminal del alimento en estudio en cada animal. Ello se realizó mediante la mezcla de los distintos residuos de incubación en base a la función que describe el flujo de alimento indegradado que abandona el rumen. Todos estos trabajos se realizaron considerando la tasa de salida de partículas del rumen (kp) y, según casos, considerando también la tasa de conminución y mezcla de las partículas en este compartimento (kc). Para este último caso se ha desarrollado también el modelo matemático que describe este flujo y permite este cálculo. Los valores no corregidos por la contaminación microbiana del BP (o de DE) de la PB resultantes de ambos métodos se han comparado tanto en las harinas de girasol como en los restantes alimentos de la dieta, obteniéndose valores similares, sin apreciarse desviaciones sistemáticas. Sobre las muestras compuestas representativas de la composición química del BP se determino la digestibilidad intestinal efectiva (DIE) de la MS, PB y AAs. Todos los valores resultantes de esta técnica fueron corregidos para la contaminación microbiana de las partículas que tiene lugar en el rumen. Los estudios de transito digestivo se realizaron tras suministrar en el comedero a los corderos una dosis simple de los alimentos marcados, seguida de la toma de muestras de la digesta duodenal durante 82 h. En la dieta testigo se suministraron simultáneamente el heno de raigrás y la harina de girasol, mientras que en las otras dietas solo se suministró esta última. La harina de girasol mostro un mayor valor para kc frente al heno (0,5766 v. 0,0892, /h), mientras que no hubo diferencias entre los dos alimentos para kp (0,0623 v. 0,0609, /h). Para la harina de girasol no se apreciaron diferencias entre dietas para kc, pero si se redujo de manera moderada la tasa kp con los tratamientos, siendo ésta también menor al utilizar ácido ortofosfórico frente al uso de ácido malico (0,0577 v. 0,0600, /h). El empleo de las harinas tratadas no modifico los parámetros de fermentación ruminal, la composición de los contenidos ruminales o la tasa de dilución del rumen. Los valores efectivos del BP y de DIE de la MS, PB y AAs de las harinas de girasol se obtuvieron considerando kc y kp, conjuntamente. Los tratamientos de protección incrementaron el BP de MS y PB en 48,5 y 268% de media, respectivamente. Estos incrementos se debieron principalmente al descenso de la fracción soluble y de la velocidad de degradación, pero también al aumento de la fracción indegradable, especialmente usando ácido ortofosfórico. Con los tratamientos se incrementó también la DIE de la MS (108% de media) y de la PB con gran diferencia entre los ácidos málico y ortofosfórico (20,7 v. 11,8%). Como consecuencia de estos cambios la protección aumentó la fracción realmente digerida en el intestino en 211% (MS) y 325% (PB), sin efectos entre ambos ácidos. Considerando la reducción del suministro de energía fermentable para los microorganismos ruminales asociada a la protección y los parámetros indicados por el sistema PDI francés para la síntesis de proteína microbiana digestible, la eficacia de conversión de PB en proteína metabolizable aumentó de 0,244 a 0,559 y 0,515 con el tratamiento con acido málico y ortofosfórico, respectivamente. El contenido en aminoácidos (AAs) fue similar en todas las harinas salvo por una disminución de lisina en las harinas tratadas. De forma análoga a la PB, los tratamientos de protección incrementaron el BP y la DIE de la mayoría de AAs. El aporte de AAs metabolizabes de la harina se multiplico en 3,87 para los AAs azufrados y en menor medida (2,5 veces) para la lisina, como consecuencia de las pérdidas sufridas a consecuencia del tratamiento térmico. Estos tratamientos se muestran, por tanto, útiles para incrementar el valor proteico de la harina de girasol, si bien su empleo junto con concentrados proteicos ricos en lisina bypass digestible mejoraría el perfil de la proteína metabolizable. La corrección de la contaminación microbiana de las partículas que tiene lugar en el rumen se asoció en todos los alimentos testados y, de forma general, con reducciones del BP y de su DIE en todas las fracciones estudiadas. Estas reducciones fueron pequeñas en todos los concentrados, de forma acorde con los muy pequeños niveles de contaminación registrados tanto en las harinas de girasol como en el grano de trigo. Por el contrario, esta contaminación, al igual que los efectos de su corrección, fueron muy importantes en el heno de raigrás. Esta contaminación aumentó al tener en cuenta kc. Así, para la proporción de PB de origen microbiano existente en las muestras compuestas representativas del BP, este aumento fue significativo para el heno de raigrás (0,463 v. 0,706) y solo numérico para la harina de girasol (0,0170 v. 0,0208). La reducción de las estimas de DIE al corregir esta contaminación fue consecuencia de la eliminación de forma casi completa de los microorganismos adherentes en todos los residuos testados. Así, esta biomasa se redujo en 96,1% como media de 7x3 observaciones. Como resultado de las diferencias acumulativas a nivel del rumen e intestino, la no corrección de la contaminación microbiana junto con la no consideración de kc condujo a fuertes sobrestimaciones de la PB digerida en el intestino. Ésta fue de 39% en la harina de girasol (0,146 v. 0,105) y de 761% en el heno de raigrás (0,373 v. 0,0433). Estos resultados muestran que es necesario considerar tanto kc como corregir la contaminación microbiana para obtener estimas in situ precisas en forrajes, mientras que en concentrados, siempre que la contaminación microbiana sea pequeña, es más importante considerar kc. La elevada contaminación microbiana observada en el heno de raigrás se asoció también con importantes errores a nivel del N asociado a la fibra neutro (FND) y ácido (FAD) detergente (NDIN y ADIN, respectivamente) e incluso de estas fracciones de fibra, evidenciándose que estos métodos no eliminan completamente la contaminación microbiana que sufren los alimentos en su paso por el retículorumen. Así, en la muestra compuesta representativa de la composición química del flujo postruminal antes descrita, la sobrevaloración por no corregir la contaminación microbiana fue de 99,8; 24,2; 3,34 y 0,48% para NDIN, ADIN, FND y FAD, respectivamente. Las subvaloraciones asociadas para su DE fueron 34,1; 8,79; 4,41 y 0,51%, respectivamente. La DE corregida del NDIN y ADIN (0,743 y 0,728, respectivamente) mostró un aprovechamiento ruminal elevado de estos compuestos, si bien menor al de la PB total (0,85). El estudio de este aprovechamiento sobre los residuos de incubación ruminal a 6 y 72 h demostró, además, una más rápida degradación del ADIN frente al NDIN, así como un mayor potencial de degradación de este último en este alimento. Para comprobar si la digestión en el abomaso eliminaba la contaminación microbiana en la FND y FAD se estudio esta contaminación y sus posibles errores en muestras liofilizadas de contenidos ruminales y duodenales correspondientes a una dieta mixta de similar composición a la utilizada en el experimento 2, comparándose, además, las diferencias entre la extracción secuencial o directa de la FAD. Utilizando como referencia las BAS se apreciaron elevadas contaminaciones en la FND y FAD y su N asociado tanto en las muestras ruminales como en las duodenales. Sin embargo, los resultados de enriquecimiento en 15N de las partículas fueron intermedios entre los correspondientes a BAS y BAL lo que evidencia una elevada contaminación con BAL en estas muestras probablemente durante el proceso de liofilización. Ello conlleva una sobrevaloración de esta estimación. El método de extracción directa de FAD se mostró, por otra parte, marcadamente menos eficaz en la eliminación de la contaminación microbiana. Los resultados muestran la necesidad de corregir la contaminación microbiana para obtener estimaciones precisas de la degradabilidad de las proteínas de las paredes celulares vegetales. Estos errores deberían ser también considerados para FND y FAD en estudios in situ e in vivo. La elevada tasa fraccional de degradación del grano de trigo (60,9 y 42,0%/h para MS y PB, respectivamente) implico que su flujo de material indegradado (calculado solo en base a la kp obtenida para la harina de girasol) se redujera muy rápidamente, de forma que es casi nulo a 8 h tras la ingestión. Los valores corregidos de PB digerida en el intestino (0,15) representan solo el 18,7% de la proteína metabolizable, lo que muestra que el valor proteico del grano de trigo está estrechamente ligado a la síntesis de proteína microbiana derivada de su fermentación. En el experimento 2 se observaron menores concentraciones para materia orgánica, lípidos y PB, así como en la proporción N-AAs/N total en BAL que en BAS, siendo, por el contrario, mayor su enriquecimiento en 15N. Estos últimos resultados se utilizaron (junto con los de otros trabajos previos de este equipo) para validar una predicción preexistente del enriquecimiento en 15N de las BAS a partir de este valor en las BAL. Esta ecuación, de muy alta precisión (R2 = 0.995), permite calcular la subvaloración que se comete en los aportes de nutrientes correspondientes a las BAS al usar las BAL como muestra de referencia. Esta subvaloración representa aproximadamente 21, 32,5 y 60% para PB, proteína verdadera y lípidos.

Inference Models in DNA Computing

La computación molecular es una disciplina que se ocupa del diseño e implementación de dispositivos para el procesamiento de información sobre un sustrato biológico, como el ácido desoxirribonucleico (ADN), el ácido ribonucleico (ARN) o las proteínas. Desde que Watson y Crick descubrieron en los años cincuenta la estructura molecular del ADN en forma de doble hélice, se desencadenaron otros descubrimientos, como las enzimas de restricción o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), contribuyendo de manera determinante a la irrupción de la tecnología del ADN recombinante. Gracias a esta tecnología y al descenso vertiginoso de los precios de secuenciación y síntesis del ADN, la computación biomolecular pudo abandonar su concepción puramente teórica. El trabajo presentado por Adleman (1994) logró resolver un problema de computación NP-completo (El Problema del Camino de Hamilton dirigido) utilizando únicamente moléculas de ADN. La gran capacidad de procesamiento en paralelo ofrecida por las técnicas del ADN recombinante permitió a Adleman ser capaz de resolver dicho problema en tiempo polinómico, aunque a costa de un consumo exponencial de moléculas de ADN. Utilizando algoritmos de fuerza bruta similares al utilizado por Adleman se logró resolver otros problemas NP-completos, como por ejemplo el de Satisfacibilidad de Fórmulas Lógicas / SAT (Lipton, 1995). Pronto se comprendió que la computación biomolecular no podía competir en velocidad ni precisión con los ordenadores de silicio, por lo que su enfoque y objetivos se centraron en la resolución de problemas con aplicación biomédica (Simmel, 2007), dejando de lado la resolución de problemas clásicos de computación. Desde entonces se han propuesto diversos modelos de dispositivos biomoleculares que, de forma autónoma (sin necesidad de un bio-ingeniero realizando operaciones de laboratorio), son capaces de procesar como entrada un sustrato biológico y proporcionar una salida también en formato biológico: procesadores que aprovechan la extensión de la polimerasa (Hagiya et al., 1997), autómatas que funcionan con enzimas de restricción (Benenson et al., 2001) o con deoxiribozimas (Stojanovic et al., 2002), o circuitos de hibridación competitiva (Yurke et al., 2000). Esta tesis presenta un conjunto de modelos de dispositivos de ácidos nucleicos capaces de implementar diversas operaciones de computación lógica aprovechando técnicas de computación biomolecular (hibridación competitiva del ADN y reacciones enzimáticas) con aplicaciones en diagnóstico genético. El primer conjunto de modelos, presentados en el Capítulo 5 y publicados en Sainz de Murieta and Rodríguez-Patón (2012b), Rodríguez-Patón et al. (2010a) y Sainz de Murieta and Rodríguez-Patón (2010), define un tipo de biosensor que usa hebras simples de ADN para codificar reglas sencillas, como por ejemplo "SI hebra-ADN-1 Y hebra-ADN-2 presentes, ENTONCES enfermedad-B". Estas reglas interactúan con señales de entrada (ADN o ARN de cualquier tipo) para producir una señal de salida (también en forma de ácido nucleico). Dicha señal de salida representa un diagnóstico, que puede medirse mediante partículas fluorescentes técnicas FRET) o incluso ser un tratamiento administrado en respuesta a un conjunto de síntomas. El modelo presentado en el Capítulo 5, publicado en Rodríguez-Patón et al. (2011), es capaz de ejecutar cadenas de resolución sobre fórmulas lógicas en forma normal conjuntiva. Cada cláusula de una fórmula se codifica en una molécula de ADN. Cada proposición p se codifica asignándole una hebra simple de ADN, y la correspondiente hebra complementaria a la proposición ¬p. Las cláusulas se codifican incluyendo distintas proposiciones en la misma hebra de ADN. El modelo permite ejecutar programas lógicos de cláusulas Horn aplicando múltiples iteraciones de resolución en cascada, con el fin de implementar la función de un nanodispositivo autónomo programable. Esta técnica también puede emplearse para resolver SAP sin ayuda externa. El modelo presentado en el Capítulo 6 se ha publicado en publicado en Sainz de Murieta and Rodríguez-Patón (2012c), y el modelo presentado en el Capítulo 7 se ha publicado en (Sainz de Murieta and Rodríguez-Patón, 2013c). Aunque explotan métodos de computación biomolecular diferentes (hibridación competitiva de ADN en el Capítulo 6 frente a reacciones enzimáticas en el 7), ambos modelos son capaces de realizar inferencia Bayesiana. Funcionan tomando hebras simples de ADN como entrada, representando la presencia o la ausencia de un indicador molecular concreto (una evidencia). La probabilidad a priori de una enfermedad, así como la probabilidad condicionada de una señal (o síntoma) dada la enfermedad representan la base de conocimiento, y se codifican combinando distintas moléculas de ADN y sus concentraciones relativas. Cuando las moléculas de entrada interaccionan con las de la base de conocimiento, se liberan dos clases de hebras de ADN, cuya proporción relativa representa la aplicación del teorema de Bayes: la probabilidad condicionada de la enfermedad dada la señal (o síntoma). Todos estos dispositivos pueden verse como elementos básicos que, combinados modularmente, permiten la implementación de sistemas in vitro a partir de sensores de ADN, capaces de percibir y procesar señales biológicas. Este tipo de autómatas tienen en la actualidad una gran potencial, además de una gran repercusión científica. Un perfecto ejemplo fue la publicación de (Xie et al., 2011) en Science, presentando un autómata biomolecular de diagnóstico capaz de activar selectivamente el proceso de apoptosis en células cancerígenas sin afectar a células sanas.

Potenciación de la respuesta productiva en rumiantes mediante el empleo de proteínas protegidas

El principal objetivo de esta tesis fue incrementar la eficiencia proteica en las dietas de rumiantes mediante el uso de proteínas protegidas (harina de girasol y guisante de primavera), así como mejorar la predicción de los aportes de proteína microbiana. Una partida de harinas comerciales de girasol (HG) y de guisante de primavera (GP) fueron tratadas con soluciones 4 N de ácido málico (268,2 g/L) o ácido ortofosfórico (130,6 g/L). Para cada harina, ácido y día de tratamiento, dos fracciones de 12,5 kg fueron pulverizadas sucesivamente en una hormigonera con la solución de ácido correspondiente mediante un pulverizador de campo. Las dos fracciones fueron mezcladas posteriormente y se dejaron reposar durante 1 h a temperatura ambiente. La mezcla fue luego secada en una estufa de aire forzado a 120 ºC durante 1 h. La estufa fue apagada inmediatamente después y el material tratado se mantuvo dentro de ésta hasta la mañana siguiente. El material fue removido durante el proceso de secado cada 30 min durante las primeras 2 h y cada 60 min durante las 5 h posteriores. Este proceso se repitió hasta conseguir las cantidades de harinas tratadas necesarias en los distintos ensayos. En el primer experimento (capitulo 3) se llevaron a cabo estudios de digestión ruminal e intestinal para evaluar los efectos de la aplicación de las soluciones ácidas indicadas y calor a fin de proteger las proteínas de HG y GP contra la degradación ruminal. Estos estudios se realizaron con tres corderos canulados en el rumen y en el duodeno. El estudio de digestión ruminal fue realizado en tres periodos experimentales en los que los corderos fueron alimentados sucesivamente con tres dietas isoproteicas que incluían HG y GP, sin tratar o tratadas con ácidos málico u ortofosfórico. Cada periodo experimental de 21 días incluyó sucesivamente: 10 días de adaptación a las dietas, un estudio del tránsito ruminal de las partículas de HG y GP (días 11 a 14), y la incubación de las muestras de ambos alimentos en bolsas de nailon (días 15–21). Las harinas incubadas en cada periodo experimental correspondieron a las que fueron incluidas en las dietas. Las bacterias ruminales fueron marcadas desde el día 11 hasta el día 21 del periodo experimental mediante infusión intra-ruminal continua con una fuente de 15N. Tras finalizar las incubaciones in situ el día 21 el rumen fue vaciado en cada periodo para aislar las bacterias asociadas a la fase sólida y liquida del rumen. El estudio de digestión intestinal fue realizado veinte días después del final del estudio ruminal a fin de eliminar el enriquecimiento en 15N de la digesta. En este estudio se incubaron muestras compuestas obtenidas mediante la combinación de los diferentes residuos no degradados en el rumen de forma que fuesen representativas de la composición química de la fracción no degradada en el rumen (RU). En esta fase los corderos fueron alimentados con la dieta sin tratar para determinar la digestibilidad de las harinas tanto tratadas como sin tratar mediante la técnica de las bolsas móviles. Además, las proteínas contenidas en las harinas tratadas y sin tratar, así como en las muestras correspondientes a los residuos a 0 h, las muestras compuestas anteriormente indicadas y las muestras no digeridas intestinalmente fueron extraídas y sometidas a electroforesis para determinar el sitio de digestión de las diferentes fracciones proteicas. Las estimaciones de la RU y la digestibilidad intestinal de la materia seca, la materia orgánica (solamente para RU), la proteína bruta (PB) y el almidón (solamente en GP) fueron obtenidos considerando la contaminación microbiana y las tasas de conminución y salida de partículas. Las estimaciones de RU y de la digestibilidad intestinal disminuyeron en todas las fracciones evaluadas de ambos alimentos al corregir por la contaminación microbiana acaecida en el rumen. Todas las estimaciones de RU aumentaron con los tratamientos de protección, incrementándose también la digestibilidad intestinal de la materia seca en la HG. Los bajos valores de la digestibilidad de la proteína de GP tratado y sin tratar sugieren la presencia de algún factor antitripsico no termolábil es esta harina. Los tratamientos de protección incrementaron consistentemente la fracción de materia seca y PB digerida intestinalmente en los dos alimentos, mientras que la fracción de almidón en la muestra de GP solamente aumentó numéricamente (60,5% de media). Sin embargo, los tratamientos también redujeron la fermentación de la materia orgánica, lo cual podría disminuir la síntesis de proteína microbiana. Los estudios de electroforesis muestran la práctica desaparición de la albumina por la degradación ruminal en ambos alimentos, así como que los cambios en otras proteínas de la muestra RU fueron más pronunciados en GP que en HG. La composición de las bacterias asociadas con las fases de digesta ruminal sólida (BAS) y líquida (BAL) fue estudiada para revisar la precisión de un sistema de predicción previo que determinaba la infravaloración del aporte de nutrientes correspondiente a las BAS cuando de usa 15N como marcador y las BAL como referencia microbiana (capitulo 4). Al comparar con BAS, BAL mostraron menores contenidos en materia orgánica, polisacáridos de glucosa y lípidos totales y un mayor contenido en PB, así como un mayor enriquecimiento en 15N. Los datos obtenidos en el estudio actual se ajustan bien a la ecuación previa que predice el enriquecimiento en 15N de las BAS a partir del mismo valor en BAL. Esta nueva ecuación permite establecer que se produce una infravaloración de un 22% en el aporte de PB al animal a partir de las BAS sintetizadas si las BAL son usadas como muestras de referencia. Una segunda relación calculada utilizando los valores medios por dieta expuestos en numerosos trabajos encontrados en la literatura confirma la magnitud de este error. Esta infravaloración asociada al uso de BAL como referencia fue mayor para el aporte de glucosa (43,1%) y todavía mayor para el aporte de lípidos (59,9%), como consecuencia de los menores contenidos de ambas fracciones en BAL frente a SAB. Estos errores deberían ser considerados para obtener mayor precisión en la estimación del aporte de nutrientes microbianos y mejorar la nutrición de los rumiantes. En el experimento 2 se realizó un estudio de producción (capitulo 5) para evaluar los efectos del tratamiento de las harinas HG y GP con soluciones de ácido málico o ácido ortofosfórico sobre el crecimiento, el consumo de concentrado y el rendimiento y engrasamiento de las canales de corderos de engorde. Noventa corderos machos de cruce entrefino procedentes de tres granjas comerciales (peso inicial medio = 14,6, 15,3 y 13,3 kg, respectivamente) fueron asignados aleatoriamente a cinco dietas con diferentes niveles de proteína y diferentes tratamientos con ácidos y engordados hasta un peso medio al sacrificio de 25 kg. Las fuentes de proteína en el pienso control (C; PB=18,0%) fueron harina de soja, HG y GP sin tratar. En tres de los piensos experimentales, las harinas tratadas con ácido ortofosfórico sustituyeron a las de HG y GP sin tratar (Control Ortofosfórico, PC; PB=18,0% sobre materia seca), sustituyéndose, además, la harina de soja parcialmente (Sustitución Media Ortofosfórico, MSP; PB=16,7%) o totalmente (Sustitución Total Ortofosfórico, TSP; PB=15,6%). Finalmente, en uno de los piensos el ácido ortofosfórico fue reemplazo por acido málico para proteger ambas harinas (Sustitución Media Málico, MSM; PB= 16,7%). La paja de trigo (fuente de forraje) y el concentrado fueron ofrecidos ad libitum. Dieciocho corderos fueron distribuidos en seis cubículos con tres animales para cada dieta. Los datos fueron analizados según un análisis factorial considerando el peso inicial como covariable y la granja de procedencia como bloque. Los datos de consumo de concentrado y eficiencia de conversión fueron analizados usando el cubículo como unidad experimental, mientras que los datos sobre ganancia media diaria, rendimiento a la canal, grasa dorsal y grasa pélvico renal fueron analizados usando el cordero como unidad experimental. No se encontró ningún efecto asociado con el nivel de PB sobre ninguna variable estudiada. Esto sugiere que usando proteínas protegidas es posible utilizar concentrados con 15,6% de PB (sobre materia seca) disminuyendo así la cantidad de concentrados de proteína vegetal a incluir en los piensos y la calidad de los concentrados proteicos. Los corderos alimentados con la dieta MSM tuvieron mayores ganancias medias diarias (15,2%; P= 0,042), y mejores rendimiento a la canal en caliente (1,3 unidades porcentuales; P= 0,037) que los corderos alimentados con el concentrado MSP. Esto podría ser explicado por los efectos benéficos ruminales del malato o por el mayor efecto de protección conseguido con el ácido málico. ABSTRACT The main objective of this thesis project was to increase the protein efficiency in ruminant diets by using protected protein (sunflower meal and spring pea), and improving the prediction of microbial protein supply. Commercial sunflower meal (SFM) and spring pea (SP) were treated with 4 N solutions (200 mL/kg) of malic acid (268.2 g/L) or orthophosphoric acid (130.6 g/L). Daily, two fractions of 12.5 kg of one of these meals were successively sprayed with the tested acid solution in a concrete mixer using a sprayer. Both fractions were then mixed and allowed to rest for 1 h at room temperature. The blend was then dried in a forced air oven at 120 ºC for 1 h. Then the oven was turned off and the treated material was left in the oven overnight. During the drying process, the material was stirred every 30 min during the first 2 h and then every 60 min for the subsequent 5 h. This process was repeated until the amounts of treated flour needed for the different trials performed. In the first experiment (chapter 3), ruminal and intestinal digestion trials were conducted to study the effects of the application of these acid solutions and heat to protect proteins of SFM and SP against ruminal degradation using three wethers fitted with rumen and duodenum cannulae. The ruminal digestion study was carried out in three experimental periods in which the wethers were successively fed three isoproteic diets including SFM and SP, untreated or treated with malic or orthophosphoric acids. The experimental periods of 21 days included successively: 10 days of diet adaptation, SFM and SP particle ruminal transit study (days 11–14) and ruminal nylon-bag incubations (days 15–21). The meals incubated in each experimental period were those corresponding to the associated diet. Rumen bacteria were labelled from days 11 to 21 by continuous intra-ruminal infusion of a 15N source and the rumen was emptied at the end of in situ incubations in each period to isolate solid adherent bacteria and liquid associate bacteria. The intestinal digestion trial was conducted twenty days after the end of the ruminal studies to eliminate the 15N enrichment in the digesta. The tested samples were composite samples obtained pooling the different ruminally undegraded residues to be representative of the chemical composition of the ruminally undegraded fraction (RU). Wethers were fed the untreated diet to determine the intestinal digestibility of untreated and treated meals using the mobile nylon bag technique. In addition, protein in untreated and treated meals and their 0 h, composite and intestinally undigested samples were extracted and subjected to electrophoresis to determine the digestion site of the different protein fractions. Estimates of the RU and its intestinal digestibility of dry matter, organic matter (only for RU), crude protein (CP) and starch (only in SP) were obtained considering ruminal microbial contamination and particle comminution and outflow rates. When corrected for the microbial contamination taking place in the rumen, estimates of RU and intestinal digestibility decreased in all tested fractions for both feeds. All RU estimates increased with the protective treatments, whereas intestinal digestibility-dry matter also increased in SFM. Low intestinal digestibility-CP values in untreated and treated samples suggested the presence of non-heat labile antitrypsin factors in SP. Protective treatments of both feeds led to consistent increases in the intestinal digested fraction of dry matter and CP, being only numerically different for SP-starch (60.5% as average). However, treatments also reduced the organic matter fermentation, which may decrease ruminal microbial protein synthesis. Electrophoretic studies showed albumin disappearance in both SFM and SP, whereas changes in other RU proteins were more pronounced in SP than SFM. The chemical composition of bacteria associated with solid (SAB) and liquid (LAB) rumen-digesta phases was studied to examine the accuracy of a previous regression system determining the underevaluation of SAB-nutrient supply using 15N as marker and LAB as microbial reference (chapter 4). Compared with SAB, LAB showed lower contents of organic matter, polysaccharide-glucose and total lipids and the opposite for the CP content and the 15N enrichment. Present data fitted well to the previous relationship predicting the 15N enrichment of SAB from the same value in LAB. This new equation allows establishing an underevaluation in the supply of CP from the synthesized SAB in 22.0% if LAB is used as reference. Another relationship calculated using mean diet values from the literature confirmed the magnitude of this error. This underevaluation was higher for the supply of glucose (43.1%) and still higher for the lipid supply (59.9%) as a consequence of the lower contents of these both fractions in LAB than in SAB. These errors should be considered to obtain more accurate estimates of the microbial nutrient supply and to improve ruminant nutrition. A production study was performed in experiment 2 (chapter 5) to examine the effects of treating SFM and SP meals with orthophosphoric or malic acid solutions on growth performance, concentrate intake, and carcass yield and fatness of growing-fattening lambs. Ninety "Entrefino" cross male lambs from three commercial farms (average initial body weights (BW) = 14.6, 15.3 and 13.3 kg) were randomly assigned to five diets with different acid treatment and protein levels, and fattened to an average slaughter weight of 25 kg. Protein sources in the control concentrate (C; CP=18%) were soybean meal and untreated SFM and SP. In three of the experimental concentrates, orthophosphoric acid-treated meals substituted untreated SFM and SP (Orthophosphoric Control, PC; CP=18% dry matter basis), and soybean meal was partially (Medium Substitution Orthophosphoric, MSP; CP=16.7%) or totally removed (Total Substitution Orthophosphoric, TSP; CP=15.6%). In addition, in one concentrate orthophosphoric acid was replaced by malic acid to protect these meals (Medium Substitution Malic, MSM; CP= 16.7%). Wheat straw (roughage source) and concentrate were offered ad libitum. Eighteen lambs were allocated to six pens of three animals on each diet. Data were analyzed using a factorial analysis with initial body weight BW as covariate and farm of origin as block. Data on concentrate intake and feed conversion efficiency were analyzed using pen as experimental unit, while data on average daily gain, carcass yield, dorsal fat, and kidney-pelvic-fat were analyzed with lamb as experimental unit. No effect associated with the CP level was observed on any parameter. This suggests that with protected proteins it is possible to feed concentrates with 15.6% CP (dry matter basis) reducing the quantity of vegetable protein meals to include in the concentrate as well as the quality of the protein concentrates. Lambs feed MSM had higher average daily gains (15.2%; P= 0.042), and better hot carcass yields (1.3 percentage points; P= 0.037) than lambs feed MSP. This probably can be explained by ruminal malate actions and by greater protection effects obtained with malic acid.

Sistema autónomo para carga de baterías mediante una instalación fotovoltaica con aplicación directa al vehículo eléctrico y usos

La situación energética actual es insostenible y como consecuencia se plantea un escenario próximo orientado a conseguir un futuro energético sostenible que permita el desarrollo económico y el bienestar social. La situación ambiental actual está afectada directamente por la combustión de combustibles fósiles que en 2013 constituyeron el 81% de la energía primaria utilizada por el ser humano y son la principal fuente antropogénica de gases de efecto invernadero. Los informes del IPCC1, ponen de manifiesto que el cambio climático se ha consolidado durante los últimos años y en la conferencia de la ONU sobre cambio climático de París que se celebrará a finales de 2015, se pretende que los gobiernos suscriban un acuerdo universal para limitar las emisiones de gases de efecto invernadero y evitar que el incremento de la temperatura media global supere los 2°C. Por otra parte, en el interior de las ciudades es especialmente preocupante, por su efecto directo sobre la salud humana, el impacto ambiental producido por las emisiones de NOx que generan el transporte de personas y mercancías. El sector del transporte fue responsable en 2012 del 27,9% del consumo final de energía. Una vez expuesto el escenario energético y ambiental actual, en esta tesis, se analiza la eficiencia de un sistema autónomo fotovoltaico para la carga de baterías de vehículos eléctricos y el uso del mismo con otras cargas, con el objetivo de aprovechar al máximo la energía eléctrica generada y contribuir a la utilización de energía limpia que no produzca impacto ambiental. Como primer paso para el desarrollo de la tesis se hizo un estudio de trabajos previos comenzando por las primeras aplicaciones de la energía fotovoltaica en los vehículos solares para después pasar a trabajos más recientes enfocados al suministro de energía a los vehículos eléctricos. También se hizo este estudio sobre las metodologías de simulación en los sistemas fotovoltaicos y en el modelado de distintos componentes. Posteriormente se eligieron, dentro de la amplia oferta existente en el mercado, los componentes con características técnicas más adecuadas para este tipo de instalaciones y para las necesidades que se pretenden cubrir. A partir de los parámetros técnicos de los componentes elegidos para configurar la instalación autónoma y utilizando modelos contrastados de distintos componentes, se ha desarrollado un modelo de simulación en ordenador del sistema completo con el que se han hecho simulaciones con distintos modos de demanda de energía eléctrica, según los modos de carga disponibles en el vehículo eléctrico para corriente alterna monofásica de 230 V. También se han simulado distintos tamaños del generador fotovoltaico y del sistema de acumulación de energía eléctrica para poder determinar la influencia de estos parámetros en los balances energéticos del sistema. Utilizando recursos propios el doctorando ha realizado la instalación real de un sistema fotovoltaico que incluye sistema de acumulación e inversor en un edificio de su propiedad. Para la realización de la tesis, La Fundación de Fomento e Innovación Industrial (F2I2) ha facilitado al doctorando un dispositivo que permite realizar la alimentación del vehículo eléctrico en modo 2 (este modo emplea un adaptador que incorpora dispositivos de seguridad y se comunica con el vehículo permitiendo ajustar la velocidad de recarga) y que ha sido necesario para los trabajos desarrollados. Se ha utilizado la red eléctrica como sistema de apoyo de la instalación fotovoltaica para permitir la recarga en el modo 2 que requiere más potencia que la proporcionada por el sistema fotovoltaico instalado. Se han analizado mediante simulación distintos regímenes de carga que se han estudiado experimentalmente en la instalación realizada, a la vez que se han hecho ensayos que se han reproducido mediante simulación con los mismos valores de radiación solar y temperatura con objeto de contrastar el modelo. Se han comparado los resultados experimentales con los obtenidos mediante simulación con objeto de caracterizar el comportamiento del sistema de acumulación (energía eléctrica suministrada y tensión de salida en las baterías) y del generador fotovoltaico (energía eléctrica fotovoltaica suministrada). Por último, se ha realizado un estudio económico de la instalación autónoma fotovoltaica ejecutada y simulada. En el mismo se ha planteado la utilización de fondos propios (como realmente se ha llevado a cabo) y la utilización de financiación, para determinar dos posibles escenarios que pudieran ser de utilidad a un propietario de vehículo eléctrico. Se han comparado los resultados obtenidos en los dos escenarios propuestos del estudio económico del sistema, en cuanto a los parámetros de tiempo de retorno de la inversión, valor actual neto de la inversión y tasa interna de retorno de la misma. Las conclusiones técnicas obtenidas, permiten la utilización del sistema con los modos de carga ensayados y otro tipo de cargas que aprovechen la generación eléctrica del sistema. Las baterías ofrecen mejor comportamiento cuando el aporte fotovoltaico está presente, pero no considera adecuado la conexión de cargas elevadas a un sistema de acumulación de gel (plomo-acido) como el que se ha utilizado, debido al comportamiento de este tipo de baterías ante demandas de intensidad de corriente eléctrica elevadas. Por otra parte, el comportamiento de este tipo de baterías con valores de intensidad de corriente eléctrica inferiores a 10 A en ausencia de energía fotovoltaica, con el objetivo de utilizar la generación de energía eléctrica diaria acumulada en el sistema, sí resulta interesante y ofrece un buen comportamiento del sistema de acumulación. Las circunstancias actuales de mercado, que carece de sistemas de acumulación de litio con precios de compra interesantes, no han permitido poder experimentar este sistema de acumulación en la instalación autónoma fotovoltaica ejecutada, tampoco se ha podido obtener el favor de ningún fabricante para ello. Actualmente hay disponibles sistemas de acumulación en litio que no se comercializan en España y que serían adecuados para el sistema de acumulación de energía propuesto en este estudio, que deja abierta las puertas para futuros trabajos de investigación. Las conclusiones económicas obtenidas, rentabilizan el uso de una instalación autónoma fotovoltaica con consumo instantáneo, sin acumulación de energía eléctrica. El futuro de conexión a red por parte de estas instalaciones, cuando se regule, aportará un incentivo económico para rentabilizar con menos tiempo las instalaciones autónomas fotovoltaicas, esto también deja la puerta abierta a futuros trabajos de investigación. El sistema de acumulación de energía aporta el mayor peso económico de inversión en este tipo de instalaciones. La instalación estudiada aporta indicadores económicos que la hacen rentable, pero se necesitaría que los precios de acumulación de la energía en sistemas eficientes estén comprendidos entre 100-200 €/kWh para que el sistema propuesto en este trabajo resulte atractivo a un potencial propietario de un vehículo eléctrico. ABSTRACT The current energy situation is untenable; it poses a scenario next focused on reaching a sustainable energy future, to allow economic development and social welfare. The environmental current situation is affected directly by the combustion of fossil fuels that in 2013 constituted 81 % of the primary energy used by the human being and they are the principal source human of greenhouse gases. The reports of the IPCC2, they reveal that the climate change has consolidated during the last years and in the conference of the UNO on climate change of Paris that will be celebrated at the end of 2015, there is claimed that the governments sign a universal agreement to limit the emission of greenhouse gases and to prevent that the increase of the global average temperature overcomes them 2°C. On the other hand, inside the cities it is specially worrying, for his direct effect on the human health, the environmental impact produced by the NOx emissions that generate the persons' transport and goods. The sector of the transport was responsible in 2012 of 27,9 % of the final consumption of energy. Once exposed the scenario and present environmental energy, in this thesis, it has analyzed the efficiency of an autonomous photovoltaic system for charging electric vehicles, and the use of the same with other workloads, with the objective to maximize the electrical energy generated and contribute to the use of clean energy that does not produce environmental impact. Since the first step for the development of the thesis did to itself a study of previous works beginning for the first applications of the photovoltaic power in the solar vehicles later to go on to more recent works focused on the power supply to the electrical vehicles. Also this study was done on the methodologies of simulation in the photovoltaic systems and in the shaped one of different components. Later they were chosen, inside the wide existing offer on the market, the components with technical characteristics more adapted for this type of facilities and for the needs that try to cover. From the technical parameters of the components chosen to form the autonomous installation and using models confirmed of different components, a model of simulation has developed in computer of the complete system with which simulations have been done by different manners of demand of electric power, according to the available manners of load in the electrical vehicle for single-phase alternating current of 230 V. Also there have been simulated different sizes of the photovoltaic generator and of the system of accumulation of electric power to be able to determine the influence of these parameters in the energy balances of the system. Using own resources the PhD student has realized a real installation of a photovoltaic system that includes system of accumulation and investing in a building of his property. For the accomplishment of the thesis, The Foundation of Promotion and Industrial Innovation (F2I2) it has facilitated to the PhD student a device that allows to realize the supply of the electrical vehicle in way 2 (this way uses an adapter that incorporates safety devices and communicates with the vehicle allowing to fit the speed of recharges) and that has been necessary for the developed works. The electrical network has been in use as system of support of the photovoltaic installation for allowing it her recharges in the way 2 that more power needs that provided by the photovoltaic installed system. There have been analyzed by means of simulation different rate of load that have been studied experimentally in the realized installation, simultaneously that have done to themselves tests that have reproduced by means of simulation with the same values of solar radiation and temperature in order the model contrasted. The experimental results have been compared by the obtained ones by means of simulation in order to characterize the behavior of the system of accumulation (supplied electric power and tension of exit in the batteries) and of the photovoltaic generator (photovoltaic supplied electric power). Finally, there has been realized an economic study of the autonomous photovoltaic executed and simulated installation. In the same one there has appeared the utilization of own funds (since really it has been carried out) and the utilization of financing, to determine two possible scenes that could be of usefulness to an owner of electrical vehicle. There have been compared the results obtained in both scenes proposed of the economic study of the system, as for the parameters of time of return of the investment, current clear value of the investment and rate hospitalizes of return of the same one. The technical obtained conclusions, they make the utilization of the system viable with the manners of load tested and another type of loads of that they take advantage the electrical generation of the system. The batteries offer better behavior when the photovoltaic contribution is present, but he does not consider to be suitable the connection of loads risen up to a system of accumulation of gel (lead - acid) as the one that has been in use, due to the behavior of this type of batteries before demands of intensity of electrical current raised. On the other hand, the behavior of this type of batteries with low values of intensity of electrical current to 10 To in absence of photovoltaic power, with the aim to use the generation of daily electric power accumulated in the system, yes turns out to be interesting and offers a good behavior of the system of accumulation. The current circumstances of market, which lacks systems of accumulation of lithium with interesting purchase prices, have not allowed to be able to experience this system of accumulation in the autonomous photovoltaic executed installation, neither one could have obtained the favor of any manufacturer for it. Nowadays there are available systems of accumulation in lithium that is not commercialized in Spain and that they would be adapted for the system of accumulation of energy proposed in this study, which makes the doors opened for future works of investigation. The economic obtained conclusions; they make more profitable the use of an autonomous photovoltaic installation with instantaneous consumption, without accumulation of electric power. The future of connection to network on the part of these facilities, when it is regulated, will contribute an economic incentive to make profitable with less time the autonomous photovoltaic facilities, this also leaves the door opened for future works of investigation. The system of accumulation of energy contributes the major economic weight of investment in this type of facilities. The studied installation contributes economic indicators that make her profitable, but it would be necessary that the prices of accumulation of the energy in efficient systems are understood between 100-200 € in order that the system proposed in this work turns out to be attractive to a proprietary potential of an electrical vehicle.

Heterogeneous catalysts for environmentally sustainable reactions

This PhD work deals with problems of synthetic organic chemistry with particular attention to the development of environmentally friendly processes. In particular, new synthetic strategies have been studied based on the use of low cost heterogeneous catalysts, non-toxic reagents and mild operating conditions that do not involve, when possible, the use of solvents. The catalysts examined are both basic and acids, commercial or prepared by hetereogenization of homogeneous catalysts synthesized by tethering or impregnation. In particular it will be discussed the catalytic activity of oxides (Al2O3 and TiO2), supported sulphonic acids and hydrotalcites for the reactions of selective monoesterificazion of dicarboxylic acids, dehydrogenation of butane in gas phase, esterification of levulinic acid, Friedel-Craft acylations, C-C and C-P coupling. The use of these materials has allowed the development of simple processes with low environmental impact. The operating conditions are in fact mild and reaction times short. The selectivity for the desired products is in all reported cases very high and the catalysts can be recycled maintaining their optimum performances.

Modulation of Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase 2 (SERCA2) function by acetylation following the treatment with histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA)

Background: Acetylation and deacetylation at specific lysine (K) residues is mediated by histone acetylases (HATs) and deacetylases (HDACs), respectively. HATs and HDACs act on both histone and non-histone proteins, regulating various processes, including cardiac impulse propagation. Aim of the present work was to establish whether the function of the Ca2+ ATPase SERCA2, one of the major players in Ca2+ reuptake during excitation-contraction coupling in cardiac myocytes (CMs), could be modulated by direct K acetylation. Materials and methods: HL-1 atrial mouse cells (donated by Prof. Claycomb), zebrafish and Streptozotocin-induced diabetic rat CMs were treated with the pan-inhibitor of class I and II HDACs suberanilohydroxamic acid (SAHA) for 1.5 hour. Evaluation of SERCA2 acetylation was analyzed by co-immunoprecipitation. SERCA2 activity was measured on microsomes by pyruvate/NADH coupled reaction assay. SERCA2 mutants were obtained after cloning wild-type and mutated sequences into the pCDNA3 vector and transfected into HEK cells. Ca2+ transients in CMs (loading with Fluo3-AM, field stimulation, 0.5 Hz) and in transfected HEK cells (loading with FLUO-4, caffeine pulse) were recorded. Results: Co-Immunoprecipitation experiments performed on HL-1 cells demonstrated a significant increase in the acetylation of SERCA2 after SAHA-treatment (2.5 µM, n=3). This was associated with an increase in SERCA2 activity in microsomes obtained from HL-1 cells, after SAHA exposure (n=5). Accordingly, SAHA-treatment significantly shortened the Ca2+ reuptake time of adult zebrafish CMs. Further, SAHA 2.5 nM restored to control values the recovery time of Ca2+ transients decay in diabetic rat CMs. HDAC inhibition also improved contraction parameters, such as fraction of shortening, and increased pump activity in microsomes isolated from diabetic CMs (n=4). Notably, the K464, identified by bioinformatic tools as the most probable acetylation site on human SERCA2a, was mutated into Glutamine (Q) or Arginine (R) mimicking acetylation and deacetylation respectively. Measurements of Ca2+ transients in HEK cells revealed that the substitution of K464 with R significantly delayed the transient recovery time, thus indicating that deacetylation has a negative impact on SERCA2 function. Conclusions: Our results indicate that SERCA2 function can be improved by pro-acetylation interventions and that this mechanism of regulation is conserved among species. Therefore, the present work provides the basis to open the search for novel pharmacological tools able to specifically improve SERCA2 activity in diseases where its expression and/or function is impaired, such as diabetic cardiomyopathy.