Développement de lignées de poissons zébrés transgéniques pour l'étude du rôle de la protéine F dans la pathogenèse de l'hépatite C

Le virus de l’hépatite C (VHC) est une des principales causes d’hépatite chronique. La protéine F du VHC est codée par un cadre de lecture alternatif du gène de la capside, Core. La protéine F a été découverte après que l’on ait associé Core à plusieurs des fonctions pathogènes du VHC. Nous proposons donc que certaines fonctions biologiques et pathogènes attribuées à la protéine Core résultent de l’activité de la protéine F. Nous avons choisi de développer trois lignées de poissons zébrés (Danio rerio) qui expriment différentes versions de la protéine F afin d’étudier les effets de la protéine F et leur incidence dans la pathogenèse du VHC. Deux versions de la séquence codant pour la protéine F (AF11 et AUG26) et une version mutante du gène core (CoremutI) ont été introduites sur les vecteurs d’un système d’expression répressible spécifique au foie. Ces vecteurs ont été co-injectés dans des embryons unicellulaires de poissons zébrés pour générer les poissons fondateurs des lignées transgéniques. 19, 21 et 36 poissons ont été choisis comme fondateurs pour les lignées AF11, AUG26 et CoremutI respectivement. De ce nombre, 9, 11 et 11 poissons ont atteint la maturité, dans l’ordre pour les mêmes lignées, et seront croisés pour donner naissance à des lignées transgéniques stables. Les résultats de ces expériences nous permettront de mieux cerner les propriétés biologiques de la protéine F et de définir son rôle dans la pathogenèse du VHC.

Régulation de l’identité des membres postérieurs par le facteur de transcription à boîte T Tbx4

Bien que partageant une homologie structurelle évidente, les membres antérieurs (MA) sont toujours différents des membres postérieurs (MP). Ceci suggère l’existence d’un programme générique de formation d’un membre, un bauplan, qui doit être modulé de façon spécifique pour engendrer cette différence antéro-postérieure de l’identité. Nous avons donc voulu identifier les mécanismes déployés durant l’évolution pour permettre la mise en place de l’identité des membres. Le laboratoire avait précédemment caractérisé, chez les souris où le gène Pitx1 est inactivé, une transformation partielle des MP en MA couplée à une perte de croissance. Nous avons donc cherché à comprendre les mécanismes en aval de Pitx1 dans la détermination de l’identité postérieure. Notre démarche nous a permis d’identifier les gènes affectés par la perte de Pitx1 dans les MP, où nous avons confirmé une dérégulation de l’expression de Tbx4. Tbx4 et Tbx5 sont des candidats évidents pour déterminer l’identité, leur expression étant restreinte aux MP et MA, respectivement, mais leur implication dans ce processus était sujette à controverse. Nous avons donc évalué l’apport de Tbx4 en aval de Pitx1 dans les processus d’identité en restaurant son expression dans les MP des souris Pitx1-/-. Ce faisant, nous avons pu montrer que Tbx4 est capable de pallier la perte de Pitx1 dans le MP, en rétablissant à la fois les caractères d’identité postérieure et la croissance. En parallèle, nous avons montré que Tbx5 était capable de rétablir la croissance mais non l’identité des MP Pitx1-/-, démontrant ainsi de façon définitive une propriété propre à Tbx4 dans la détermination de l’identité des membres postérieure. La caractérisation de l’activité transcriptionnelle de Tbx4 et Tbx5 nous a permis de mettre en évidence un domaine activateur conservé mais aussi un domaine spécifique à Tbx4, répresseur de la transcription. Par ailleurs, une mutation faux-sens de TBX4 dans les patients atteints du syndrome coxo-podo-patellaire, TBX4Q531R, inactive le domaine répresseur, empêchant la compensation de l’identité mais non de la croissance des MP dépourvus de Pitx1, démontrant l’importance de cette fonction dans l’identité postérieure. La caractérisation de l’activité répressive de Tbx4, qui se manifeste seulement dans les membres postérieurs démontre l’importance de cette fonction dans l’identité postérieure. Nous avons aussi été en mesure d’identifier un corépresseur qui est suffisant pour supporter cette activité de Tbx4. Enfin, nous avons pu aussi démontrer l’activité transcriptionnelle d’un représentant du gène ancestral, présent chez Amphioxus, qui se comporte strictement comme un activateur et semble dépourvu du domaine répresseur. En somme, nous avons précisé le rôle de Tbx4 et Tbx5, ainsi que leur mécanisme, dans la détermination de l’identité des membres. Globalement, nos travaux permettent d’élaborer une théorie où une divergence d’activité transcriptionnelle de Tbx4 et Tbx5 est responsable de l’identité des membres et même entrevoir que cette divergence d’activité soit à la base de son apparition durant l’évolution.

Étude de l’implication de la protéine F du virus de l’hépatite C dans le développement de pathologie hépatique chez deux lignées de poissons zébrés transgéniques

La protéine core du virus de l’hépatite C (VHC) serait responsable des principaux effets pathogènes du VHC, dont le développement de fibrose, stéatose, cirrhose et carcinome hépatocellulaire. Un cadre de lecture alternatif existe dans le gène de core, permettant la synthèse d’une autre protéine appelée ARFP (pour alternatate reading frame protein) ou protéine F (pour frameshift), dont le rôle reste encore mal compris. La présence de la protéine F lors de l’étude des fonctions biologiques de core ne pouvant être exclue, il est possible que certains rôles attribués à core reflètent en réalité l’activité de la protéine F. Afin de déterminer les fonctions biologiques de la protéine F dans les hépatocytes et son influence dans la pathogenèse associée au VHC, nous avons généré des lignées transgéniques de poissons zébrés (Danio rerio) dans lesquelles l’expression de deux versions de la protéine F (AF11opti et AUG26opti) a été ciblée au foie par l’utilisation du promoteur de la liver fatty acid binding protein (L-FABP). Le phénotype des poissons transgéniques de génération F2 a été analysé au niveau morphologique, histologique et microscopique afin de rechercher des signes de pathologie hépatique. Nos résultats ont démontré l’implication de la protéine F dans le développement de stéatose hépatique chez les deux lignées transgéniques, mais aucun signe de fibrose ou d’oncogenèse n’a été détecté. L’identification des mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’accumulation lipidique induite par la protéine F pourrait permettre de mieux comprendre son rôle dans la pathogenèse du VHC, et mener au développement de nouvelles stratégies antivirales.

Are transgenic mice the 'alkahest' to understanding myocardial hypertrophy and failure?

Murine transgenesis using cardioselective promoters has become increasingly common in studies of cardiac hypertrophy and heart failure, with expression mediated by pronuclear microinjection being the commonest format. Without wishing to decry their usefulness, in our view, such studies are not necessarily as unambiguous as sometimes portrayed and clarity is not always their consequence. We describe broadly the types of approach undertaken in the heart and point out some of the drawbacks. We provide three arbitrarily-chosen examples where, in spite of a number of often-independent studies, no consensus has yet been achieved. These include glycogen synthase kinase 3, the extracellular signal-regulated kinase pathway and the ryanodine receptor 2. We believe that the transgenic approach should not be viewed in an empyreal light and, depending on the questions asked, we suggest that other experimental systems provide equal (or even more) valuable outcomes.

The zebrafish spil promoter drives myeloid-specific expression in stable transgenic fish

The spi1 (pu.1) gene has recently been identified as a useful marker of early myeloid cells in zebrafish. To enhance the versatility of this organism as a model for studying myeloid development, the promoter of this gene has been isolated and characterized. Transient transgenesis revealed that a 5.3 kilobase promoter fragment immediately upstream of the spi1 coding sequence was sufficient to drive expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in injected embryos in a manner that largely recapitulated the native spi1 gene expression pattern. This fragment was successfully used to produce a germ line transgenic line of zebrafish with EGFP-expressing myeloid cells. These TG(spi1:EGFP)pA301 transgenic zebrafish represent a valuable tool for further studies of myeloid development and its perturbation.

GH overexpression causes muscle hypertrophy independent from local IGF-I in a zebrafish transgenic model

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Muscle-specific growth hormone receptor (GHR) overexpression induces hyperplasia but not hypertrophy in transgenic zebrafish

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Proteínas Cry1 e Vip3A de Bacillus thuringiensis: sinergismo e efeito sub-letal no controle de Heliothis virescens

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Aspectos reprodutivos, morfologia dos gametas e desenvolvimento embrionário de Astyanax altiparanae Garutti & Britski (Teleostei, Characidae)

Pós-graduação em Aquicultura - FCAV

The effects of temperature and busulfan (Myleran) on the yellowtail tetra Astyanax altiparanae (Pisces, Characiformes) spermatogenesis

We aimed to standardize a protocol to suppress spermatogenesis in the characiform fish, Astyanax altiparanae, for future use as a host in germ cell transplant research, opening opportunities for a range of studies, such as spermatogenesis analyses and transgenesis because this species presents livestock characteristics to be used as a biological model. The effects of the chemotherapeutic busulfan (formulated as Myleran), which is used as medicine, therefore not as toxic to humans manipulation as analytical grade busulfan (Fluka) used in previous studies, were evaluated at physiological temperature of 28 °C, ideal for growth and reproduction of A altiparanae, and also at increased temperature 35 °C. The temperature groups were divided into three treatment groups: busulfan, DMSO only, and an untreated control. Macroscopic, histologic, stereological, and ultrastructure analysis showed that, at 28 °C, busulfan did not cause depletion of germ cells in A altiparanae. However, at 35 °C, sterilization was observed 3 weeks after the initial application. Similar results were obtained with maintenance of fish at 35 °C for a longer period with no accompanying Myleran treatment. This procedure allows reduction in stress and lower mortality resulting from manipulation during busulfan injection and is also suitable for mass treatment because large numbers of fish can be incubated in warm water.

alpha-6 Integrin Expression in Bovine Spermatogonial Cells Purified by Discontinuous Percoll Density Gradient

The study of spermatogonial stem cells (SSCs) provides a model to better understand adult stem cell biology. Besides the biomedical potential to perform studies of infertility in many species, SSCs hold a promising application at animal transgenesis. Because stem cells are thought to be associated with basement membranes, expression of alpha-6 integrin has been investigated as a marker of type A spermatogonial cells, which are considered SSCs because of their undifferentiated status and self-renewal ability. In this manner, the aim of this study was to isolate type A SSCs from adult bulls by a two-step enzymatic procedure followed by a discontinuous Percoll density gradient purification and verify the expression of alpha-6 integrin by flow cytometry and real-time RT-PCR before and after Percoll purification. Spermatogonial cells were successfully obtained using the two-step enzymatic digestion. An average of 1 x 10(5) viable cells per gram of testis was isolated. However, the discontinuous Percoll did not purify isolated cells regarding alpha-6 integrin expression. Flow cytometry analysis demonstrated no differences in the alpha-6 integrin expression between cell samples before and after Percoll purification (p = 0.5636). The same was observed in the real-time PCR analysis (p > 0.05). In addition to alpha-6 integrin, the expression of GFR alpha-1 and PGP9.5, known bovine SSCs markers, was detected in all samples studied. Considering that Percoll can reduce cell viability, it is possible to conclude that Percoll density gradient is not suitable to purify bovine SSC, according to alpha-6 integrin expression.

Genetic Manipulation, Gene Silencing and Biomarker Development in Multiple Experimental Models.

The thesis is set in three different parts, according to the relative experimental models. First, the domestic pig (Sus scrofa) is part of the study on reproductive biotechnologies: the transgenesis technique of Sperm Mediated Gene Transfer is widely studied starting from the quality of the semen, through the study of multiple uptakes of exogenous DNA and lastly used in the production of multi-transgenic blastocysts. Finally we managed to couple the transgenesis pipeline with sperm sorting and therefore produced transgenic embryos of predetermined sex. In the second part of the thesis the attention is on the fruit fly (Drosophila melanogaster) and on its derived cell line: the S2 cells. The in vitro and in vivo models are used to develop and validate an efficient way to knock down the myc gene. First an efficient in vitro protocol is described, than we demonstrate how the decrease in myc transcript remarkably affects the ribosome biogenesis through the study of Polysome gradients, rRNA content and qPCR. In vivo we identified two optimal drivers for the conditional silencing of myc, once the flies are fed with RU486: the first one is throughout the whole body (Tubulin), while the second is a head fat body driver (S32). With these results we present a very efficient model to study the role of myc in multiple aspects of translation. In the third and last part, the focus is on human derived lung fibroblasts (hLF-1), mouse tail fibroblasts and mouse tissues. We developed an efficient assay to quantify the total protein content of the nucleus on a single cell level via fluorescence. We coupled the protocol with classical immunofluorescence so to have at the same time general and particular information, demonstrating that during senescence nuclear proteins increase by 1.8 fold either in human cells, mouse cells and mouse tissues.

Potential role of CYP2D6 in the central nervous system

1. Cytochrome P450 2D6 (CYP2D6) is a pivotal enzyme responsible for a major drug oxidation polymorphism in human populations. Distribution of CYP2D6 in brain and its role in serotonin metabolism suggest that CYP2D6 may have a function in the central nervous system. 2. To establish an efficient and accurate platform for the study of CYP2D6 in vivo, a human CYP2D6 (Tg-2D6) model was generated by transgenesis in wild-type (WT) C57BL/6 mice using a P1 phage artificial chromosome clone containing the complete human CYP2D locus, including the CYP2D6 gene and 5'- and 3'-flanking sequences. 3. Human CYP2D6 was expressed not only in the liver but also in the brain. The abundance of serotonin and 5-hydroxyindoleacetic acid in brain of Tg-2D6 is higher than in WT mice, either basal levels or after harmaline induction. Metabolomics of brain homogenate and cerebrospinal fluid revealed a significant up-regulation of L-carnitine, acetyl-L-carnitine, pantothenic acid, 2'-deoxycytidine diphosphate (dCDP), anandamide, N-acetylglucosaminylamine and a down-regulation of stearoyl-L-carnitine in Tg-2D6 mice compared with WT mice. Anxiety tests indicate Tg-2D6 mice have a higher capability to adapt to anxiety. 4. Overall, these findings indicate that the Tg-2D6 mouse model may serve as a valuable in vivo tool to determine CYP2D6-involved neurophysiological metabolism and function.

Binary recombinase systems for high-resolution conditional mutagenesis.

Conditional mutagenesis using Cre recombinase expressed from tissue specific promoters facilitates analyses of gene function and cell lineage tracing. Here, we describe two novel dual-promoter-driven conditional mutagenesis systems designed for greater accuracy and optimal efficiency of recombination. Co-Driver employs a recombinase cascade of Dre and Dre-respondent Cre, which processes loxP-flanked alleles only when both recombinases are expressed in a predetermined temporal sequence. This unique property makes Co-Driver ideal for sequential lineage tracing studies aimed at unraveling the relationships between cellular precursors and mature cell types. Co-InCre was designed for highly efficient intersectional conditional transgenesis. It relies on highly active trans-splicing inteins and promoters with simultaneous transcriptional activity to reconstitute Cre recombinase from two inactive precursor fragments. By generating native Cre, Co-InCre attains recombination rates that exceed all other binary SSR systems evaluated in this study. Both Co-Driver and Co-InCre significantly extend the utility of existing Cre-responsive alleles.

One Hundred Years of Grain Omics: Identifying the Glutens That Feed the World.

Glutens, the storage proteins in wheat grains, are a major source of protein in human nutrition. The protein composition of wheat has therefore been an important focus of cereal research. Proteomic tools have been used to describe the genetic diversity of wheat germplasms from different origins at the level of polymorphisms in alleles encoding glutenin and gliadin, the two main proteins of gluten. More recently, proteomics has been used to understand the impact of specific gluten proteins on wheat quality. Here we review the impact of proteomics on the study of gluten proteins as it has evolved from fractionation and electrophoretic techniques to advanced mass spectrometry. In the postgenome era, proteomics is proving to be essential in the effort to identify and understand the interactions between different gluten proteins. This is helping to fill in gaps in our knowledge of how the technological quality of wheat is determined by the interaction between genotype and environment. We also collate information on the various storage protein alleles identified and their prevalence, which makes it possible to infer the effects of wheat selection on grain protein content. We conclude by reviewing the more recent use of transgenesis aimed at improving the quality of gluten.