Utilizzo dell'ipossia come stimolo per il differenziamento condrocitico di cellule staminali.

Date le sollecitazioni meccaniche alle quali è sottoposta, la cartilagine, soprattutto quella articolare, è facilmente danneggiabile e la mancanza di vascolarizzazione la rende un tessuto incapace di auto-rigenerarsi. Il fallimento della chirurgia tradizionale ha incentivato negli ultimi venti anni lo sviluppo di nuove tecniche di ingegneria tissutale che prevedono la rigenerazione del tessuto cartilagineo in vitro, e il suo successivo impianto nella zona lesionata. Generalmente si preferisce utilizzare cellule staminali mesenchimali adulte (MSCs), e il tessuto adiposo si è rivelata la fonte di estrazione più conveniente.Inoltre le ATSCs (Adipose Tissue Stem Cells) possono essere facilmente isolate dalla componente vasculo-stromale (SVF) del tessuto adiposo prelevata in seguito a un intervento di liposuzione: quindi, a differenza delle MSCs estratte da midollo osseo (BMSCs- Bone Marrow Stem Cells), la loro estrazione dal paziente richiede un intervento meno invasivo e meno rischioso. Il tessuto cartilagineo non è raggiunto dai vasi sanguigni, e la sua formazione nella fase embrionale avviene ad una concentrazione di O2 notevolmente inferiore a quella ambientale. Questo ha indotto gli studiosi a pensare che un ambiente ipossico possa non soltanto favorire il differenziamento condrogenico di cellule staminali in coltura, ma anche facilitare il mantenimento del fenotipo condrocitico, mimando l'ambiente fisiologico avascolare della cartilagine.Lo scopo di questa tesi è stato la messa a punto di un protocollo di coltura cellulare in condizioni di ipossia per indurre differenziamento condrogenico di ATSCs. La metodica standardizzata verrà impiegata in laboratorio per sviluppare la ricerca di base nello studio della rigenerazione della cartilagine.

Skin tissue engineering: medical problems and technological solutions.

In questo elaborato si affrontano problematiche cliniche legate ai traumi gravi della cute in cui è necessario intervenire chirurgicamente per ripristinare una situazione normale: si approfondisce lo studio della fisiologia del tessuto, la classificazione dei gradi delle ustioni della pelle, la guarigione delle ferite e la meccanica della cute. Il trapianto di tessuto autologo costituisce la soluzione più efficace e con minori complicazioni. Tuttavia il paziente potrebbe non presentare una superficie di cute disponibile sufficientemente estesa, per cui si ricorre ad altri metodi. In primo luogo, si effettuano degli allotrapianti di tessuto di donatore cadavere prelevati secondo le normative vigenti e conservati attraverso le varie tecniche, il cui sviluppo ha consentito una durata di conservazione maggiore; mentre la glicerolizzazione abbatte al 100% il rischio di trasmissione di patologie e lo sviluppo di microorganismi, la crioconservazione preserva la vitalità del tessuto. La chirurgia utilizzata per queste operazioni si avvale di tecnologie innovative come la Tecnologia a Pressione Negativa. Un'alternativa necessaria per sopperire all'ingente richiesta di tessuto di donatore sono i sostituti cutanei, che presentano un grande potenziale per il futuro. Per eliminare totalmente il rischio di rigetto sarebbe necessario personalizzare il costrutto utilizzando cellule autologhe, ma la ricerca è stata rallentata da minori investimenti da parte dell'industria biomedica, che si è maggiormente focalizzata sulla realizzazione di prodotti utilizzabili da un più ampio raggio di pazienti. Per queste ragioni, l'ingegneria tissutale della cute ha trovato più ampio campo di applicazione nel sistema dei test in vitro. A tale scopo sono stati creati dei protocolli certificati per testare la corrosività, la irritabilità e la vitalità del tessuto cutaneo, quali EpiDerm, EpiSkin e SkinEthic che si avvalgono dell'uso del metodo MMT e della spettrofotometria, che è diventata un supporto fondamentale per le scienze biologiche.

Ottimizzazione di metodi numerici e realizzazione di un setup per l'imaging di colture cellulari 3D con tomografia ad impedenza elettrica

Il presente lavoro di tesi presenta la progettazione, realizzazione e applicazione di un setup sperimentale miniaturizzato per la ricostruzione di immagine, con tecnica di Tomografia ad Impedenza Elettrica (EIT). Il lavoro descritto nel presente elaborato costituisce uno studio di fattibilità preliminare per ricostruire la posizione di piccole porzioni di tessuto (ordine di qualche millimetro) o aggregati cellulari dentro uno scaffold in colture tissutali o cellulari 3D. Il setup disegnato incorpora 8 elettrodi verticali disposti alla periferia di una camera di misura circolare del diametro di 10 mm. Il metodo di analisi EIT è stato svolto utilizzando i) elettrodi conduttivi per tutta l’altezza della camera (usati nel modello EIT bidimensionale e quasi-bidimensionale) e ii) elettrodi per deep brain stimulation (conduttivi esclusivamente su un ridotto volume in punta e posti a tre diverse altezze: alto, centro e basso) usati nel modello EIT tridimensionale. Il metodo ad elementi finiti (FEM) è stato utilizzato per la soluzione sia del problema diretto che del problema inverso, con la ricostruzione della mappa di distribuzione della conduttività entro la camera di misura. Gli esperimenti svolti hanno permesso di ricostruire la mappa di distribuzione di conduttività relativa a campioni dell’ordine del millimetro di diametro. Tali dimensioni sono compatibili con quelle dei campioni oggetto di studio in ingegneria tissutale e, anche, con quelle tipiche dei sistemi organ-on-a-chip. Il metodo EIT sviluppato, il prototipo del setup realizzato e la trattazione statistica dei dati sono attualmente in fase di implementazione in collaborazione con il gruppo del Professor David Holder, Dept. Medical Physics and Bioengineering, University College London (UCL), United Kingdom.

Sviluppo e caratterizzazione di scaffolds polimerici a base di gelatina e nanocellulosa per la rigenerazione dei tessuti

L’ingegneria tissutale rappresenta oggi una delle tematiche più importanti di ricerca in ambito medico-ingegneristico. Questa disciplina si pone come obiettivo di far fronte alla mancanza, sostituzione o riparazione di tessuto attraverso lo sviluppo di scaffolds opportunamente ottimizzati. I polimeri naturali rappresentano una classe di materiali particolarmente indicata per soddisfare i requisiti richiesti soprattutto per la biocompatibilità che spesso li caratterizza. La gelatina è uno dei materiali che si presta alla realizzazione di scaffolds innovativi ad altissima biocompatibilità nonostante le scarse proprietà meccaniche e la facilità di degradazione. Proprio per questo è possibile migliorarne le prestazioni attraverso l’ottimizzazione di processi di blending con altri polimeri, in questo caso le nanofibre di cellulosa e l’impiego di agenti reticolanti. Lo scopo di questo lavoro di tesi, svolto presso l’Istituto di Scienza e Tecnologia dei Materiali Ceramici (ISTEC-CNR) di Faenza, è la progettazione, lo sviluppo e la caratterizzazione di scaffolds polimerici porosi a base di gelatina e nanocellulosa opportunamente reticolati per un ampio range di applicazioni nell’ambito dell’ingegneria tissutale. A questo scopo, sono stati sviluppati cinque dispositivi 3D porosi, ottenuti tramite liofilizzazione, che differiscono per il tipo di processo reticolante applicato. Il progetto ha previsto una prima fase di ricerca bibliografica che ha permesso di conoscere lo stato dell’arte sull’argomento trattato. Si è potuto così procedere alla realizzazione degli scaffolds e a una prima caratterizzazione di carattere chimico-fisico e morfologico. A questo punto, sulla base dei dati ottenuti, sono stati scelti i campioni su cui effettuare ulteriori caratterizzazioni meccaniche. In ultimo, sono stati analizzati e rielaborati tutti i risultati.

micro e nano sistemi per il rilascio controllato di farmaci

Il presente lavoro di Tesi ha voluto fornire una panoramica sui dispositivi a rilascio controllato presenti nella letteratura scientifica, e dei materiali, in particolare poliesteri alifatici, principalmente impiegati a tale scopo. Particolare attenzione è stata dedicata anche alle tipologie di somministrazione e alle patologie che attualmente possono essere curate con tali dispositivi al fine di effettuare un rilascio di principio attivo in maniera mirata, controllata, e ottimizzata in relazione alla specifica terapia, al fine di migliorare quanto più possibile la compliance del paziente. In ultima istanza, sono stati riportati alcuni casi studio, relativi a sistemi copolimerici e materiali ibridi realizzati dal gruppo di ricerca della Prof.ssa Lotti, relatrice del presente elaborato, che da anni studia e realizza materiali polimerici innovativi per applicazioni biomedicali, quali ingegneria tissutale e rilascio controllato di farmaci.

Analisi dello stato dell’arte di scaffold biomimetici mediante l'utilizzo di tecnologie additive per la rigenerazione del tessuto osseo

Ogni giorno, nel mondo, si verificano migliaia di fratture ossee e la maggior parte di esse, con il passare del tempo, riescono a rimarginarsi in modo autonomo. In casi più importanti, le fratture ossee necessitano di interventi chirurgici. Per queste motivazioni, affianco ad autoinnesti, alloinnesti e xenoinnesti, negli ultimi anni si è iniziato a parlare in modo sempre più frequente di ingegneria tissutale. In questo tipo di ingegneria, vengono sviluppate delle impalcature in grado di emulare il tessuto osseo naturale. Lo scopo di questa tesi è analizzare le varie tipologie di produzione di scaffold ossei che si ottengono attraverso la tecnologia della stampa 3D. Nella parte introduttiva dell’elaborato, viene inserita una descrizione del tessuto osseo visto sia dal punto di vista cellulare e della composizione, sia dal punto di vista delle proprietà meccaniche. Successivamente, parlando di medicina rigenerativa, vengono descritti i mezzi di osteosintesi, gli innesti e le impalcature, o scaffold, da impiantare nel sito di interesse. Per quanto riguarda gli scaffold, devono soddisfare diversi requisiti, tra cui la biomimetica, la compatibilità con l’attività cellulare, requisiti di progettazione e proprietà meccaniche adeguate. Tali scaffold possono essere realizzati attraverso diverse geometrie interne. Nella seconda parte dell’elaborato, vengono analizzate le geometrie a cubo semplice, a cubo a faccia centrata/a diamante, a cubo a corpo centrato, a dodecaedro rombico, a traliccio di ottetto, a cubo troncato, modellate attraverso il metodo delle superfici minime triplamente periodiche e con tassellatura di Voronoi. Per i vari articoli analizzati sono stati investigati i metodi di produzione e i risultati ottenuti confrontando vantaggi e svantaggi fra le differenti geometrie.

Analysis of the state of the art of the biofabrication strategies for the regeneration of the myotendinous junction

La giunzione miotendinea (MTJ) è una struttura anatomica specializzata che collega il muscolo al tendine. La sua funzione è quella di permettere la trasmissione della forza generata dal muscolo al tendine, permettendo il movimento. Essendo una struttura di interfaccia che funge da raccordo tra due tipi di tessuti molto differenti, tende a risentire di una forte concentrazione di tensione, questo la rende fortemente suscettibile a rottura. Le tecniche ad oggi utilizzare per riparare lesioni alla MTJ risultano inadatte ad una completa ed ottimale ripresa meccanica. Al fine di trovare una soluzione a questo problema, l’ingegneria tissutale sta lavorando alla fabbricazione di strutture tridimensionali che siano in grado di imitare al meglio la struttura nativa della MTJ. Le tecniche utilizzate per la produzione di tali strutture sono, principalmente, stampa 3D ed elettrofilatura. Il vantaggio di queste tecniche è la loro elevata risoluzione, che permette di controllare finemente l’architettura di tali strutture artificiali. Nella seguente tesi verrà presentato lo stato dell’arte sulle tecniche utilizzate per la fabbricazione di scaffolds per la rigenerazione della MTJ, soffermandosi in particolare sui metodi di fabbricazione e sulle prestazioni morfologiche, meccaniche e cellulari effettuando un confronto tra i diversi studi che se ne sono occupati, individuandone punti di forza, debolezze e possibili studi futuri che potranno essere effettuati su tali scaffolds. In questo modo, sarà possibile rendersi conto di quale di queste tecniche risulti essere più promettente per il futuro.

Mechanical characterization of 3D bioprinted meniscus

Le lesioni del menisco sono le più comuni nella società di oggi: si verificano per un trauma meccanico o per cambiamenti degenerativi nella composizione dei tessuti. In caso di rottura o danneggiamento si interviene mediante riparazione del menisco, menisectomia parziale o totale, o allotrapianto, ma tali tecniche portano a degenerazione della cartilagine articolare, aumento dello stress sull'articolazione tibiale e infiammazione. Gli impianti di sostituzione presenti in commercio non riescono a ricreare il tessuto naturale del ginocchio o a prevenire malattie degenerative della cartilagine; si cerca quindi di creare un menisco meccanicamente e chimicamente simile a quello nativo. In questo studio è realizzato, tramite stampante 3D, uno scaffold di alginato e nanocellulosa, con condrociti umani al suo interno. Le cellule sono opportunamente coltivate, raggruppate a formare sferoidi di diverse concentrazioni (5000 e 10000 cellule/sferoide) e inserite all'interno di scaffold caratterizzati rispettivamente da 4000 e 2000 sferoidi/ml di inchiostro. Le loro proprietà meccaniche, insieme a quelle del campione costituito dal solo bio-inchiostro, sono caratterizzate mediante nanoindentazione. Un'analisi statistica (0.05% di significatività), ha appurato una differenza nelle proprietà meccaniche dei campioni con diverse concentrazioni di sferoidi, e tra questi e il campione senza sferoidi. Il modulo elastico e la durezza riscontrati (kPa): E=23.97±13.05, H=3.15±1.23 nel controllo negativo, E=35.34±7.28, H=4.37±0.79 nel campione da 2000 sferoidi/ml e E=49.28±9.75, H=5.44±0.87 nel campione da 4000 sferoidi/ml. In conclusione, la formazione di agglomerati di cellule e la loro introduzione all'interno di uno scaffold è possibile ed è un buon metodo per controllare il numero di cellule inserite, in termini di sferoidi. Gli organoidi contribuiscono al modulo elastico e alla durezza del campione, determinando un incremento e una maggiore equità nelle proprietà meccaniche.

Histochemical characterization of 3D bioprinted meniscus

La cartilagine ad oggi rappresenta ancora una sfida per la medicina rigenerativa a causa della sua scarsa capacità di rigenerarsi quando sottoposta a gravi lesioni tissutali. Inoltre, la sua struttura complessa e l'ambiente biologico che offre sono ancora difficili da riprodurre con precisione mediante l’utilizzo di strutture bioartificiali e biomimetiche. Sebbene gli interventi per riparare i danni al tessuto cartilagineo siano ancora prevalentemente di stampo chirurgico, si stanno aprendo nuove strade nel campo dell'ingegneria tissutale volte a ricreare una struttura simile a quella originaria, che possa indurre la rigenerazione o sostituire direttamente il tessuto danneggiato. Lo studio condotto e discusso in questo elaborato mira a soddisfare quest'ultimo intento, ponendo le basi per un'eventuale evoluzione sperimentale della stampa del menisco. La ricerca si è basata sulla biostampa 3D di campioni di menisco, di dimensioni pari a circa 1 cm2, realizzati mediante un bioinchiostro a base di alginato e nanocellulosa, al cui interno sono stati immersi sferoidi/microtessuti di condrociti con diversa concentrazione. La stampa dei campioni è avvenuta in tre diverse condizioni: i) solo bioinchiostro, ii) bioinchiostro contenente sferoidi da 5000 cellule, iii) bioinchiostro contenente sferoidi da 10000 cellule. Al termine della stampa sono stati analizzati i campioni per verificare la sopravvivenza delle cellule e investigare l'attitudine di queste di ricreare matrice extracellulare cartilaginea nelle condizioni ambientali in cui sono state introdotte. A questo proposito, sono state eseguite delle analisi istochimiche, quali la RT-PCR e l’analisi istologica. Inoltre, a partire dalle immagini al microscopio degli sferoidi a seguito della loro formazione e dalle sezioni istologiche, sono state analizzate le dimensioni dei campioni per confrontare l'eventuale variazione volumetrica di questi prima della stampa e a seguito del processo di estrusione.

Strategie innovative per la somministrazione della terapia chemioterapica attraverso l'utilizzo di nanogel polimerici

Il cancro è una delle malattie statisticamente più diffuse e una delle principali cause di morte nel mondo, con più di 300.000 nuove diagnosi annue solamente in Italia e con circa dieci milioni di decessi globali. A causa dell’elevata incidenza e dell’invecchiamento della popolazione, la ricerca di una soluzione a questa malattia assume una particolare importanza. Una delle terapie più frequentemente utilizzate per il trattamento del cancro è la chemioterapia, che possiede una rilevanza fondamentale e rimane ad oggi insostituibile. Tuttavia, questa terapia dal carattere sistemico presenta numerosi limiti che devono necessariamente essere risolti e tra le possibili soluzioni l’utilizzo di Drug Delivery Systems nanometrici rappresenta un approccio dalle elevate potenzialità. Tra i diversi nanocarrier, i nanogel polimerici si distinguono per l’ottima versatilità, biocompatibilità, biodegradabilità, stabilità in ambiente biologico e l’elevata capacità di incapsulamento. Questi nanovettori, che possiedono le caratteristiche tipiche degli idrogel e dei nanomateriali, sono dotati della capacità di incapsulare, trasportare e rilasciare in modo controllato farmaci chemioterapici dalle varie proprietà chimico-fisiche. Lo scopo di questa tesi è l’analisi delle caratteristiche di questi composti al fine di evidenziare come l’utilizzo dei nanogel polimerici nel trattamento chemioterapico possa risolvere alcuni dei principali problemi di questa terapia e migliorarne l’efficacia terapeutica. Per dimostrare quanto affermato, i risultati dell’utilizzo dei nanogel nel trattamento di alcune forme tumorali verranno mostrati e confrontati con quelli della chemioterapia convenzionale, con lo scopo di evidenziarne i vantaggi e i limiti ancora presenti.

Effetto della porosità sulle proprietà meccaniche e osteoinduttive di biomateriali utili per l’ingegneria del tessuto osseo

L'elaborato tratta dell'effetto della porosità sulle proprietà meccaniche e osteoinduttive di un biomateriale utilizzabile in ingegneria del tessuto osseo, per come questo è stato valutato nello studio "Surface porous poly-ether-ether-ketone based on three-dimensional printing for load-bearing orthopedic implant" condotto dai ricercatori Shuai Li, Tianyu Wang, Jiqiang Hu, Zhibin Li, Bing Wang, Lianchao Wang e Zhengong Zhou. In particolare, il biomateriale studiato è rappresentato dal “PEEK”, un polimero termoplastico che viene lavorato, tramite stampante 3D a filamento, in modo da presentare una struttura che include un corpo centrale solido ricoperto da strati porosi sia nello strato superiore sia in quello inferiore. Per la valutazione delle proprietà meccaniche sono state svolte una prova a trazione e una prova a flessione. I valori ottenuti sperimentalmente sono stati confrontati con quelli ottenuti da un’analisi numerica e da un modello teorico. Per la valutazione delle proprietà osteoinduttive sono stati condotti test di proliferazione cellulare e differenziamento osteogenico. I risultati ottenuti concludono che specifici valori della porosità superficiale del biomateriale presentano proprietà meccaniche e osteoinduttive che lo rendono idoneo all’utilizzo come impianto osteogenico in ingegneria tissutale.

Valutazione della biodegradabilita e biocompatibilita di nuovi poliesteri alifatici a base di poli(butilene succinato) per uso biomedicale

Lo scopo di questa tesi è stato migliorare le proprietà di biodegradabilità e le proprietà strutturali del poli(butilene succinato) attraverso copolimerizzazione e trattamento al gas plasma. Entrambe le strategie sono risultate vincenti.

Sintesi e caratterizzazione di nuovi copoliesteri alifatici multiblocco per applicazioni biomedicali

La ricerca nell’ambito dell’ingegneria tissutale e del rilascio controllato di farmaci ha compiuto notevoli progressi negli ultimi anni. In questo contesto, i materiali polimerici rappresentano senza dubbio la tipologia più adatta: è infatti possibile modularne piuttosto facilmente le proprietà finali per ottenere materiali con caratteristiche ad hoc per il tipo di applicazione scelta, garantendo al contempo il mantenimento di biodegradabilità e biocompatibilità, essenziali in campo biomedicale. All’interno della classe dei polimeri, i poliesteri alifatici risultano particolarmente interessanti e promettenti. Tra questi ultimi, il poli(butilene succinato) (PBS) è utilizzato soprattutto nel campo degli imballaggi biodegradabili grazie alla buona stabilità termica e alla elevata temperatura di fusione (115°C). Di contro, tale polimero è caratterizzato da tempi di biodegradazione lunghi, dovuti all’elevato grado di cristallinità (circa 45-50%), nonché da proprietà meccaniche non ottimali per alcune applicazioni. In tale contesto si inserisce il presente lavoro di tesi che ha come scopo la realizzazione di nuovi poli(esteri uretani) multiblocco a base di PBS, caratterizzati da proprietà migliorate rispetto all’omopolimero di partenza. Al fine di ottenere nuovi materiali che presentino una maggiore velocità di degradazione, combinata con un comportamento meccanico sia elastomerico che termoplastico, sono state prese in considerazione due diverse unità copolimeriche: una cosiddetta “hard” e l’altra “soft”. L’alternanza di queste due porzioni permette infatti di realizzare un polimero tenace, con una elevata temperatura di fusione (dovuta all’elevato grado di cristallinità del segmento hard), e con un basso modulo elastico ed un elevato allungamento a rottura (tipici invece del segmento soft).

Studio dei tannini del legno come additivi multifunzionali per biopolimeri

Il problema dello smaltimento delle plastiche tradizionali di origine petrolchimica ha stimolato l’interesse verso i materiali plastici bio-based biodegradabili come i PHB che, al contrario, possono essere degradati facilmente e in tempi rapidi dai batteri naturalmente presenti nell’ecosistema. Uno dei principali campi di applicazione dei PHA è quello del food packaging. L’uso di imballaggi attivi dove un antiossidante, disperso nella matrice polimerica, migra dall’imballaggio al cibo può essere utile per aumentare la shelf life degli alimenti ma anche per introdurre con la dieta fonti antiossidanti esogene che neutralizzano gli effetti dannosi dei radicali liberi, normalmente prodotti dai processi biologici. I tannini sono antiossidanti naturali che agiscono da riducenti, donano un idrogeno ai radicali liberi stabilizzandoli (free radical scavengers). Si può quindi usare il tannino estratto dal legno come bioadditivo per matrici biopolimeriche (PHB). Recuperando questo prodotto di scarto dell’industria agro-alimentare, si riesce ad abbassare il costo del prodotto finale che risulterà inoltre 100% biodegradabile e con capacità antiossidanti, quindi particolarmente adatto per il food packaging monouso. La bioplastica finale è stata ottenuta “melt mixando” il tannino in polvere, il PHB in pellets e il catalizzatore Ti(OBu)4 liquido in un mescolatore interno Brabender. Sono stati creati 4 campioni a percentuale crescente di tannino e catalizzatore. Sono state effettuate: - Prove di estrazione in acqua per capire quanto tannino non si fosse legato alla matrice biopolimerica. - Analisi FTIR per capire se fosse avvenuto un legame di transesterificazione tra matrice e tannino usando il Ti(OBu)4. - Prove di radical scavenging activity attraverso la spettroscopia uv-visibile per quantificare il potere antiossidante del tannino. - Analisi GPC, DSC e prove di trazione per confrontare le proprietà meccaniche e termiche dei campioni con quelle del PHB puro.