974 resultados para Virulência (Microbiologia) Teses
Resumo:
A Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) um patotipo emergente e heterogneo que causa a diarria aguda ou persistente em indivduos de diferentes faixas etrias e em pacientes imunocomprometidos. Alm disso, EAEC um dos principais agentes etiolgicos da diarria dos viajantes. O padro de aderncia agregativa de EAEC est associado ao plasmdeo de aderncia agregativa (pAA). Genes presentes no plasmdeo e no cromossomo codificam protenas envolvidas na secreo extracelular de fatores de virulência na superfcie ou diretamente na clula hospedeira. A capacidade de produo de muco e biofilme, elaborao de toxinas, aderncia e induo de inflamao intensa na mucosa intestinal so importantes caractersticas da patogenicidade de EAEC. Nesse estudo, determinamos o perfil genotpico de genes do sistema de secreo Tipo V (SST5) e sistema de secreo Tipo VI (SST6) em cepas de EAEC. Os genes do SST5 ocorreram com mais frequncia que os genes do SST6. A presena de pelo menos um gene do SST5 foi detectada em 79% das cepas, enquanto que os genes relacionados ao SST6 foram detectados em apenas 42% das cepas analisadas. A produo de biofilme foi observada em teste quantitativo e verificamos que 67% das cepas produziram biofilme. No teste qualitativo, o tipo de biofilme que predomina o biofilme moderado (11 cepas), seguido do biofilme forte (9 cepas) e do biofilme discreto (4 cepas). A presena ou ausncia de genes do SST5 e SST6 no parece interferir com a capacidade de produo de biofilme, nem com o tipo de biofilme formado. Em ensaios de citotoxicidade, apenas 25% das cepas EAEC (sobrenadante) causaram reduo significativa na viabilidade de clulas T84 avaliada pelo teste de reduo com MTT. Nossos resultados mostram que as cepas EAEC isoladas de crianas com diarria aguda ou de grupo controle so invasoras para clulas T84. Ao compararmos a capacidade invasora das cepas clinicas e controle, observamos que a mdia do ndice de internalizao obtido nas 15 cepas do grupo clinico foi de 5,7% 1,7 e para as 9 cepas do grupo controle foi de 2.4 % 0,7; entretanto essa diferena observada no foi estatisticamente significativa. No foi possvel correlacionar o perfil genotpico dos genes do SST5 e SST6 com o perfil fenotpico analisado (formao de biofilme, citotoxicidade e invaso).O que pode ser atribudo a heterogeneidade genotpica e fenotpica, uma caracterstica relevante de cepas EAEC.
Resumo:
Staphylococcus coagulase-negativo (SCN) esto frequentemente envolvidos em infeces nosocomiais associadas com o uso de cateteres e outros procedimentos mdicos invasivos. A habilidade de aderir s superfcies abiticas e de produzir biofilme tem sido reconhecida entre os principais fatores de virulência dos SCN, especialmente de S. epidermidis, a principal espcie responsvel por infeces relacionadas assistncia a sade - IRASs. Dentre as demais espcies de SCN capazes de produzir biofilme, S. haemolyticus tem sido relacionado com quadros de infeces em recm-nascidos (RNs). O presente estudo teve como objetivo principal investigar aspectos microbiolgicos e epidemiolgicos dos processos infecciosos invasivos relacionados com SCN em neonatos internados em unidade de terapia intensiva neonatal (UTIN) de um hospital universitrio do municpio do Rio de Janeiro (2008-2010). A tcnica de PCR multiplex-mPCR foi empregada na determinao das espcies de 40 amostras de SCN isoladas de hemoculturas de RNs fazendo uso de cateteres intravenosos e submetidos terapia antimicrobiana emprica com vancomicina e/ou gentamicina. A fenotipagem foi realizada por trs mtodos distintos: Simplificado em microplaca, Vitek 2 e API-Staph. Os perfis de resistncia aos antimicrobianos foram verificados atravs do teste de disco-difuso, determinao de CIM (Oxacilina) e presena do gene mecA. A capacidade de produo de biofilme foi investigada pelos testes do gar Vermelho do Congo e ensaios de aderncia em superfcies abiticas (poliestireno e vidro) alm da PCR para os genes icaAB, atlE e aap. O perfil genmico dos micro-organismos foi determinado pela tcnica de PFGE. Os resultados demonstraram o isolamento de S. haemolyticus (77%), S. epidermidis (15%), S. captis (5%) e S. warneri (3%). A anlise comparativa dos resultados obtidos pelo m-PCR com mtodos fenotpicos demonstrou uma concordncia de 97,5% com o esquema simplificado e de ~40% Vitek 2 e o API Staph. A maioria (82,5%) das amostras apresentou perfis variados de multiresistncia aos 16 antimicrobianos testados e resistncia a oxacilina, apesar de 25% destas no apresentarem o gene mecA. Apesar da maioria das amostras de SCN ter apresentado capacidade de produzir slime e/ou biofilme no foi observada total correlao com a presena dos genes mecA, icaAB, aap, atlE, enfatizando a natureza multifatorial da produo de biofilme de SCN. Diferente do observado para as demais espcies, algumas amostras de S. haemolyticus foram incapazes de aderir ao vidro e ao poliestireno e/ou apresentaram os genes aap (38,7%), atlE (42%) alm de icaAB (71%). Na UTIN foi detectada a presena de seis diferentes tipos clonais da espcie prevalente, indicando a disseminao de S. haemolyticusnesta unidade hospitalar e a endemicidade em nossa comunidade.
Resumo:
Aeromonas spp. so bastonetes Gram negativos amplamente distribudos nos ambientes aquticos, com relatos de isolamento em gua de abastecimento pblico e alimentos. Este micro-organismo possui potencial de causar doenas intestinais e extraintestinais cuja patogenicidade est associada a sua virulência multifatorial. Diversos determinantes de virulência de Aeromonas j foram identificados, incluindo sistemas de secreo de protenas. O sistema de secreo tipo VI (SST6) o mais recente sistema de secreo de protenas identificado em bactrias cuja presena em estirpes no gnero Aeromonas pode implicar atividades de citotoxicidade para o hospedeiro, pois esse sistema capaz de injetar molculas efetoras dentro da clula, interferindo diretamente nos processos celulares. A fim de determinar a presena e analisar a distribuio dos genes hcp e vgrG codificadores das protenas efetoras do SST6 em Aeromonas spp. o presente estudo examinou 119 cepas isoladas de diversas origens pela tcnica da PCR aps o desenho de oligonucleotdeos iniciadores especficos. Objetivamos ainda analisar a variabilidade gentica interespecfica dos genes hcp e vgrG a partir de dados de sequenciamento. Os resultados obtidos indicaram a distribuio dos genes vgrG e hcp em 46% das cepas de Aeromonas hydrophila e Aeromonas caviae de diferentes origens. Entre as cepas de A. hydrophila a maior frequncia foi observada nas cepas isoladas de humanos, onde todas foram positivas para os iniciadores que amplificaram um produto de 541 pb do gene vgrG e 418 pb do gene hcp. Entre as cepas de A. caviae, a incidncia de genes vgrG e hcp foi mais elevada nas cepas isoladas de alface (60%) e peixes (50%). As cepas analisadas de origem ambiental apresentaram ndice total de 36% de positividade, apresentando frequncia de 60% e 22% em A. hydrophila e A. caviae, respectivamente. Os dados obtidos da anlise de cepas de origem alimentar mostraram a presena dos genes vgrG e hcp em 67% (A. hydrophila) e 60% (A. caviae) das cepas isoladas de folhas de alface. Nas cepas isoladas de queijo os genes foram encontrados em 67% e 12,5% das cepas de A. hydrophila e de A. caviae, respectivamente. O alinhamento mltiplo entre as sequncias dos segmentos dos genes hcp e vgrG obtidas no sequenciamento indicou grau de identidade nucleotdica de 75 a 100% entre as sequncias de hcp e 80 a 100% entre as sequncias de vgrG. Em concluso, nossos resultados indicaram que os iniciadores desenhados foram capazes de detectar suas sequncias alvo em cepas de A. caviae e outras espcies de Aeromonas, sugerindo a existncia de homologia entre os genes nas diferentes espcies, confirmada aps sequenciamento de DNA. Os dados indicaram que esses genes esto distribudos em vrias espcies de Aeromonas e em cepas isoladas de diversas fontes. Ressaltamos a prevalncia de cepas de A. hydrophila PCR-positivas em isolados clnicos, sugerindo a participao do SST6 no complexo universo da virulência multifatorial que permeia esse micro-organismo
Resumo:
Streptococcus pneumoniae um importante agente etiolgico de infeces invasivas e no invasivas, incluindo meningite, pneumonia e otite mdia. A cpsula polissacardica o principal fator de virulência desse microrganismo, sendo tambm considerada um importante marcador em estudos epidemiolgicos. Dentre os mais de 90 tipos capsulares conhecidos, o sorotipo 14 se destaca pela prevalncia elevada em vrias regies, inclusive no Brasil. A avaliao da diversidade gentica desse microrganismo tambm inclui a aplicao de mtodos moleculares, como PFGE e MLST. Entretanto, essas metodologias so relativamente onerosas, consomem muito tempo e os resultados obtidos com a tcnica de PFGE so de difcil comparao entre diferentes laboratrios. A tcnica de anlise do polimorfismo numrico de segmentos repetitivos em mltiplos loci [MLVA, do ingls Multiple Loci VTNR (Variable-Number Tandem Repeat) Analysis] se apresenta como uma alternativa, embora ainda necessite de padronizao e avaliao mais ampla para a espcie em questo. No presente estudo, 60 amostras de Streptococcus pneumoniae pertencentes ao sorotipo 14, isoladas de diversas fontes clnicas, em diferentes locais e perodos de tempo, foram caracterizadas pelas tcnicas de MLVA (baseada na anlise de 18 loci distintos), MLST, PFGE e tipagem do gene pspA. O gene pspA2 predominou entre as amostras analisadas, seguido pelo gene pspA1. Os tipos de MLVA, perfis de PFGE, e STs encontrados apresentaram resultados, em geral, concordantes, indicando o elevado poder discriminatrio da verso da tcnica de MLVA empregada. Cinco complexos clonais (CC) de MLVA e cinco singletons puderam ser definidos. O CC de MLVA denominado de L7 foi o predominante, compreendendo 36,7% da amostragem estudada. O CC L7 mostrou-se relacionado com genes pspA da famlia 2, com o CC1 de MLST, com o CC Pen14-H de PFGE, e com a no susceptibilidade penicilina, Entre os complexos clonais de MLST, o CC1 foi o prevalente e incluiu predominantemente o ST156, pertencente ao clone internacional Spain9V-3. O CC L3 e o singleton L17 de MLVA apresentaram-se associados ao CC de PFGE Eri14-A, a famlia 1 de PspA e ao CC2 de MLST, que por sua vez tambm estava relacionado com o clone internacional England14-9. O CC L15 de MLVA esteve associado ao CC de PFGE Pen14-A, ao gene pspA2, aos CC3 e CC4 de MLST e ao clone internacional do PMEN Tennessee14-18. A tcnica de MLVA revelou-se significativamente mais discriminatria que as tcnicas de PFGE e MLST, conforme exemplificado pela deteco de 21 perfis de MLVA, 13 perfis de PFGE e cinco STs, entre as 22 amostras pertencentes ao CC de MLVA L7. Uma verso de MLVA, compreendendo um painel com os oito loci de maior poder discriminatrio, pde ser proposta a partir da anlise dos resultados obtidos. Estes aspectos, aliados ao menor tempo e custo de execuo, indicam que a tcnica de MLVA constitui uma alternativa importante e satisfatria para uso em estudos sobre a diversidade gentica de S. pneumoniae.
Resumo:
O gnero Enterococcus tem emergindo como um dos mais importantes patgenos em infeces relacionadas assistncia sade no mundo. Estes microrganismos apresentam habilidade de adquirir genes de resistncia a vrios antimicrobianos, inclundo vancomicina, alm de possuir diversos fatores associados virulência, que contribuem sobremaneira para a sua permanncia no hospedeiro, facilitando sua disseminao, particularmente, no ambiente hospitalar. Os objetivos deste estudo foram caracterizar, por testes fenotpicos e genotpicos, amostras de Enterococcus isoladas de quadros infecciosos em pacientes atendidos em quatro instituies de sade localizadas na cidade do Natal, RN, no perodo de setembro de 2010 a junho de 2011. As espcies de Enterococcus foram caracterizadas por testes fisiolgicos convencionais e por reao em cadeia da polimerase (PCR) multiplex, utilizando oligonucleotdeos especficos para caracterizao do gnero e espcies. O perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos foi avaliado por testes de difuso em gar. Os valores de concentrao inibitria mnima (CIM) para vancomicina, teicoplanina e linezolida foram determinados pelo emprego do teste E; e o gentipo de resistncia vancomicina foi analisado por PCR. Genes associados virulência (asa1, cylA, esp, gelE e hyl) foram detectados por ensaios de PCR multiplex. O polimorfismo gentico das amostras bacterianas foi avaliado por metodologia de eletroforese em campo pulsado (PFGE), com a utilizao da enzima SmaI. Foram obtidas 117 amostras, a partir de quadros infecciosos em 116 pacientes. Os resultados revelaram que a espcie E. faecalis foi a prevalente (91,4%). Os testes de susceptibilidade revelaram que as taxas de resistncia mais elevadas estiveram associadas tetraciclina (58,2%) e a nveis elevados de estreptomicina (36,7%). A resistncia vancomicina foi detectada em uma amostra de E. faecium, portadora do gentipo vanA, correspondendo ao primeiro isolamento de amostra com essa caracterstica de resistncia no RN. Esta amostra foi isolada em um caso de co-infeco com E. faecalis sensvel vancomicina. Adicionalmente, susceptibilidade intermediria a linezolida foi identificada em trs amostras de E. faecalis. Dentre os determinantes de virulência identificados, gelE foi o prevalente (83,8%). De acordo com as espcies E. faecalis o perfil mais detectado foi gelE + esp (31,6%), na espcie E. faecium foi o perfil esp (28,6%) e a nica amostra de E. gallinarum apresentou dois determinantes de virulência (asa1 + cylA). O gene hyl no foi identificado em nenhuma das amostras. A anlise do polimorfismo gentico das amostras por PFGE evidenciou uma elevada policlonalidade. Diante das caractersticas de resistncia e de virulência observadas e da sinalizao da emergncia de mecanismos de resistncia importantes no Estado do RN, este estudo chama ateno para a necessidade de rastreamento, particularmente entre portadores sadios, e estabelecimento de polticas de controle da disseminao dessas amostras nas instituies de sade, mesmo em regies onde tais caractersticas ainda sejam pouco frequentes.
Resumo:
A ocorrncia de fentipos multirresistentes de Corynebacterium pseudodiphtheriticum e sua associao a infeces graves, com elevada mortalidade em pacientes imunocomprometidos, aliados ao escasso conhecimento da virulência e patogenia destas infeces, motivou esta pesquisa, que teve como objetivo investigar mecanismos de virulência e resistncia microbiana deste agente entre pacientes de um hospital universitrio brasileiro. Um total de 113 amostras de C. pseudodiphtheriticum identificadas por mtodos bioqumicos convencionais e sistema API-Coryne isoladas de pacientes de diferentes grupos etrios. Os micro-organismos eram, em sua maioria, relacionados a infeces no trato respiratrio (27,45%), urinrio (29,20%) e sitios intravenosos (18,60%) e cerca de 32,70% das amostras foram provenientes de pacientes com pelo menos uma das condies predisponentes: insuficincia renal; transplante renal, tuberculose em paciente HIV+, cncer, cirrose heptica, hemodilise e uso de cateter. As amostras testadas revelaram-se multirresistentes sendo a maioria resistente oxacilina, eritromicina e clindamicina. A adeso das cepas ao poliestireno e ao poliuretano indicou o envolvimento de hidrofobicidade da superfcie celular na fase inicial da formao de biofilmes. O crescimento subsequente conduziu formao de microcolnias, agregados bacterianos densos incorporados na matriz exopolimrica rodeada por espaos vazios, tpica de biofilmes maduros. Adicionalmente, a interao do micro-organismo com fibrinognio e fibronectina humana indica o envolvimento destes componentes sricos na formao de biofilme, sugerindo a participao de diferentes adesinas neste processo e a capacidade deste agente formar biofilme in vivo. A afinidade por esses componentes e a formao de biofilme podem contribuir para o estabelecimento e disseminao da infeco no hospedeiro. Adicionalmente, as cepas de C. pseudodiphtheriticum isoladas de pacientes com infeces localizadas (ATCC10700/Pharyngitis) e sistmicas (HHC1507/Bacteremia) exibiram um padro de aderncia agregativa-like a clulas HEp-2, caracterizado por aglomerados de bactrias com aparncia de um "empilhado de tijolos". Atravs do teste FAS e ensaios de interao na presena de inibidores de citoesqueleto, demonstramos o envolvimento da polimerizao de actina na internalizao das cepas testadas. A internalizao bacteriana e rearranjo do citoesqueleto pareceu ser parcialmente desencadeado pela ativao da tirosina-quinase. Finalmente, C. pseudodiphtheriticum foi capaz de sobreviver no ambiente intracelular e embora no tenha demonstrado capacidade de replicar intracelularmente, clulas HEp-2 foram incapazes de eliminar o patgeno completamente no ambiente extracelular no perodo de 24 horas. Todas as cepas estudadas foram capazes de induzir apoptose em clulas epiteliais 24 horas ps-infeco evidenciada pelo aumento significativo no nmero de clulas mortas e pela ocorrncia de alteraes nucleares reveladas atravs dos mtodos de colorao pelo azul Trypan, pelo DAPI e microscopia electrnica de transmisso. Alteraes morfolgicas incluindo a vacuolizao, a fragmentao nuclear e a formao de corpos apoptticos foram observadas neste perodo. A citometria de fluxo demonstrou ainda uma diminuio significativa no tamanho das clulas infectadas e a utilizao de dupla marcao (iodeto de propdio / anexina V) permitiu a deteco da ocorrncia de necrose e apoptose tardia. Em concluso, o conhecimento de tais caractersticas contribuiu para a compreenso de mecanismos envolvidos no aumento da frequncia de infeces graves com elevada mortalidade em pacientes no ambiente hospitalar, por C. pseudodiphtheriticum, um patgeno rotineiramente subestimado em pases em desenvolvimento.
Resumo:
Os enterococos esto amplamente distribudos no ambiente. Nos seres humanos, compem a microbiota do trato gastrintestinal, da cavidade oral e do trato geniturinrio. Nas ltimas dcadas, esses microrganismos se tornaram importantes agentes etiolgicos de infeces hospitalares. Uma caracterstica marcante desses microrganismos a resistncia intrnseca a vrios antimicrobianos utilizados habitualmente no tratamento de infeces, alm de alguns fatores que tem sido relacionado virulência de enterococos. Este estudo investigou a presena de enterococos em amostras de infeco e colonizao de pacientes hospitalizados, profissionais de sade, dietas hospitalares e manipuladores de alimentos. Foram analisadas 276 amostras de colonizao, de quadros de infeco, dietas orais e manipuladores de alimento. No foram recuperadas amostras dos profissionais de sade. Todas as amostras foram submetidas a testes convencionais de caracterizao do gnero e espcies. Testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foram empregados pelo mtodo de disco difuso, alm da CIM para vancomicina e teicoplanina. A produo de biofilme e a expresso da gelatinase tambm foram avaliadas. Os genes de resistncia a gentamicina, estreptomicina e vancomicina e os genes de virulência cylA, esp e fsr foram pesquisados pela tcnica de PCR. O polimorfismo gentico foi determinado por PFGE. A espcie E. faecalis foi a prevalente nas amostras isoladas de colonizao e infeco (42,2% e 81,9%, respectivamente). E. casseliflavus (58,9%) foi a mais freqente dentre as amostras das dietas hospitalares e E. faecium (46,7%) de manipuladores. Dentre as amostras de colonizao as maiores taxas de resistncia foram observadas para eritromicina (76,3%) e ciprofloxacina (53,9%). Dentre as amostras de infeco, >70% foram resistentes a eritromicina, ciprofloxacina e tetraciclina. Resistncia a nveis elevados de gentamcina (HLR-GE) e estreptomicina (HLR-ST) foi detectada em 24,6% e 20,4% das amostras, respectivamente, e todas foram portadoras dos respectivos genes. A maioria das amostras de colonizao (52,6%) e infeco (55,7%) foram multirresistentes. A taxa para resistncia a nveis elevados de vancomicina foi de 5,2% e todas eram portadoras do gene vanA. Em relao a formao de biofilme, 70,2% foram produtoras, com uma maior freqncia dentre as de infeco. A expresso de gelatinase foi detectada em 28,9% e 44,3% das amostras de colonizao e infeco, respectivamente. Nenhuma das amostras isoladas das dietas hospitalares e de manipuladores expressou gelatinase. Nas amostras pertencentes as espcies E. faecalis e E. faecium (n=109) 16,5%, 51,4% e 48,6% apresentaram produtos de amplificao referentes aos genes cylA, esp e fsr, respectivamente. A anlise do polimorfismo gentico revelou uma extensa diversidade dentre as amostras pertencentes as espcies E. faecalis e E. faecium, no acarretando um perfil eletrofortico prevalente. Entretanto, foi observado um perfil nico dentre as amostras de E. gallinarum resistentes a vancomicina (vanA). Este estudo mostrou que amostras de enterococos isoladas de diferentes fontes, no s de quadros infecciosos, podem representar um risco para a populao, apontando para uma maior reflexo quanto ao papel desses microrganismos nas infeces humanas, particularmente no ambiente hospitalar.
Resumo:
Reconhecida como agente de doena humana em 1982, E.coli enterohemorrgica (EHEC) pode causar diarria sanguinolenta, colite hemorrgica e sndrome hemoltica urmica (SHU). EHEC constitui um subgrupo especialmente virulento das E.coli produtoras de toxina de Shiga (Stx). O fator crtico da sua virulência a toxina Shiga, capaz de interromper a sntese proteica da clula eucaritica. So conhecidos dois subgrupos de Stx, Stx1 e Stx2. Stx1 possui duas variantes Stx1c e Stx1d. Stx2 possui muitas variantes. Estudos epidemiolgicos sugerem que cepas com os perfis toxignicos Stx2 ou Stx2/Stx2c seriam mais frequentemente associadas a pacientes com SHU. Alm da expresso de Stx, EHEC do sorotipo O157:H7 colonizam a mucosa intestinal induzindo a formao de leses denominadas attaching/effacing (A/E). Para a produo da leso A/E, necessria a presena de uma ilha de patogenicidade cromossmica denominada LEE, composta por cinco operons, LEE 1 a LEE5. Em LEE 5 so codificadas a adesina intimina e o seu receptor Tir, o qual translocado por um sistema de secreo tipo III (SSTT) e em LEE 4 so codificadas as protenas secretadas EspA,B e D. Em EHEC O157:H7 so descritos muitos fatores de virulência, codificados em ilhas de patogenicidade, no cromossomo e no megaplasmdio pO157. Bovinos so o principal reservatrio deste patgeno e alimentos de origem bovina e produtos contaminados com fezes de bovinos so causadores de surtos epidmicos. Em nosso pas EHEC O157:H7 isolada do reservatrio animal mas muito rara a sua ocorrncia em doena humana. Notamos que nas cepas bovinas predomina Stx2c, enquanto nas cepas humanas predomina o perfil toxigenico Stx2/Stx2c. Quanto a interao com enterocitos humanos cultivados in vitro (linhagem Caco-2), verificamos que tanto cepas bovinas quanto humanas mostram idntica capacidade de invadir e persistir no compartimento intracelular das clulas Caco-2. No entanto, em comparao com as cepas humanas, as cepas bovinas mostram uma reduzida capacidade de produzir leses A/E. Empregamos qPCR para aferir a transcrio de trs diferentes locus (eae, espA e tir) situados nos operons LEE4 e LEE5 de cepas bovinas e humanas, durante a infeco de clulas Caco-2. Verificamos diferenas na expresso dos genes, especialmente espA, entre cepas bovinas e humanas com maior expresso para estas ultimas, em linha com os achados dos testes FAS. Atravs de clonagem e expresso de protenas recombinantes, purificamos as protenas Eae, EspA e Tir e obtivemos anticorpos especficos, empregados para acompanhar a sua expresso ao longo da infeco de clulas Caco-2, por imunofluorescencia. Verificamos que as trs protenas so detectadas tanto em cepas bovinas quanto humanas, mas nestas ultimas, a marcao precoce e torna-se mais intensa com o avano da infeco. Nossos resultados indicam que cepas EHEC O157:H7 isoladas do reservatrio bovino em nosso pas apresentam diferenas importantes em relao ao perfil toxigenico e a capacidade de induo de leses A/E, caractersticas apontadas na literatura como relevantes para a virulência do micro-organismo. Por outro lado, nossos achados quanto a capacidade de invadir e multiplicar-se no interior de entercitos pode explicar a persistncia do patgeno no reservatrio animal e a sua capacidade de transmisso horizontal.
Resumo:
<i>Enterococcus faecium</i> tem se destacado no cenrio das infeces hospitalares, particularmente, amostras portadoras de caractersticas de multirresistncia. Apesar de serem responsabilizados como agentes etiolgicos em diferentes quadros clnicos, fatores associados a patognese das infeces ainda no esto esclarecidos. Entretanto, sabe-se que a capacidade de formao de biofilmes pode ser responsabilizada como um dos atributos capazes de promover o papel patognico desses microrganismos. Assim sendo, este estudo se props a investigar a capacidade de formao de biofilmes por duas amostras de <i>E. faecium</i>: SS-1274 (derivada da amostra tipo da espcie) e CL-6729 (multirresistente e pertencente a um complexo clonal globalmente disperso). As amostras foram caracterizadas fenotipica e genotipicamente para confirmao da identificao, determinao da susceptibilidade a 17 antimicrobianos, caracterizao da concentrao mnima inibitria para ampicilina, gentamicina e vancomicina, determinao do gentipo vanA e deteco de genes associados a expresso dos genes asa1, cylA, esp, gelE e hyl. A anlise quantitativa da formao por 24h e 72h dos biofilmes foi realizada por metodologia do cristal violeta, em placas de microtitulao de poliestireno. Foram construdas curvas de formao pela avaliao da DO570nm das preparaes coradas por cristal violeta em perodos de tempo de 2h a 74h. A influncia de subCMIs de ampicilina, gentamicina e vancomicina na formao de biofilmes de <i>E. faecium</i> foi tambm caracterizada em ensaios de quantificao da biomassa. A presena de DNA e protenas foi avaliada em ensaios de destacamento e por fluorimetria. A arquitetura, distribuio espacial e reao aos fluorocromos Syto9 e SYPRO Ruby Protein foram evidenciadas por microscopia confocal de varredura a laser. Anlises protemicas atravs da avaliao por SDS-PAGE e por ESI-Q-TOF tambm foram empregadas para avaliao de biofilmes versus crescimento planctnico. Nossos resultados demonstraram que a amostra CL-6729 apresentou uma maior biomassa nos tempos analisados. Apesar da menor quantidade de biomassa da amostra SS-1274, o perfil da curva de formao foi semelhante a CL-6729. As anlises da matriz por ensaios quantitativos e microscopia confocal revelaram que protena parece ser um importante constituinte para ambas as amostras, entretanto biofilmes formados na presena de da CMI e durante 24h, parecem sofrer alteraes na constituio. Os resultados relativos s espectrometrias de massa sugerem que clulas de biofilmes de <i>E. faecium</i> podem tambm estar metabolicamente ativas, devido a identificao de um considervel nmero de protenas relacionadas ao metabolismo e diviso celular, similarmente s clulas planctnicas. No entanto, investigaes complementares so necessrias para quantificar as diferenas relacionadas a sua expresso. Foi observado que ambas as amostras independente das variaes fenotpicas e genotpicas so capazes de formar biofilmes maduros exibindo constituio e arquitetura similares. Entretanto, nossos resultados sugeriram que cada amostra responde as diferentes situaes de acordo com seus determinantes de virulência e resistncia.
Resumo:
Staphylococcus aureus resistente meticilina (MRSA) um importante patgeno pulmonar em pacientes com fibrose cstica (FC). Caracteriza-se pela resistncia a todos os β-lactmicos, devido a presena do elemento gentico mvel SCCmec o qual abriga o gene mecA. Alm disso, reconhecido por vrios fatores de virulência o qual destacamos a toxina Panton-Valentine Leukocidin (PVL), uma citolisina formadora de poros na clula hospedeira, e por apresentar diversos clones epidmicos envolvidos em surtos hospitalares. O objetivo desse estudo foi caracterizar a epidemiologia de MRSA, isolados de pacientes com FC referente a dois centros de referncia no Rio de Janeiro a partir da aplicao de tcnicas fenotpicas e genotpicas. Um total de 57 amostras de MRSA foi submetido ao teste de difuso em gar para 11 antimicrobianos a fim de avaliar perfil de resistncia, com aplicao da tcnica da PCR foi tipificado o SCCmec e investigado a presena do gene LukS-PV responsvel pela codificao da toxina PVL com intuito de estabelecer uma melhor caracterizao epidemiolgica dos clones identificados pela tcnica do MLST (Multilocus Sequence Typing). Os antimicrobianos no β-lactmicos apresentaram um percentual de resistncia abaixo de 50%, em que destacamos a eritromicina com o maior percentual 45,6% e quanto ao perfil de resistncia 24,6% foram multirresistentes. Com exceo do SCCmec II, os outros tipos foram encontrados (I, III, IV e V) com os respectivos percentuais de 22,8% (n=13), 7,1% (n=4), 61,4% (n=35) e 3,5% (n=2) e apenas 5,3% (n=3) das amostras no foram caracterizadas, no h dados da prevalncia do SCCmec IV. Vinte (35,1%) amostras apresentaram produtos de amplificao compatvel com a presena do gene lukS, aproximadamente metade dessas amostras (55%) estava correlacionada ao SCCmec IV. Com a anlise do MLST, obtivemos os STs 1 (n=1, 1,7%), 5 (n=28, 49,1%), 30 (n=11, 19,3%), 72 (n=1, 1,7%), 398 (n=1, 1,7%), 1635 (n=7, 12,3%), 1661 (n=2, 3,5%), 239 (n=5, 8,8%), e ainda identificamos um novo ST (2732) presente em 1 amostra. A partir de uma anlise associativa entre o MLST e o SCCmec foi possvel observar a presena de linhagens caractersticas de clones epidmicos, como o UK-EMRSA-3 (ST5, SCCmec I), USA 800/peditrico (ST5, SCCmec IV), Oceania Southwest Pacific Clone - OSPC (ST30, SCCmec IV) e Brazilian Epidemic Clone - BEC (ST239, SCCmec III). Em concluso este estudo o primeiro a caracterizar linhagens epidmicas de MRSA nos centros de atendimento a pacientes com FC no Rio de Janeiro, sendo necessrio um monitoramento constante a fim de evitar a disseminao desses clones.
Resumo:
O Complexo Burkholderia cepacia (CBc) um grupo de 17 espcies intimamente relacionadas que esto associadas deteriorao pulmonar e aumento da mortalidade em pacientes com Fibrose Cstica (FC). Essas espcies variam entre si em relao prevalncia, quadros clnicos e virulência. Pouco conhecido em relao ao perfil de resistncia aos antimicrobianos. Uma vez estabelecida a infeco, a abordagem teraputica e as medidas de controle atualmente adotadas so baseadas no CBc, sem considerar cada espcie em particular. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalncia das espcies do CBc em pacientes atendidos em dois centros de referncia no Rio de Janeiro, bem como estabelecer perfis de resistncia a antimicrobianos e avaliar a diversidade molecular entre as espcies. Cem amostras do CBc isoladas de 38 pacientes com FC no perodo de janeiro de 2010 a fevereiro de 2012 foram identificadas por mtodos fenotpicos e pelo sequenciamento do gene recA. As CIMs para amicacina, aztreonam, ceftazidima, trimetoprim/sulfametoxazol e tobramicina foram determinadas por microdiluio e a genotipagem das espcies foi realizada por PFGE com a enzima SpeI. B. vietnamiensis (44%) foi a espcie mais prevalente, seguida de B. cenocepacia IIIA (36%), B. multivorans (10%), B. cenocepacia IIIB (1%) e B. stabilis (1%). Cinco por cento das amostras no foram identificadas. B. vietnamiensis foi identificada em mais da metade dos pacientes (58,3%). Foram observadas diferenas no perfil de susceptibilidade entre as espcies do CBc. B. cenocepacia IIIA foi a espcie que apresentou as maiores taxas de resistncia aos antimicrobianos, sobretudo para trimetoprim/ sulfametoxazol (80,5%), principal antimicrobiano utilizado no tratamento de infeces causadas pelo CBc. Amostras com perfis MDR ocorreram em todas as espcies, destacando-se o perfil A, resistente simultaneamente aos cinco antimicrobianos, observado em 58,8% das amostras de B.cenocepacia IIIA. A anlise do polimorfismo gentico mostrou que, apesar de B. vietnamiensis ter sido a espcie mais prevalente, a ocorrncia de nove grupos clonais sugere que a aquisio dessas cepas tenha se dado a partir de uma fonte ambiental comum. Para B. cenocepacia IIIA, 52,9% das amostras foram atribudas a um mesmo grupo clonal (BcA), compartilhado entre nove pacientes atendidos em um mesmo centro de referncia. Oitenta por cento dessas amostras apresentaram ainda resistncia a todos os antimicrobianos testados. Os dados mostram que, mesmo com o emprego de tcnicas moleculares, difcil a identificao do CBc em nvel de espcie; que B. cenocepacia IIIA caracterizada por ndices de resistncia superiores s outras espcies e que a transmisso cruzada entre os indivduos aponta para a necessidade do estabelecimento de medidas de vigilncia do CBc nos centros de referncia.
Resumo:
O Sistema de Secreo do Tipo VI (SST6), o mais recente maquinrio de secreo descrito em bactrias Gram-negativas, amplamente distribudo entre as diversas espcies deste grupo de microrganismos. Esse aparato de secreo capaz de injetar efetores proteicos em clulas alvo, eucariticas e procariticas. Estudos sobre o papel do SST6 na virulência microbiana revelaram que este sistema secretrio participa ativamente do estabelecimento de infeces, contribuindo para a sobrevivncia das bactrias no interior de fagcitos. O genoma da cepa PAO1 de <i>Pseudomonas aeruginosa</i> apresenta trs loci que codificam aparatos de SST6, denominados de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6, Porm, pouco se sabe sobre a participao do SST6 na patognese de infeces por <i>P. aeruginosa</i>. Assim, o presente estudo investigou o papel de H1-SST6, H2-SST6 e H3-SST6 durante a infeco pulmonar aguda de camundongos. Para isso, camundongos C57/BL6 foram infectados com diferentes doses de bactrias da cepa selvagem PAO1 ou das cepas mutantes PAO1∆H1, PAO1∆H2, PAO1∆H3 ou PAO1∆H1∆H2∆H3. Aps 24 horas, os lavados broncoalveolares (LBAs) de animais controle e infectados foram recuperados para a contagem de leuccitos totais e polimorfonucleares e para a quantificao, por ELISA, da quimiocina para neutrfilos, KC, e das citocinas pr-inflamatrias IL-1β e TNF-α. Em outros experimentos, os pulmes, fgados, baos e rins dos animais foram macerados para a pesquisa da carga bacteriana e da disseminao sistmica das bactrias. A citotoxicidade do SST6 foi determinada, <i>in vitro</i>, em neutrfilos humanos, pela marcao com iodeto de propdeo (PI) e anexina-V seguida da anlise em citometria de fluxo. Os resultados mostraram que a inativao dos trs SST6 reduziu significativamente a concentrao de neutrfilos nos LBAs quando os animais foram infectados com 10<SUP>7</SUP> Unidades Formadoras de Colnias de <i>P. aeruginosa</i>. Nesta dose, foi observado que as medianas do nmero de bactrias detectadas nos animais infectados com as mutantes no SST6 foram menores do que as detectadas nos animais infectados com a cepa parental PAO1. As mutaes no SST6 no afetaram a disseminao sistmica da bactria. A pesquisa da secreo de citocinas pr-inflamatrias mostrou que, embora tenha sido observada uma reduo nas medianas das concentraes de TNF-α nos LBAs de camundongos infectados com a cepa PAO1∆H1∆H2∆H3, em relao aos LBAs de camundongos infectados com a cepa parental, essa diferena no foi significativa. Como a pesquisa de IL-1β e KC no contribuiu para a elucidao dos mecanismos envolvidos na reduo da concentrao de neutrfilos nos LBAs dos camundongos infectados pela cepa tripla mutante, foi pesquisado o possvel efeito do SST6 na morte de neutrfilos humanos. Os resultados mostraram que no houve diferenas significativas quando as diferentes amostras de clulas infectadas foram comparedas entre si. Em concluso, os resultados do presente estudo mostraram que o SST6 pode interferir na resposta de neutrfilos durante a pneumonia aguda, mas estudos adicionais so necessrios para determinar o papel deste mecanismo de secreo na patognese de <i>P. aeruginosa</i>.
Resumo:
A mortalidade na Fibrose Cstica (FC) decorrente de infeces pulmonares causadas comumente por: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e espcies do Complexo Burkholderia cepacia (CBc). Mais recentemente, tem sido observada a emergncia de BGN-NF raros, como Achromobacter xylosoxidans, porm, sua prevalncia, potencial de transmisso e significado clnico so desconhecidos. O objetivo deste trabalho foi verificar a ocorrncia de colonizao crnica por A. xylosoxidans e avaliar a possibilidade de transmisso cruzada entre os pacientes acompanhados em dois centros de referncia na cidade do Rio de Janeiro. Foram includos 39 pacientes com FC, com pelo menos uma cultura positiva para o gnero Achromobacter spp., em um total de 897 analisadas, do perodo de janeiro de 2003 a dezembro de 2008. A frequncia de isolamento de Achromobacter spp. nas culturas analisadas foi de 14,5% (130 em 897 culturas). A maioria (n=122; 93,8%) foi identificada como A. xylosoxidans por testes fenotpicos e pelo sequenciamento do gene rrs que codifica o 16S rRNA. A anlise do polimorfismo gentico dos isolados de A. xylosoxidans pela tcnica de PFGE, mostrou 22 grupos clonais. Destes, sete foram compartilhados entre pacientes distintos sugerindo transmisso cruzada. Apenas o clone G foi amplamente disseminado entre 56,4% dos pacientes estudados, sugerindo a possibilidade de um surto. Os 15 clones restantes constituram-se em clones exclusivos por pacientes. Os cinco pacientes colonizados cronicamente por A. xylosoxidans mostraram a prevalncia de clones nicos. At o momento, este o primeiro caso da ocorrncia de surto por A. xylosoxidans em pacientes com Fibrose Cstica. A. xylosoxidans um microrganismo que vem se destacando em frequncia e como um possvel patgeno pulmonar nesses pacientes. Entretanto, at o momento os dados so insuficientes para avaliar a sua contribuio para a evoluo da doena pulmonar. Estudos que busquem elucidar as caractersticas de A. xylosoxidans que o permitem colonizar persistentemente o pulmo dos pacientes com FC, bem como seu potencial de virulência, so necessrios.
Resumo:
A invaso de bactrias no trato urinrio caracteriza a infeco do sistema urinrio. A Escherichia coli o principal microrganismo associado a esta infeco devido a sua importncia em causar ITU, recebeu a denominao de UPEC (Escherichia coli uropatognica). No presente trabalho pesquisamos em 50 cepas de UPEC, inicialmente isolados de urina de pacientes ambulatoriais com infeces sintomtica ou assintomtica, a presena de 7 fatores de virulência, atravs das tcnicas de PCR simples e multiplex para verificao dos genes que codificam adesinas P (pap) , fmbria S (sfa), adesina afimbrial (afa), sideroforo (aerobactina- aer), toxinas fator necrotizante citotxico (cnf) e alfa-hemolisinas (hly), protena de membrana (traT); ilhas de patogenicidade (virulência) atravs do marcador PAI. O marcador pCVD432 de EAEC tambm foi pesquisado nestas amostras. O mtodo difuso em disco foi o utilizado para a determinao dos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos. Podemos observar duas faixas etrias de maior incidncia de ITU entre as mulheres: 19 a 35 anos, e acima de 50 anos. Sessenta e oito por cento das amostras apresentaram pelo menos um fator de virulência, onde os genes traT (54%) e aer (34%) foram os mais prevalentes. A sequncia pCVD432 foi detectado em 6 amostras. No entanto, no ensaio de adeso em clulas Hep-2, doze amostras no apresentaram aderncia (NA 24%). Nas 38 cepas restantes, 24 (48%) apresentaram aderncia agregativa (AA). Observamos aderncia sem padro tpico (SPT) em 48% das amostras, tendo sido dividido em discreto (SPT-D 22%), moderado (SPT-M 18%) e intenso (SPT-I 8%). Notamos os seguintes perfis de resistncia para os antimicrobianos testados: ampicilina (44%), gentamicina (8%), nitrofurantona (2%), norfloxacino (18%) e sulfametozaxol-trimetoprima (34%).
Resumo:
Tese de doutoramento, Cincias e Tecnologias da Sade (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014
