Treatment of tropical forages with exogenous fibrolytiic enzymes: effects on chemical composition and in vitro rumen fermentation

The effects of three treatments of fibrolytic enzymes (cellulase from Trichoderma longibrachiatum (CEL), xylanase from rumen micro-organisms (XYL) and a 1:1 mixture of CEL and XYL (MIX) on the in vitro fermentation of two samples of Pennisetum clandestinum (P1 and P2), two samples of Dichanthium aristatum (D1 and D2) and one sample of each Acacia decurrens and Acacia mangium (A1 and A2) were investigated. The first experiment compared the effects of two methods of applying the enzymes to forages, either at the time of incubation or 24 h before, on the in vitro gas production. In general, the 24 h pre-treatment resulted in higher values of gas production rate, and this application method was chosen for a second study investigating the effects of enzymes on chemical composition and in vitro fermentation of forages. The pre-treatment with CEL for 24 h reduced (p < 0.05) the content of neutral detergent fibre (NDF) of P1, P2, D1 and D2, and that of MIX reduced the NDF content of P1 and D1, but XYL had no effect on any forage. The CEL treatment increased (p < 0.05) total volatile fatty acid (VFA) production for all forages (ranging from 8.6% to 22.7%), but in general, no effects of MIX and XYL were observed. For both P. clandestinum samples, CEL treatment reduced (p < 0.05) the molar proportion of acetate and increased (p < 0.05) that of butyrate, but only subtle changes in VFA profile were observed for the rest of forages. Under the conditions of the present experiment, the treatment of tropical forages with CEL stimulated their in vitro ruminal fermentation, but XYL did not produce any positive effect. These results showed clearly that effectiveness of enzymes varied with the incubated forage and further study is warranted to investigate specific, optimal enzyme-substrate combinations.

Comparative growth of trichoderma strains in different nutritional sources, using bioscreen c automated system

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Biodiversidade do gênero Trichoderma (Hypocreales - fungi) mediante técnicas moleculares e análise ecofisiográfica

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Controle biológico de Moniliophthora perniciosa, agente causal da vassoura de bruxa do cacaueiro, por diferentes espécies e linhagens de Trichoderma spp

Pós-graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia Aplicada) - IBRC

Purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of the catalytic domain of the extracellular cellulase CBHI from Trichoderma harzianum

The filamentous fungus Trichoderma harzianum has a considerable cellulolytic activity that is mediated by a complex of enzymes which are essential for the hydrolysis of microcrystalline cellulose. These enzymes were produced by the induction of T. harzianum with microcrystalline cellulose (Avicel) under submerged fermentation in a bioreactor. The catalytic core domain (CCD) of cellobiohydrolase I (CBHI) was purified from the extracellular extracts and submitted to robotic crystallization. Diffraction-quality CBHI CCD crystals were grown and an X-ray diffraction data set was collected under cryogenic conditions using a synchrotron-radiation source.

Oviposition response of the mosquito, Culex quinquefasciatus to the secondary metabolite(s) of the fungus, Trichoderma viride

Secondary metabolites produced by Trichoderma viride, a deuteromycetes fungus, under submerged culture condition were formulated and evaluated for oviposition attractancy against gravid females of Culex quinquefasciatus mosquito. At a concentration of 10 µg ml-1 the formulation showed remarkable attractancy with an oviposition active index (OAI) of +0.52. When the oviposition attractancy of the formulation was compared with a known oviposition attractant, p-cresol, both at 10 µg ml-1, the former was found to be more attractive to result in 70% egg laying than the later with 30% egg laying. Thin layer chromatography fractions of the secondary metabolites showed that a fraction with Rf value of 0.88 was highly active as oviposition attractant with an OAI of +0.65. Further work on identification of the active principle(s) of the microbial formulation might lead to an oviposition attractant useful in mosquito vector management.

Molecular Identification of Trichoderma spp. in Garlic and Onion Fields and In Vitro Antagonism Trials on Sclerotium cepivorum

ABSTRACT Trichoderma species are non-pathogenic microorganisms that protect against fungal diseases and contribute to increased crop yields. However, not all Trichoderma species have the same effects on crop or a pathogen, whereby the characterization and identification of strains at the species level is the first step in the use of a microorganism. The aim of this study was the identification – at species level – of five strains of Trichoderma isolated from soil samples obtained from garlic and onion fields located in Costa Rica, through the analysis of the ITS1, 5.8S, and ITS2 ribosomal RNA regions; as well as the determination of their individual antagonistic ability over S. cepivorum Berkeley. In order to distinguish the strains, the amplified products were analyzed using MEGA v6.0 software, calculating the genetic distances through the Tamura-Nei model and building the phylogenetic tree using the Maximum Likelihood method. We established that the evaluated strains belonged to the species T. harzianum and T. asperellum; however it was not possible to identify one of the analyzed strains based on the species criterion. To evaluate their antagonistic ability, the dual culture technique, Bell’s scale, and the percentage inhibition of radial growth (PIRG) were used, evidencing that one of the T. asperellum isolates presented the best yields under standard, solid fermentation conditions.

Survival in soil and detection of co-transformed Trichoderma harzianum by nested PCR

The objective of this work was to evaluate the survival of two Trichoderma harzianum co-transformants, TE 10 and TE 41, carrying genes for green fluorescent protein (egfp) and for resistance to benomyl, during four weeks in a contained soil microcosm. Selective culture media were used to detect viable fungal material, whose identity was confirmed by the observation of the fluorescent phenotype by direct epifluorence microscopy. PCR using two nested primer pairs specific to the egfp gene was also used to detect the transformed fungi. Although it was not possible to reliably detect the egfp gene directly from soil extracts, an enrichment step involving selective culture of soil samples in liquid medium prior to DNA extraction enabled the consistent detection of the T. harzianum co-transformants by nested PCR for the duration of the incubation period.

Bioprospecção de isolados de Trichoderma spp. para o controle de Rhizoctonia solani na produção de mudas de pepino

O objetivo deste trabalho foi selecionar e identificar isolados de Trichoderma spp. para o controle do tombamento causado por Rhizoctonia solani (AG-4) em plântulas de pepino (Cucumis sativus L.), além de avaliar o efeito de concentrações crescentes e de combinações dos isolados mais eficientes no controle da doença. Os experimentos foram conduzidos em casa de vegetação, com 490 isolados. O tombamento das mudas foi avaliado uma semana após a aplicação à base das plântulas de substrato infestado com antagonista (1%) e patógeno (1%). Os doze isolados que proporcionaram mais de 85% de redução da doença foram testados em concentrações crescentes para o controle do patógeno (1%): 0,5, 1, 2, 3 e 4%. Também foi avaliado o efeito das combinações dos cinco isolados mais promissores. Os isolados mais efetivos foram identificados pelo sequenciamento da região espaçadores internos transcritos (ITS) do DNA ribossômico. Dos 490 isolados testados 44 (9%) reduziram o tombamento. As concentrações de antagonistas superiores a 2% foram as mais efetivas no controle da doença. Apenas duas combinações resultaram no aumento do controle da doença. Os isolados mais efetivos foram identificados como T. hamatum (IB08, IB30, IB60), T. harzianum (IB34, IB35), T. atroviride (IB13), T. spirale (IB16, IB24) e T. asperellum (IB44). Não foi possível a identificação da espécie de três isolados.

Controle do mofo-branco com palhada e Trichoderma harzianum 1306 em soja

O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da cobertura vegetal com palhada de Brachiaria ruziziensis, da aplicação de Trichoderma harzianum 1306 e da interação entre esses métodos na redução da densidade de inóculo de Sclerotinia sclerotiorum, na incidência de mofo-branco e na produtividade da soja. As avaliações foram realizadas entre 2006 e 2008 em Jataí, GO, em lavoura comercial, com média de 136,08 escleródios do patógeno m-2. Em março e outubro de 2006, foram aplicados 0, 0,5, 1 e 1,5 L ha-1 do inóculo de T. harzianum 1306 (2x10(9) esporos viáveis mL-1) em parcelas cultivadas com e sem B. ruziziensis. Após dessecação da braquiária com glifosato (2,5 L ha-1) e plantio da soja 'M-Soy 6101' sobre 10,1 Mg ha-1 de palhada, verificou-se redução de 98% de apotécios. Nos tratamentos com palhada e 0,5 e 1 L ha-1 de T. harzianum, verificou-se 72,1 e 84,1% de escleródios parasitados a mais, respectivamente. Em 2006/2007, o rendimento da soja 'M-Soy 6101' foi inversamente proporcional à população de apotécios por metro quadrado, porém 7,6% menor nos tratamentos com palha. Na safra 2007/2008, a incidência da doença em soja 'M-Soy 7908' foi menor nas parcelas com palhada e 0,5 e 1 L ha-1 de T. harzianum 1306, aplicados apenas no ano anterior. O biocontrole com T. harzianum 1306 em campo e uso da palhada de B. ruziziensis é eficiente e viável para o controle do mofo-branco da soja em áreas de Cerrado.

Patogenicidade de Pythium aphanidermatum a alface cultivada em hidroponia e seu biocontrole com Trichoderma

O objetivo deste trabalho foi avaliar a patogenicidade de Pythium aphanidermatum a variedades de alface, e a ação do produto Biotrich, formulado com Trichoderma, no controle deste patógeno e na promoção do crescimento das plantas. Em experimento in vitro, plântulas recém-germinadas das variedades de alface Vera e Elisa foram colocadas em placas de Petri com ágar-água e 1 mL de suspensão do produto Biotrich (0,2 mL L-1) e, após 24 horas, em discos com micélio do isolado de Pythium. As avaliações foram realizadas após dez dias de incubação a 20 e 31ºC. Os testes in vivo foram realizados na primavera e verão, em sistema hidropônico "Nutrient Film Technique" (NFT), em delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2x2x2, como segue: duas variedades; presença ou ausência do patógeno; e presença ou ausência de Biotrich. Ao final do cultivo, foram avaliadas as massas de matéria fresca e seca das plantas. No experimento in vitro, P. aphanidermatum apresentou maior agressividade a 31ºC. Contudo, não foi verificada patogenicidade nos testes in vivo. De modo geral, o Biotrich não promoveu o crescimento das plantas, mas foi efetivo no controle do patógeno in vitro. Pythium aphanidermatum é patogênico às variedades de alface Vera e Elisa, a 20 e 31ºC, e o Biotrich é efetivo para o controle desse patógeno nessas temperaturas.

Biocontrol of seed pathogens and growth promotion of common bean seedlings by Trichoderma harzianum

The objective of this work was to evaluate isolates of Trichoderma harzianum regarding biocontrol of common bean seed-borne pathogens, plant growth promotion, and rhizosphere competence. Five isolates of T. harzianum were evaluated and compared with commercial isolate (Ecotrich), Carboxin+Thiram, and an absolute control. Bean seeds of the cultivar Jalo Precoce, contaminated with Aspergillus, Cladosporium, and Sclerotinia sclerotiorum, were microbiolized with antagonists, and seed health tests were carried out. Isolates were evaluated on autoclaved substrate and in field conditions. Ten days after sowing (DAS), plant length was measured. To test rhizosphere competence, isolates were applied in boxes containing autoclaved washed sand, and root colonization was evaluated at 10 DAS, using five plants per box. The most effective isolates in the seed health tests were: CEN287 and CEN289 to control Aspergillus; the commercial isolate to control Cladosporium; and CEN287 and CEN316 to control S. sclerotiorum. Isolates CEN289 and CEN290 promoted bean growth in greenhouse and field. Seed treatment with T. harzianum reduces the incidence of Aspergillus, Cladosporium, and S. sclerotiorum in 'Jalo Precoce' common bean seeds.

Promoção de crescimento e indução de resistência à antracnose por Trichoderma spp. em pepineiro

O objetivo deste trabalho foi determinar o efeito de 60 isolados de Trichoderma e do produto Trichodermil na promoção do crescimento e na indução de resistência sistêmica à antracnose, causada por Colletotrichum lagenarium em pepineiro, além de identificar as espécies dos isolados de Trichoderma spp. efetivas como indutores de resistência. Nos experimentos de promoção de crescimento, os isolados de Trichoderma spp. foram submetidos à inoculação no substrato e, após 21 dias, a massa de matéria seca da parte aérea das plantas foi mensurada. Nos experimentos de indução de resistência, os isolados que promoveram crescimento foram introduzidos no substrato, na base das plantas, sete dias antes da inoculação de C. lagenarium nas folhas. O isolado que apresentou melhor desempenho foi avaliado quanto à redução dos sintomas de antracnose, em aplicações aos 3, 7 ou 14 dias antes da inoculação do patógeno, e quanto à capacidade de aumentar a atividade de peroxidase. Dezenove isolados e o Trichodermil promoveram o crescimento de pepineiro em até 100% e conferiram proteção à antracnose em até 88,39%. O isolado IB 31/06 reduziu a severidade da doença nos intervalos de tempo avaliados. Não foi observado aumento significativo de peroxidase, sete dias após o tratamento com IB 31/06, nas plantas tratadas e infectadas com o patógeno, em comparação às plantas infectadas. O sequenciamento gênico dos dezenove isolados permitiu a identificação de sete espécies distintas de Trichoderma.

Promoção do crescimento do feijoeiro e controle da antracnose por Trichoderma spp

O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de Trichoderma spp. em promover o crescimento de plantas de feijão e reduzir a severidade da antracnose do feijoeiro (Colletotrichum lindemuthianum), bem como identificar os isolados mais eficientes. Sessenta isolados de Trichoderma spp. foram avaliados quanto à capacidade de promoção do crescimento nas plantas. Os sete isolados que mais se destacaram foram adicionados ao substrato de cultivo e avaliados quanto à redução na severidade da antracnose em plantas de feijão tratadas com conídios de C. lindemuthianum. Os mais eficientes no controle da doença foram identificados por sequenciamento de DNA. O isolado IB 28/07 foi avaliado nas concentrações 0,5, 1, 1,5 e 2% (peso:volume), que reduziram a severidade da doença em 41,51, 55,15, 81,82 e 96,06%, respectivamente. Os isolados mais eficientes de Trichoderma spp. podem proporcionar aumentos superiores a 30% na produção de matéria seca da parte aérea das plantas e reduzir a severidade da doença entre 63 e 98%. Esses isolados foram identificados como pertencentes às espécies Trichoderma harzianum, T. strigosum e T. theobromicola.

Biological control of white mold by Trichoderma harzianum in common bean under field conditions

Abstract: The objective of this work was to evaluate Trichoderma harzianum isolates for biological control of white mold in common bean (Phaseolus vulgaris). Five isolates were evaluated for biocontrol of white mold in 'Perola' common bean under field conditions, in the 2009 and 2010 crop seasons. A commercial isolate (1306) and a control treatment were included. Foliar applications at 2x109 conidia mL-1 were performed at 42 and 52 days after sowing (DAS), in 2009, and at 52 DAS in 2010. The CEN287, CEN316, and 1306 isolates decreased the number of Sclerotinia sclerotiorum apothecia per square meter in comparison to the control, in both crop seasons. CEN287, CEN316, and 1306 decreased white mold severity during the experimental period, when compared to the control.