Desenvolvimento e padronização de um método para determinação da sensibilidade do mycobacterium tuberculosis a fármacos contra tuberculose

A resistência a fármacos antituberculose tem constituído uma grande ameaça ao controle da tuberculose em âmbito mundial. A sua detecção precoce permite ao médico instituir um esquema de tratamento mais adequado ao paciente e consequentemente quebrar a cadeia de transmissão dos bacilos. Os testes de sensibilidade a antimicrobianos atuais, embora eficientes, são caros e/ou demorados e/ou trabalhosos. Com base nesta premissa, nos propusemos a desenvolver e padronizar um método fenotípico direto para determinação da sensibilidade do Mycobacterium tuberculosis a antimicrobianos de primeira linha do tratamento da tuberculose. Para o desenvolvimento deste novo teste, utilizaram-se os princípios do método das proporções e do exame de cultura pelo método de Ogawa–Kudoh. O estudo foi dividido em duas fases. A primeira, caracterizada pelo desenvolvimento e padronização do método proposto e a segunda, pela análise da concordância entre o método desenvolvido e o método do MGIT (padrão-ouro). Na primeira fase, foram realizados diversos ensaios para definir: os volumes de absorção e de liberação de líquidos de diferentes tipos de swab, o meio de cultura, as concentrações dos antimicrobianos e o tempo de leitura/interpretação das culturas. Além disso, foi verificado se a amostra deveria ou não ser diluída. Com base nos resultados destes ensaios, padronizou-se o método com: swab comercial, em meio de cultura Ogawa- Kudoh contendo separadamente 0,2 μg/mL de isoniazida, 40,0 μg/mL de rifampicina, 10,0 μg/mL de estreptomicina e 500,0 μg/mL de ácido para-nitrobenzóico. Padronizou-se ainda a inoculação da amostra de escarro de forma direta, ou seja, sem diluir e a leitura/interpretação do resultado do teste no período entre 21 e 28 dias. A análise comparativa entre este método e o teste de sensibilidade a antimicrobianos no sistema MGIT realizada na segunda fase do projeto indicou um índice kappa igual a 1,000, ou seja, uma concordância muito boa em relação ao padrão-ouro. Diante desses resultados promissores, acreditamos que o método desenvolvido apresente um grande potencial para ser utilizado em laboratórios com pouca infra-estrutura, por ser de baixo custo, fácil execução e relativamente rápido.

Efeito de liberadores de óxido nítrico na qualidade fisiológica de sementes de repolho sob salinidade

RESUMO Estudos realizados com Brassica sp. demonstram que o estresse salino afeta a qualidade fisiológica e o vigor das sementes. Assim, a busca por substâncias que minimizem os efeitos provocados pelo estresse salino durante a germinação são de grande importância. Objetivou-se com este trabalho avaliar a ação de substâncias liberadoras de óxido nítrico durante a germinação de sementes de repolho cultivado sob condições de salinidade. As sementes foram pré-embebidas em soluções de nitrato de potássio (KNO3) e nitroprus siato de sódio (SNP) nas concentrações de zero (controle), 0,01, 0,10, 1,00 e 10,00 mmol L-1, por 30 minutos. Posteriormente, distribuídas sobre papel germitest em placas de Petri, umedecido com solução salina de NaCl nos potenciais de zero, -0,6 e -1,2 MPa. Foram avaliados a germinação, primeira contagem de germinação, índice de velocidade de germinação, tempo médio de germinação, comprimento de parte aérea, comprimento de raiz e massa seca das plântulas. Não houve germinação no potencial osmótico de -1,2 MPa. O potencial de -0,6 MPa reduz a germinação e o desenvolvimento das plântulas de repolho. Os resultados sugerem que houve ação positiva do KNO3 e do SNP na concentração de 0,01 mmol L-1, revertendo o estresse provocado pela salinidade (-0,6 MPa de NaCl).

Modelos de resposta à interação entre fármacos anestésicos : análise de regressão e análise de Clusters

Os avanços tecnológicos e científicos, na área da saúde, têm vindo a aliar áreas como a Medicina e a Matemática, cabendo à ciência adequar de forma mais eficaz os meios de investigação, diagnóstico, monitorização e terapêutica. Os métodos desenvolvidos e os estudos apresentados nesta dissertação resultam da necessidade de encontrar respostas e soluções para os diferentes desafios identificados na área da anestesia. A índole destes problemas conduz, necessariamente, à aplicação, adaptação e conjugação de diferentes métodos e modelos das diversas áreas da matemática. A capacidade para induzir a anestesia em pacientes, de forma segura e confiável, conduz a uma enorme variedade de situações que devem ser levadas em conta, exigindo, por isso, intensivos estudos. Assim, métodos e modelos de previsão, que permitam uma melhor personalização da dosagem a administrar ao paciente e por monitorizar, o efeito induzido pela administração de cada fármaco, com sinais mais fiáveis, são fundamentais para a investigação e progresso neste campo. Neste contexto, com o objetivo de clarificar a utilização em estudos na área da anestesia de um ajustado tratamento estatístico, proponho-me abordar diferentes análises estatísticas para desenvolver um modelo de previsão sobre a resposta cerebral a dois fármacos durante sedação. Dados obtidos de voluntários serão utilizados para estudar a interação farmacodinâmica entre dois fármacos anestésicos. Numa primeira fase são explorados modelos de regressão lineares que permitam modelar o efeito dos fármacos no sinal cerebral BIS (índice bispectral do EEG – indicador da profundidade de anestesia); ou seja estimar o efeito que as concentrações de fármacos têm na depressão do eletroencefalograma (avaliada pelo BIS). Na segunda fase deste trabalho, pretende-se a identificação de diferentes interações com Análise de Clusters bem como a validação do respetivo modelo com Análise Discriminante, identificando grupos homogéneos na amostra obtida através das técnicas de agrupamento. O número de grupos existentes na amostra foi, numa fase exploratória, obtido pelas técnicas de agrupamento hierárquicas, e a caracterização dos grupos identificados foi obtida pelas técnicas de agrupamento k-means. A reprodutibilidade dos modelos de agrupamento obtidos foi testada através da análise discriminante. As principais conclusões apontam que o teste de significância da equação de Regressão Linear indicou que o modelo é altamente significativo. As variáveis propofol e remifentanil influenciam significativamente o BIS e o modelo melhora com a inclusão do remifentanil. Este trabalho demonstra ainda ser possível construir um modelo que permite agrupar as concentrações dos fármacos, com base no efeito no sinal cerebral BIS, com o apoio de técnicas de agrupamento e discriminantes. Os resultados desmontram claramente a interacção farmacodinâmica dos dois fármacos, quando analisamos o Cluster 1 e o Cluster 3. Para concentrações semelhantes de propofol o efeito no BIS é claramente diferente dependendo da grandeza da concentração de remifentanil. Em suma, o estudo demostra claramente, que quando o remifentanil é administrado com o propofol (um hipnótico) o efeito deste último é potenciado, levando o sinal BIS a valores bastante baixos.

Optimização de um método de avaliação simultânea da dissolução e permeabilidade de fármacos

Englobado na temática do desenvolvimento de métodos in vitro para avaliação da biodisponibilidade de fármacos, este trabalho de investigação teve como objectivo a optimização de um método para avaliar em simultâneo a dissolução e permeabilidade de fármacos usando uma célula de fluxo bilateral com membranas de Polyvinylidene Fluoride (PVDF). Através de uma avaliação inicial, na qual se testou o efeito de diversas variáveis na permeabilidade da cafeína e do ácido acetilsalicílico, obtiveram-se resultados que permitiram concluir que os ensaios realizados são mais reprodutíveis, quando a célula de fluxo é utilizada em circulação unilateral no lado dador e com agitação do lado aceitador. Observou-se ainda que o método permite detectar a influência do pH (Papp da cafeína a pH 7,4 e 4,5: 4,84±1,57x105cm.s-1 e 6,00±0,70x105cm.s app do ácido acetilsalicílico a pH 7,4 e 4,5: 3,85±0,38x10-5cm.s-1 e 5,1 1±0,65x105cm.s-1) e dos excipientes (Papp da cafeína isoladamente e em presença de excipientes: 6,76±1,22 x 10-5cm.s1 e 5,84±0,43x10-5cm.s-1 app do ácido acetilsalicílico isoladamente e em presença de excipientes: 7,07±1,56x105 cm.s e 5,19±0,23x10-5cm.s1) na permeabilidade dos compostos. Na avaliação da dissolução testou-se um método descrito na United States Pharmacopeia (USP) com meio de dissolução a pH 4,5 e um método com meio de dissolução a pH 7,4 pois na perspectiva de no futuro se realizarem ensaios com membranas celulares Caco-2, foi necessário testar um meio compatível com estas. As percentagens de dissolução dos ensaios a pH 7,4 foram de 96,3% para a cafeína e de 87,1% para o ácido acetilsalicílico, o que permitiu a utilização deste meio, visto ter sido superior ao limite mínimo de 80% estabelecido pela USP. Após estabelecimento das metodologias de dissolução e permeabilidade individuais, passou-se ao acoplamento das duas técnicas, tendo sido realizados ensaios de dissolução/permeabilidade com uma forma farmacêutica contendo os dois compostos em estudo (Melhoral®), nos quais se obtiveram permeabilidades aparentes de 3,97±0,37x105cm.s1 e 3,69±0,29 x105cm.s para a cafeína e ácido acetilsalicílico a pH 4,5 e de 3,77±0,40x105cm.s e 4,08± 0,04x1 05cm.s1 para a cafeína e ácido acetilsalicílico a pH 7,4, resultados estes que foram reprodutíveis e descriminativos e que perspectivam a possibilidade da utilização do sistema para futuros trabalhos envolvendo membranas de culturas celulares (Caco-2) ou tecidos (pele ou intestino).

Fármacos com implicação na visão

Na terapêutica ocular há que considerar: 1. O tratamento propriamente dito das afecções oculares; 2. Os efeitos sistémicos dos medicamentos usados na terapêutica ocular; 3. Os efeitos dos medicamentos usados em terapêutica sistémica sobre as estruturas oculares. Medicamentos mais associados à toxicidade ocular: bifosfonatos, topiramato, vigabatrina, isotretinoína e outros retinóides, amiodarona, cloroquina e hidroxicloroquina, tamoxifeno, quetiapina, inibidores selectivos da COX-2, sildenafil.

Síntese e caracterização de redes metalo-orgânicas de fármacos

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Biológica

Interacção Parasita-Hospedeiro e susceptibilidade de Leishmania infantum a fármacos

RESUMO As leishmanioses são doenças causadas por um protozoário intracelular pertencente à ordem Kinetoplastida, da família Trypanosomatidae, do género Leishmania. Os parasitas são transmitidos aos hospedeiros vertebrados por dípteros pertencentes à sub-família Phlebotominae. Devido à inexistência de vacinas a quimioterapêutica continua a representar o único mecanismo de prevenção e controlo. Os fármacos de primeira linha para o tratamento da leishmaniose visceral continuam a ser os antimoniais pentavalentes e a anfotericina B (AMB). A AMB lipossómica está a ser cada vez mais utilizada como 1ª linha. O conhecimento do(s) mecanismo(s) utilizados pelos parasitas, responsáveis pela resistência, é fundamental de modo a permitir o desenvolvimento de novos fármacos anti-Leishmania que possam substituir e/ou complementar os fármacos existentes, de uma forma eficaz assim como contribuir para o desenvolvimento de metodologias para avaliar e monitorizar a resistência. Espera-se do modelo animal a reprodução da infecção na Natureza. Os modelos canino e murino têm ajudado na compreensão dos mecanismos responsáveis pela patogénese e pela resposta imunitária à infecção por Leishmania. Sendo o cão o principal hospedeiro da infecção por L. infantum e o principal reservatório doméstico da leishmaniose visceral humana, procedeu-se à caracterização da evolução da infecção experimental em canídeos de raça Beagle através da análise clínica, hematológica, histopatológica, parasitária, assim com através da resposta imunitária desenvolvida. As alterações hematológicas observadas foram as associadas à leishmaniose visceral: anemia, leucopenia, trombocitopenia com aumento das proteínas totais e da fracção gama-globulina, e diminuição da albumina. Histologicamente observou-se nos órgãos viscerais uma reacção inflamatória crónica, acompanhada por vezes da formação de granulomas ricos em macrófagos. Apesar de todos os animais terem ficado infectados (confirmado pela presença do parasita nos vários tecidos e órgãos recolhidos na necrópsia), os únicos sinais clínicos observados transitoriamente foram adenopatia e alopécia. As técnicas moleculares foram significativamente mais eficazes na detecção do parasita do que os métodos parasitológicos convencionais. As amostras não invasivas (sangue periférico e conjuntiva) mostraram ser significativamente menos eficazes na detecção de leishmanias. No nosso modelo experimental não se observou a supressão da resposta celular ao antigénio parasitário e confirmou-se que, apesar de não protectora, a resposta humoral específica é pronunciada e precoce. A bipolarização da resposta imunitária Th1 ou Th2, amplamente descrita nas infecções experimentais por L. major no modelo murino, não foram observadas neste estudo. O facto dos animais não evidenciarem doença apesar do elevado parasitismo nos órgãos viscerais poderá estar relacionado com a expressão simultânea de citocinas de ambos os tipos Th1 e Treg, no baço, fígado, gânglio, medula óssea e sangue periférico. Neste estudo também se caracterizou o efeito da saliva do vector Phlebotomus perniciosus na infecção experimental de murganhos BALB/c com estirpes de L. infantum selvagem e tratada com AMB, inoculadas por via intradérmica. A visceralização da infecção ocorreu após a utilização da via de administração do inóculo que mais se assemelha ao que ocorre na Natureza. Apesar da disseminação dos parasitas nos animais co-inoculados com extracto de uma glândula salivar ter sido anterior à do grupo inoculado apenas com parasitas, não se detectaram diferenças significativas na carga parasitária, entre os três grupos, ao longo do período de observação pelo que, embora a saliva do vector esteja descrita como responsável pela exacerbação da infecção, tal não foi observado no nosso estudo. O aumento de expressão de citocinas esteve relacionado com o aumento do parasitismo mas, tal como no modelo canino, não se observou bipolarização da resposta imunitária. Os animais dos três grupos infectados parecem ter desenvolvido nos diferentes órgãos uma resposta mista dos tipos Th1 e Th2/Treg. Contudo, verificou-se a predominância da expressão Th1 (TNF-α), no fim do período de observação, o que pode estar relacionado com a resolução da infecção. Por outro lado, a presença de parasitas na pele dos animais inoculados com a estirpe L. infantum tratada com AMB permite colocar a hipótese da existência de parasitas resistentes na Natureza e destes poderem ser transmitidos. Após se ter verificado que a estirpe de L. infantum tratada com AMB tinha a capacidade de infectar e visceralizar no modelo murino, analisou-se o seu comportamento em dois dos principais vectores de L. infantum, Lutzomyia longipalpis e P. perniciosus. Os parasitas tratados com AMB apresentaram uma menor capacidade de permanecerem no interior do vector assim como um desenvolvimento mais lento apontando para uma menor capacidade de transmissão das estirpes resistentes a este fármaco, pelo que o tratamento com AMB poderá ser favorável à prevenção e controlo através da interrupção do ciclo de vida do parasita. De modo a determinar in vitro a susceptibilidade de Leishmania aos diferentes fármacos utilizados na terapêutica da leishmaniose humana e canina (Glucantime®, Fungizone®, miltefosine e alopurinol) comparou-se o sistema de promastigotas axénicos com o sistema amatigota-macrófago. Verificou-se que, para as estirpes estudadas, os resultados de ambos os sistemas não apresentavam diferenças significativas sendo a utilização do primeiro mais vantajosa ao ser menos moroso e de mais fácil execução. Seleccionaram-se estirpes quimio-resistentes in vitro, por exposição prolongada a doses crescentes de AMB, tendo-se verificado que os parasitas tratados, apresentaram uma menor susceptibilidade do que os não tratados à acção dos fármacos estudados, com excepção do alopurinol. A diminuição da susceptibilidade das estirpes aos fármacos utilizados poderá facilitar a dispersão de parasitas multiresistentes. Sendo a apoptose um dos mecanismos utilizados pelos parasitas para evitar a indução de uma resposta imune por acção de compostos anti- Leishmania, determinou-se o número de amastigotas apoptóticos assim como a produção de TNF-α e IL-10 pelos macrófagos tratados. Concluiu-se que os compostos conseguiram suprimir a produção de IL-10, inibidora da activação dos macrófagos, contudo nem a produção da citocina pro-inflamatória TNF- α nem a apoptose pareceram ser os principais mecanismos responsáveis à sobrevivência dos parasitas ao contacto com os fármacos.

Preparação e caracterização de micropartículas de polissacáridos para libertação controlada de fármacos anticancerígenos no cólon

Dissertação para a obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Química e Bioquímica

Interacções de proteínas do plasma com potenciais fármacos: estudos 3D a nível molecular

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Utilização de Stents Revestidos com Fármaco em Angioplastia Primária - Resultados Clínicos a Longo Prazo

INTRODUCTION: The use of drug-eluting stents in the context of mechanical reperfusion following ST-segment elevation myocardial infarction (MI) was initially viewed with concern. The main fear was that the drugs' action in unstable lesions could increase the risk of thrombotic stent occlusion. Furthermore, there was no evidence that the proven benefit of reduced instent restenosis could be extended to such patients, since they were excluded from the initial clinical trials. OBJECTIVES: To assess the safety and long-term clinical outcomes of the use of drug-eluting stents in primary angioplasty. METHODS: The first 100 consecutive and non-selected patients admitted for MI and treated by primary angioplasty with drug-eluting stent implantation in the target lesion were analyzed retrospectively. The efficacy and safety of the procedure, in-hospital clinical evolution and the occurrence of major adverse cardiac events in the first year were assessed. RESULTS: Patients' mean age was 58.2 +/- 11.5 years, and 78 were male. The success rate of primary angioplasty was 99%. Stents coated with sirolimus were used in 67 patients, paclitaxel in 19 and dexamethasone in 16. In-hospital mortality was 3%. The follow-up rate at 12 months was 98%. During this period, the rate of target vessel revascularization was 1% (with no patient requiring target lesion revascularization), MI 2%, and overall mortality 3.9%. Fourteen patients had clinical indication for repeat coronary angiography, which showed no significant in-stent restenosis. One event was considered to be due to acute stent thrombosis. The incidence of major adverse events was 5.9%. CONCLUSION: The use of drug-eluting stents in MI patients undergoing primary mechanical revascularization is safe and is associated with a reduced incidence of major adverse events, thrombosis and clinical restenosis at one year.

Fractura de Stent: Caso Clínico e Revisão da Literatura

Apresentamos o caso de um doente, previamente submetido a angioplastia coronária com um stent revestido com fármaco, com enfarte agudo do miocárdio (EAM) provocado por trombose tardia do stent, tendo sido detectada fractura do mesmo. Este caso vem reforçar o reconhecimento crescente da fractura como potencial mecanismo para a trombose tardia de stent, na era dos stents revestidos com fármaco. A propósito deste caso clínico, apresentamos uma revisão da literatura sobre fractura de stent, nomeadamente sobre a sua incidência, mecanismos subjacentes e complicações clínicas.

Uso (ou Abuso) de Fármacos na Idade Pediátrica

Introdução e Objectivos: A exposição a fármacos na idade pediátrica pode ser nociva. A utilização elevada de medicamentos não aprovados em Pediatria, bem como o uso para sintomas em que a sua eficácia não foi comprovada, tem sido descrita de forma preocupante. Foi objectivo deste estudo avaliar o padrão de consumo de fármacos numa população pediátrica portuguesa. Métodos: Estudo transversal, com recrutamento prospectivo dos casos e amostra de conveniência; recolha de dados por inquérito; incluídas crianças, sem doença crónica, que recorreram ao serviço de urgência de um hospital na área da Grande Lisboa, num período de dois meses. Resultados: Foram incluídas 189 crianças com idade média de 5,8 anos. A proporção de crianças com consumo de fármacos, nos trêsmeses precedentes, foi de 120/189 (63,5%) – superior entre os seis e 24 meses (74%vs 58,5%; p=0,038).Os fármacos mais prescritos foram os analgésicos/antipiréticos e anti-inflamatórios (83/202, 41,1%), os antibióticos (52/202, 25,8%) e os anti-histamínicos (14/202, 7%). Em 96/202 casos (47,5%) eram medicamentos não sujeitos a receita médica e em 33/174 (19,1%) “automedicações”. Verificou-se utilização de anti-histamínicos, expectorantes, analgésicos e anti-inflamatórios não recomendados para a faixa etária. O consumo de antibióticos foi mais elevado entre os seis e 24 meses (36%vs 18,5%; p=0,012), com predomínio da associação amoxicilina/ácido clavulânico (21/52, 40,4%). Em seis casos foram relatados possíveis efeitos secundários. Conclusões: De acordo com o nosso conhecimento este é o primeiro estudo em Portugal a avaliar o padrão de utilização de fármacos em Pediatria. Este consumo foi elevado, sobretudo na infância precoce, evidenciando a necessidade de vigilância e regulamentação adequadas. Os medicamentos não sujeitos a receita médica, amplamente utilizados, poderão associar-se a riscos acrescidos, pela facilidade no seu acesso. O uso frequente de antibióticos, sobretudo de largo espectro, poderá vir a associar-se ao desenvolvimento de resistências.

Alergia a Fármacos com Manifestações Cutâneas. Abordagem Diagnóstica

As reacções adversas a fármacos (RAF) representam um problema frequente na prática clínica. A alergia a fármacos resulta de mecanismos de hipersensibilidade imunológica e representa 6-10% do total de RAF. Clinicamente, as reacções alérgicas a fármacos podem ser classificadas como imediatas (tipo I) ou não-imediatas (com manifestações clínicas diversas e associadas sobretudo a reacções de tipo IV). Neste artigo são abordados aspectos gerais, nomeadamente os mecanismos imunopatogénicos implicados na alergia a fármacos e reactividade cruzada mas também as manifestações cutâneas mais relevantes, nomeadamente exantemas máculo-papulares, eritema fixo a fármacos (EFF), pustulose exantemática aguda generalizada (PEAG), síndrome de hipersensibilidade a fármacos (DRESS – drug rash with eosinophilia and systemic symptoms), síndrome de Stevens-Johnson/necrólise epidérmica tóxica (SSJ/NET). O papel dos testes cutâneos (epicutâneos ou intradérmicos de leitura tardia) na abordagem de reacções não-imediatas é também revisto. Os beta-lactâmicos (BL) são o grupo farmacológico mais frequentemente envolvido em reacções de hipersensibilidade imunológica e que mais dificuldades coloca na prática clínica diária, nomeadamente devido aos riscos de reactividade cruzada, pelo que é analisado em maior detalhe ao longo da revisão. A indução de tolerância a fármacos poderá ser considerada em casos selecionados, sobretudo quando na ausência de alternativas terapêuticas igualmente eficazes ou seguras.

Estenose Intra-Stent na Artéria Femoral Superficial: Soluções Actuais Para um Problema Crescente

Os últimos anos de tratamento da doença arterial obstrutiva periférica na artéria femoral superficial observaram uma mudança de paradigma, da cirurgia clássica para a endovascular, o que se traduziu na utilização progressiva de stents metálicos para a manutenção da permeabilidade a longo prazo. Apesar dos avanços tecnológicos, a restenose intra-stent é uma das principais limitações do tratamento endovascular, com um tratamento complexo e não consensual, traduzindo a escassez de resultados obtidos ou a sua manutenção no tempo. Os autores procuraram recolher os dados mais recentes sobre este tipo de patologia e as principais opções disponíveis para o seu tratamento.