Sequence evolution of the CCR5 chemokine receptor gene in primates

The chemokine receptor CCR5 can serve as a coreceptor for M-tropic HIV-1 infection and both M-tropic and T-tropic SIV infection. We sequenced the entire CCR5 gene from 10 nonhuman primates: Pongo pygmaeus, Hylobates leucogenys, Trachypithecus francoisi, Trachypithecus phayrei, Pygathrix nemaeus, Rhinopithecus roxellanae, Rhinopithecus bieti, Rhinopithecus avunculus, Macaca assamensis, and Macaca arctoides. When compared with CCR5 sequences from humans and other primates, our results demonstrate that:(1) nucleotide and amino acid sequences of CCR5 among primates are highly homologous, with variations slightly concentrated on the amino and carboxyl termini; and (2) site Asp13, which is critical for CD4-independent binding of SIV gp120 to Macaca mulatta CCR5, was also present in all other nonhuman primates tested here, suggesting that those nonhuman primate CCR5s might also bind SIV gp120 without the presence of CD4. The topologies of CCR5 gene trees constructed here conflict with the putative opinion that the snub-nosed langurs compose a monophyletic group, suggesting that the CCR5 gene may not be a good genetic marker for low-level phylogenetic analysis. The evolutionary rate of CCR5 was calculated, and our results suggest a slowdown in primates after they diverged from rodents. The synonymous mutation rate of CCR5 in primates is constant, about 1.1 x 10(-9) synonymous mutations per site per year. Comparisons of K-a and K-s suggest that the CCR5 genes have undergone negative or purifying selection. K-a/K-s ratios from cercopithecines and colobines are significantly different, implying that selective pressures have played different roles in the two lineages.

Intra- and interspecific variation of the CCR5 gene in higher primates

We have evaluated the molecular evolution of the chemokine receptor CCR5 in primates. The chemokine receptor CCR5 serves as a major co-receptor for human immunodeficiency virus/simian immunodeficiency virus (HIV/SIV) infection. Knowledge of evolution of the CCR5 molecule and selection on the CCR5 gene may shed light on its functional role. The comparison of differences between intraspecific polymorphisms and interspecific fixed substitutions provides useful information regarding modes of selection during the course of evolution. There is marked polymorphism in the CCR5 gene sequence within different primate species, whereas sequence divergence between different species is small. By using contingency tests, we compared synonymous (SS) and nonsynonymous (NS) CCR5 mutations occurring within and between a broad range of primates. Our results demonstrate that CCR5 evolution did not follow expectations, of strict neutrality at the level of the whole gene. The proportion of NS to SS at the intraspecific level was significantly higher than that observed at the interspecific level. These results suggest that most CCR5 NS polymorphisms are slightly deleterious. However, at domains more closely correlated with its known biological functions, there was no obvious evidence to support deviation from neutrality.

平顶猴TRIM5α基因变异影响其抗HIV-1功能

目的:解释平顶猴成为唯一能够被HIV-1感染的旧大陆猴以及在被SIV感染时出现较其他旧大陆猴严重临床症状的原因.方法:参考人TRIM5α基因的结构和序列合成引物,以平顶猴DNA 为模板,分别扩增其TRIM5α基因编码序列的所有外显子.利用生物学软件分析获得的编码序列,分析在已经明确与TRIM5α抗病毒功能密切相关的几个位点上是否发生可能影响其功能的突变.结果:在平顶猴基因组上CypA基因融合到TRIM5α基因第八外显子的下游,融合方式与在鹰猴中发现的CypA与TRIM5α的融合方式完全不同.恒河猴TRIM5α基因具有限制HIV-1复制的功能,第332位脯氨酸对其抗病毒功能非常重要,但在平顶猴的TRIM5α上,该氨基酸突变成谷氨酰胺;第335位以后8个氨基酸对恒河猴TRIM5α抗病毒功能也有重要影响,但在平顶猴的TRIM5α上,与其对应的氨基酸片段不仅缺失了两个氨基酸,还有两个氨基酸发生突变,附近区域还有另外两个发生突变.在平顶猴TRIM5α基因的Coiled-Coil结构域插入了13个氨基酸,但没有影响到编码框.结论:在平顶猴的基因组上CypA与TRIM5α的融合以及平顶猴TRIM5α基因抗病毒功能关键位点上的氨基酸突变可能影响其抗病毒功能,是其成为唯一能够被HIV-1感染的旧大陆猴以及在被SIV感染时出现较其他旧大陆猴严重临床症状的重要原因.

灵长类动物模型在抗艾滋病毒药物研究中的应用

艾滋病(AIDS)灵长类动物模型广泛用于艾滋病毒(HIV)研究.较为常用的有猴免疫缺陷病毒(SIV)/猕猴模型和猴/人免疫缺陷嵌合病毒(SHIV)/猕猴模型,除了在发病机制和抗HIV疫苗研究中的重要作用外,这2种模型在抗HIV药物研究中同样显示出优越性和实用性,体现在药物疗效的研究、新药的开发、耐药性研究、机体免疫反应在药物治疗作用的研究中.通过这些体内抗病毒活性及机制的研究,可进一步揭示药物的抗HIV疗效,对AIDS的临床用药具有重要的指导作用,将使人们重新考虑抗HIV药物的用药原则和药效评价标准.

人类AIDS 的研究替身———非人灵长类动物模型

　非人灵长类动物模型在艾滋病发病机理、传播途径、免疫反应以及疫苗开发药物治疗等方面的研究具有重要作 用。根据不同的免疫缺陷病毒感染不同的灵长类动物,可将这一模型分为不同的种类, 其中HIV/ 黑猩猩模型、SIV/ 猕猴模型和SHIV/ 猕猴模型是目前应用最为广泛的模型。这几种模型都各有其优缺点,本文将简单介绍这几种艾滋 病非人灵长类动物模型的研究概况。

猴获得性免疫缺陷综合症(SAIDS)的研究概况

目前已分离到四种不同的猴的Lantiviruses(SIV)型, 已有5种不同血清型的 SRV被认识。与 人的AIDS相比, 猴的SAIDS表现得更加急性, SAIDS病毒破坏的 宿主免疫细胞种类也比AIDS病毒多。参14

Effects of testosterone undecanoate as a male contraceptive candidate on rat immunological features

Testosterone undecanoate (TU) is under phase III clinical trial as a hormonal male contraceptive in China. Sex hormones can modulate the immune system. Female hormonal contraceptives may affect SIV/HIV-1 transmission. To evaluate the safety of TU and to understand whether long-term use of TU for a male contraceptive affects users' immunological features, adult male rats were treated for a 32-week TU-treated phase at the dose of 20 mg TU/kg body weight and a 24-week recovery phase. The reproductive and immunological parameters of 4-6 rats in each subgroup were examined at the stated time point. The mean sperm count and viability in the treated rats were significantly suppressed (p < 0.01). In the TU-treated group: the mean blood leukocyte and lymphocyte counts; the proliferation indexes of T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and spleen; and, of B cells from spleen, as well as the mean counts of blood T, NK, and B cells decreased in comparison with those of control group. These decreases were not significant (p > 0.01). Similarly, the mean serum IgM, IgG, and IgA levels and complement activity in TU-treated rats were lower than those in control group (p > 0.01), and the changes in the antibody levels of the examined genital secretions were not significant (p > 0.01). The changes in the thickness of urethra epithelium, and in secretory component (SC) expression in genitals were not observed in the treated group. These results demonstrated that long-term supraphysiological TU injection did not obviously affect the examined rat immunological parameters.

AIDS猕猴模型在HIV疫苗研究中的应用

：对HIV 疫苗的研究一直是国际上艾滋病方面研究的热点和难点。动物模型则为疫苗研究必不可缺少的 重要工具，缺乏合适的动物模型很大程度上制约了AIDS疫苗的研究。目前在国际上SIV 或SHIV 感染的猕猴模 型为最常用的AIDS研究模型，受猕猴背景及病毒特性等多种因素的影响，使得以上两种模型在HIV疫苗研究中 仍存在一定的局限性。为了更好地发挥猕猴模型在HIV疫苗研究中的巨大潜力，开发理想的AIDS猕猴模型已成 为目前HIV疫苗研究的首要任务。本文简要介绍了AIDS疫苗的研发策略、研发概况以及SIV／SHIV猕猴模型在 HIV疫苗中的应用，并对其中存在的问题及其应用前景进行了探讨。

Establishment of AIDS Animal Model with SIVmac239 Infected Chinese Rhesus Monkey

In the present research, two Chinese rhesus monkeys were inoculated intravenously with 5000 TCID50 of SIVmac239. The changes in the numbers of CD4+ T lymphocyte in peripheral blood, plasma viral loads, proviral DNA and humoral antibodies against virus were periodically monitored during 121 days. At the early stage of infection, proviral DNA had been detected in PBMCs, and infectious SIVmac239 virus had been isolated from PBMCs. At the same period, the numbers of CD4+ T lymphocytes were significantly decreased, and maintained at low level during the 121-day period of infection. Plasma viral loads reached the peak at week 2 post-inoculation and kept at a steady state subsequently. Moreover, antibodies against viral proteins were detected from plasma. All the results showed that the two Chinese rhesus monkeys had been infected with SIVmac239 successfully. This animal model can be applied for further AIDS researches.

TRIM5α基因的分子进化及AIDS 免疫治疗相关腺病毒载体的构建

本文包括两方面的研究工作。第一部分对TRIM5α基因在灵长类动物中的分 子进化进行了详尽的研究，希望能从分子进化的角度认识该基因在灵长类动物抵 抗病毒感染尤其是在限制HIV-1 感染过程中所起的作用，并希望能够从中寻找适 合用于AIDS 基因治疗的基因。第二部分构建了艾滋病治疗性DC 疫苗相关的腺 病毒载体，包括表达HIV-1 gp120 基因、表达HIV-1 gp41 基因、表达HSP70 基 因以及仅表达绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒，为利用HIV-1 抗原刺激的DC 免 疫治疗AIDS 的研究奠定了基础。 在长期的HIV-1 和AIDS 研究中，人们发现很多种旧大陆猴不能被HIV-1 感 染，而旧大陆猴中的平顶猴却对HIV-1 有易感性，并且对SIV 的感染也表现出较 其它旧大陆猴更为严重的症状，TRIM5α基因的发现解释了这一“历史之谜”。人 们发现旧大陆猴的TRIM5α基因具有很强的抗HIV-1 的功能，是旧大陆猴抵抗 HIV-1 感染必须的免疫因子；并且进一步证明TRIM5α是灵长类动物中普遍存在 的、具有抗多种逆转录病毒功能的天然免疫因子。我们通过对TRIM5α基因在灵 长类动物中的分子进化研究发现，证明该基因在进化过程中表现出很强的达尔文 正向选择作用，尤其是其负责识别逆转录病毒衣壳蛋白的SPRY 结构域。TRIM5 α基因表现出的正向选择很可能是灵长类动物在长期的进化过程中反复被病毒 感染的选择压力造成的，这也从另一个方面证明TRIM5α基因是一个普遍存在的、 具有抗病毒功能的天然免疫因子。对不同灵长类动物的TRIM5α基因序列分析发 现，该基因的序列变化很大，这可能是不同灵长类动物被HIV-1 感染后表现不同 症状的原因；基于密码子的中性检测证明，TRIM5α基因SPRY 结构域上第347、 354、552 位氨基酸表现出很强的正向选择，说明这些位点可能与其抗病毒功能 关系紧密。另外，我们发现平顶猴的TRIM5α基因与CypA 基因以一种新的方式 融合，这种融合方式不同于鹰猴中该基因与CypA 基因的融合，而且与具有较强抗HIV-1 功能的恒河猴的TRIM5α基因比较，平顶猴的TRIM5α基因在几个与其 抗病毒功能紧密相关的位点上的氨基酸也发生了变化，这可能是其被HIV-1 和 SIV 感染后表现出较其它旧大陆猴更为严重症状的原因。 将经过HIV-1 抗原刺激的DC 回输到HIV-1 感染者体内可以诱导产生较强的 抗HIV-1 细胞免疫反应，这种免疫反应理论上可以治疗AIDS，而且对HARRT 治 疗能够产生很好的协同作用；HSP70 蛋白可以提高DC 对抗原的加工和呈递。为 了检测经HIV-1 抗原刺激的DC 免疫治疗AIDS 的实际效果，同时检验通过HSP70 增强DC 对HIV-1 抗原的加工和呈递功能，发现并解决这一治疗方案存在的问题， 我们首先从HIV-1 的基因组及带有HSP70 基因的质粒上克隆了gp120、gp41 和 HSP70 基因，测序及序列分析证明所克隆的基因没有发生影响表达的突变。然后 我们分别构建了表达有关基因的重组腺病毒载体。在荧光显微镜下可以观察到感 染后的细胞内绿色荧光蛋白报告基因的表达，证明成功构建了四种重组腺病毒， 而PCR 扩增也证明在其中三种重组腺病毒的基因组上确实分别带有gp120、gp41、 HSP70 基因。同时我们还构建了不表达外源基因的重组腺病毒，作为未来实验中 的对照载体。未来的研究工作包括目的基因表达检测，重组腺病毒感染DC 及腺 病毒感染DC 功能分析等。

调节性T细胞在SIVmac239感染中国恒河猴中的变化及其机制的初步研究

CD4+CD25+调节性T细胞是1995年才发现的一个具有免疫抑制功能的T细胞亚群，主要通过细胞与细胞间直接接触和分泌抑制性细胞因子发挥作用，在维持机体免疫自稳、防止自身免疫以及肿瘤免疫、移植免疫等方面起着重要作用。有关Treg HIV/SIV病毒感染及AIDS的进展关系密切，但却有两种不同的观点。一种认为Treg的数量和功能受到损伤，从而导致宿主免疫系统过度活化。另一种则认为Treg在早期抑制了针对HIV/SIV的特异性的免疫反应，从而导致机体无法清除感染的病毒。本文利用动物模型对CD4+CD25+调节性T细胞在SIV感染后的数量和功能做了动态的检测，并对其中的机制做了初步的探讨。我们首先建立了SIVmac239病毒株对中国起源的恒河猴感染的动物模型，建立了前病毒的检测方法、血浆病毒载量的测定方法、血浆病毒特异性抗体的测定方法，以及病毒的分离方法，并获得了早期感染的相关数据。在研究中我们发现，SIV感染后的1周后即可在恒河猴外周单个核细胞DNA中检测到前病毒。病毒血症也在1周后出现，并很快达到高峰。不同的个体对病毒感染的体液免疫不尽相同，血浆抗体很快出现，但是99003猴抗体下降很快，而99083猴则保持了一定数量的抗体。同时，伴随SIV的感染进程的还有T淋巴细胞的数量变化，CD4+T细胞数量持续下降，而CD8+T细胞数量则在增加，出现CD4/CD8倒置的现象。以上说明恒河猴被SIV所成功感染。在该动物模型的基础上，我们利用体内传代的SIVmac239病毒株，对4只健康恒河猴进行了感染，并对CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）亚群在数量上的变化进行了检测，并对其中的机制做了初步探讨。我们在研究中发现，外周血中的Treg在SIV感染后无论是绝对数量还是在占CD4+T细胞中的相对数量均有增加，而且Treg仍然保持了对靶细胞的抑制功能。对腹部淋巴结的分析显示，SIV感染后的一段时期内，该部位FoxP3 mRNA的表达水平也在上升，TGF-β、IL-10的转录也显著增加。前者可以通过抑制树突状细胞间接抑制效应细胞，而后者则是一个抑制性的细胞因子，可以直接作用于靶细胞。因此，我们推测SIV引起免疫系统的过度活化可能不是由于Treg功能的受损，其中的机制需要深入研究。 Treg表达CCR5表面分子（HIV辅助受体之一），同时也有CD4分子的表达，因此推测HIV/SIV可以感染Treg。但是国内外这方面的文献很少。我们对Treg中前病毒的检测发现，SIV可以感染Treg，而且对Treg的感染比例高于CD4+CD25－T细胞。这个结果与Treg绝对数量的上升的结果说明，SIV感染Treg但可能却没有杀伤Treg，因此Treg在数量上有所增加。不过，其中的机制仍有待于进一步的研究。在对SIV引起的体液免疫的研究中还发现，机体针对SIV不同抗原的抗体有不同的模式。部分抗原很快就产生了比较强的反应，但是却不能维持高水平的表达。而针对p27蛋白的抗体产生比较晚，但却长时间维持在比较高的水平。是否这样高水平的抗体有助于控制病毒复制是个值得探讨的问题。

树突状细胞亚群在SIVmac239感染中国恒河猴中数量、表型和功能变化及其机制的研究

本论文主要由3 个相对独立的部分组成：中国恒河猴单核细胞来源的树突 状细胞的表型及功能研究；外周血DC 亚群在SIVmac239 感染的中国恒河猴中 数量及细胞因子的变化以及急性感染期SIVmac239 对中国恒河猴外周血DC 亚 群的凋亡和免疫表型的影响。 非人灵长类动物是人类的近亲，由于在组织结构、免疫、生理和代谢等诸 多方面与人类高度近似，科学界较普遍地利用非人灵长类作为动物模型来进行 艾滋病（AIDS）的发病机制和疫苗研究。中国恒河猴发病缓慢，更适合于HIV 感染的相关研究。在本研究中，我们在体外成功培养了中国恒河猴单核细胞来 源的树突状细胞（monocyte derived dendritic cells，MDDC），并测定其表型和免 疫刺激功能。通过GM-CSF 和IL-4 共同刺激培养单核细胞6 天以后便获得了未 成熟MDDC，随后加入IL-1β、PGE2、LPS 和TNF-α 联合刺激MDDC 成熟。 成熟的MDDC 上调了共刺激分子和CD83 的表达，具有很强的刺激T 淋巴细胞 增殖的能力并分泌大量的IL-12。本研究为后续的DC 疫苗研究奠定了基础。 我们实验室建立了SIVmac239 感染的中国恒河猴动物模型。以该模型为依 托，我们研究了外周血中DC 亚群在急性感染期以及慢性感染期的数量、表型 及功能变化。DC 作为最重要的连接先天免疫与获得性免疫的抗原递呈细胞， 在AIDS 发病进程中扮演着重要的角色。研究发现AIDS 患者血液和淋巴结中 髓样DC（myeloid DC，mDC）和浆细胞样DC（plasmacytoid DC，pDC）会随 着感染的进程而减少，并且伴随着功能损伤。本论文通过研究发现，中国恒河 猴的DC 亚群数量在感染后尽管波动十分剧烈，但并没有显著性地增加或减少， 中文摘要 2 在后期DC 数量能够回升到正常的范围之类，这种回升不同于印度恒河猴，很 可能是中国恒河猴缓慢发病的原因之一。进一步通过研究体外刺激DC 亚群分 泌的细胞因子，我们发现在急性感染期，pDC 分泌的IFN-α 显著提高，并很可 能刺激mDC 成熟并促进了IL-12 的分泌。早期大量细胞因子的分泌有助于控制 病毒复制，但同时也激起了整个免疫系统的活化，促进了疾病进程。而在整个 感染阶段，IFN-α 与CD4+ T 细胞呈正相关，而与病毒载量呈负相关，表明了 IFN-α 对于延缓疾病进程具有重要的意义。 我们测定了急性感染期DC 亚群受病毒影响而发生的表型变化，发现pDC 更容易受到病毒影响而发生凋亡，这可能与pDC 高表达SIV 受体CD4 和CCR5 有关。在感染过程中，尽管mDC 和pDC 都显著地下调了CD4 表达，而上调了 CCR5 的表达，不过仅发现pDC CD4 的表达与病毒载量呈负相关，而CCR5 的 表达与病毒载量呈正相关。在此过程中DC 亚群都会因为病毒的影响而活化， 继而提高CCR7 的表达。同时无论mDC 还是pDC，其表达的CD80 和CD86 都与病毒载量呈正相关。在早期感染中，DC 的活化促使整个免疫系统针对病 毒发挥免疫反应，对于控制疾病发展具有重要意义。

N-acetylchitooligosaccharide is a potent angiogenic inhibitor both in vivo and in vitro

N-Acetylchitooligosaccharide (N-acetyl-COs) was prepared by N-acetylation of chitooligosaccharide (COs). In vitro study using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) revealed that both N-acetyl-COs and COs inhibited the proliferation of HUVECs by inducing apoptosis. Treatment of HUVECs by N-acetyl-COs resulted in a significant reduction of density of the migration cells and repressed tubulogenesis process. The antiangiogenic effects of the oligosaccharides were further evaluated using in vivo zebrafish angiogenesis model, and the results showed that both oligosaccharides inhibited the growth of subintestinal vessels (SIV) of zebrafish embryos in a dose-dependent manner, as observed by endogenous alkaline phosphatase (EAP) staining assay. In contrast, no cytotoxicity was found when treating the NIH3T3 and several other cancer cells with the oligosaccharides. Our results also confirmed the antiangiogenic activity of N-acetyl-COs was significantly stronger than the parent oligosaccharide, COs. (c) 2007 Published by Elsevier Inc.

A novel polypeptide from shark cartilage with potent anti-angiogenic activity

Using guanidine-HCl extraction, acetone precipitation, ultra-filtration and chromatography, a novel polypeptide with potent anti-angiogenic activity was purified from cartilage of the shark, Prionace glauca. N-terminal amino acid sequence analysis and SDS-PAGE revealed that the substance is a novel polypeptide with MW 15500 (PG155). The anti-angiogenic effects of PG155 were evaluated using zebrafish embryos model in vivo. Treatment of the embryos with 20 mu g/ml PG155 resulted in a significant reduction in the growth of subintestinal vessels (SIVs). A higher dose resulted in almost complete inhibition of SIV growth, as observed by endogenous alkaline phosphatase (EAP) staining assay. An in vitro transwell experiment revealed that the polypeptide inhibited vascular endothelial growth factor (VEGF) induced migration and tubulogenesis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Exposure of HUVECs in 20 mu g/ml PG155 significantly decreased the density of migrated cells. Almost complete inhibition of cell migration was found when HUVECs were treated with 40-80 mu g/ml PG155. PG155 (20 mu g/ml) markedly inhibited the tube formation of HUVECs and a dose-dependent effect was also found when treatment of HUVECs with PG155 at the concentration from 20 to 160 mu g/ml.

靶向斑马鱼VEGF的shRNA表达载体的构建及其对斑马鱼胚胎血管发育的影响

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一种多功能的细胞因子，其主要作用是促进血管内皮细胞增殖和增加血管通透性，是肿瘤及正常组织血管生成的中心调控因素，以VEGF为靶点的肿瘤血管靶向性治疗成为近几年肿瘤治疗的新途径。RNAi是近年来新发展的一项反向遗传学技术，是一种研究基因功能的有力工具。斑马鱼作为一种重要的模式生物，被广泛用于胚胎的分子发育机制、疾病模型的构建以及药物筛选等研究中。然而在斑马鱼中运用RNAi技术进行基因功能研究是一个相对较新的领域，研究资料较少，并且目前进行的斑马鱼RNAi实验中，siRNA大都是通过化学方法或体外转录合成的。体外合成的siRNA在进入体内后会被降解而无法达到持久阻抑基因表达的目的。因此本研究旨在探讨VEGF特异性siRNA表达载体对斑马鱼VEGF基因的沉默作用，通过分析表型及相关细胞因子的变化，阐明VEGF对斑马鱼胚胎血管生成的影响及作用机制。 研究通过计算机辅助设计软件，针对斑马鱼VEGF mRNA不同位点设计合成了4段含siRNA特异序列的DNA单链，经退火，克隆入pSilencer 4.1-CMV neo载体CMV启动子下游，构建了重组质粒pS1-VEGF、pS2-VEGF、pS3-VEGF及pS4-VEGF。 通过显微注射的方法将载体导入1-2细胞期斑马鱼体内，于胚胎发育的48 h采用RT-PCR的方法检测VEGF基因的表达量，研究不同干扰序列对VEGF基因表达的干涉作用。结果显示，针对不同位点的表达载体对VEGF基因表达的抑制效率有显著差异。它们对VEGF mRNA的抑制率分别为80.5%，42.8%，12.5%，40.7%。通过筛选我们得到了一条具有高效抑制作用的载体pS1-VEGF，该载体的相应序列靶向斑马鱼两个主要异构体VEGF165和VEGF121的共有外显子序列。 形态学检测结果显示，注射了pS1-VEGF的胚胎出现了心包膜水肿、血流速度减慢、循环红细胞堆积等症状。定量碱性磷酸酶染色显示，注射pS1-VEGF能够抑制斑马鱼胚胎新生血管的形成，当注射剂量为0.4 ng时，血管生成的抑制率为31.8%。NBT/BCIP血管染色显示，注射该载体后72 h，50%的斑马鱼肠下静脉、节间血管以及其它血管的发育受到不同程度的抑制。随着注射剂量的加大，血管发育受抑制的情况也随之加重，当注射剂量为1 ng时，只有心脏、头部及卵黄有血液循环。对干扰效果的特异性进行了研究，结果表明pS1-VEGF对斑马鱼内源基因胸苷酸合成酶（thymidylate synthase, TS）基因的表达没有明显的抑制作用。针对TS基因的shRNA表达载体及与斑马鱼没有同源性的对照载体对VEGF基因表达也没有明显的抑制作用。浓度梯度实验表明在0-1.2 ng的范围内干扰效果具有剂量依赖性。 以胚胎整体原位杂交的方法检测质粒对VEGF基因受体NRP1基因表达的影响，发现VEGF特异性shRNA表达载体能够引起NRP1基因表达的降低，说明斑马鱼中VEGF所介导的血管生成作用至少在部分上是依赖于NRP通路所调节的。 本研究工作为进一步研究斑马鱼基因功能、VEGF调控网络提供了一个快速、有效的手段，为阐明斑马鱼的血管生成机制提供了新的资料，为采用RNAi技术，以VEGF为靶点，以斑马鱼为模型对肿瘤进行基因治疗研究奠定了基础。