Purification and Biochemical Characterization of Thermostable Alkaline Phosphatases Produced by Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis

The biochemical properties of the alkaline phosphatases (AIPs) produced by Rhizopus micro-sporus are described. High enzymic levels were produced within 1-2 d in agitated cultures with 1% wheat bran. Intra- and extracellular AlPs were purified 5.0 and 9.3x, respectively, by DEAE-cellulose and ConA-sepharose chromatography. Molar mass of 118 and 120 kDa was estimated by gel filtration for both forms of phosphatases. SDS-PAGE indicated dimeric structures of 57 kDa for both forms. Mn(2+), Na(+) and Mg(2+) Stimulated the activity, while Al(3+) and Zn(2+) activated only the extracellular form. Optimum temperature and pH for both phosphatases were 65 degrees C and pH 8.0, respectively. The enzymes were stable at 50 degrees C for at least 15 min. Hydrolysis of 4-nitrophenyl phosphate exhibited a K(m) 0.28 and 0.22 mmol/L, with upsilon(lim) 5.89 and 4.84 U/mg, for intra- and extracellular phosphatases, respectively. The properties of the reported AlPs may be suitable for biotechnological application.

Use of confocal scanning laser microscopy to measure the concentrations of aerial and penetrative hyphae during growth of Rhizopus oligosporus on a solid surface

In order to develop a method for use in investigations of spatial biomass distribution in solid-state fermentation systems, confocal scanning laser microscopy was used to determine the concentrations of aerial and penetrative biomass against height and depth above and below the substrate surface, during growth of Rhizopus oligosporus on potato dextrose agar. Penetrative hyphae had penetrated to a depth of 0.445 cm by 64 h and showed rhizoid morphology, in which the maximum biomass concentration, of 4.45 mg dry wt cm(-3), occurred at a depth of 0.075 cm. For aerial biomass the maximum density of 39.54 mg dry wt(-3) occurred at the substrate surface. For both aerial and penetrative biomass, there were two distinct regions in which the biomass concentration decayed exponentially with distance from the surface. For aerial biomass, the first exponential decay region was up to 0.1 cm height. The second region above the height of 0.1 cm corresponded to that in which sporangiophores dominated. This work lays the foundation for deeper studies into what controls the growth of fungal hyphae above and below the surfaces of solid substrates. (C) Wiley Periodicals, Inc.

Use of confocal microscopy to follow the development of penetrative hyphae during growth of Rhizopus oligosporus in an artificial solid-state fermentation system

Two methods were compared for determining the concentration of penetrative biomass during growth of Rhizopus oligosporus on an artificial solid substrate consisting of an inert gel and starch as the sole source of carbon and energy. The first method was based on the use of a hand microtome to make sections of approximately 0.2- to 0.4-mm thickness parallel to the substrate surface and the determination of the glucosamine content in each slice. Use of glucosamine measurements to estimate biomass concentrations was shown to be problematic due to the large variations in glucosamine content with mycelial age. The second method was a novel method based on the use of confocal scanning laser microscopy to estimate the fractional volume occupied by the biomass. Although it is not simple to translate fractional volumes into dry weights of hyphae due to the lack of experimentally determined conversion factors, measurement of the fractional volumes in themselves is useful for characterizing fungal penetration into the substrate. Growth of penetrative biomass in the artificial model substrate showed two forms of growth with an indistinct mass in the region close to the substrate surface and a few hyphae penetrating perpendicularly to the surface in regions further away from the substrate surface. The biomass profiles against depth obtained from the confocal microscopy showed two linear regions on log-linear plots, which are possibly related to different oxygen availability at different depths within the substrate. Confocal microscopy has the potential to be a powerful tool in the investigation of fungal growth mechanisms in solid-state fermentation. (C) 2003 Wiley Periodicals, Inc.

Subcutaneous mucormycosis caused by Rhizopus oryzae: probable nosocomial acquired infection

The Authors present a case of subcutaneous mucormycosis occurring in a patient with clinical and biochemical evidence of diabetic ketoacidosis. The clinical, mycological and histopathological features are described, emphasizing the relevance of a rapid diagnosis in order to stablish early treatment. The clinical forms of mucormycosis and the main associated conditions are briefly reviewed as well as the most probable conditions which may lead to the enhanced susceptibility to infection in the diabetic patient in ketoacidosis. The recovery of Rhizopus oryzae from the air of the room of the patient suggests a nosocomial infection acquired through contamination of venous puncture site by air borne spores.

Rhinocerebral zygomycosis in a diabetic patient

Rhinocerebral zygomycosis is the most frequent form of fungal infection caused by members of the Zygomycetes class. A fatal case of rhinocerebral zygomycosis caused by Rhizopus (oryzae) arrhizus with histopathological and mycological diagnosis is reported in a diabetic patient.

Polyphasic identification of a Rhizopus species and a putative novel Gongronella which both degrade the fungicide metalaxyl

Apresentação efetuada na MicroBiotec’15

Disseminated Rhizopus microsporus infection cured by salvage allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, antifungal combination therapy, and surgical resection.

O. Lebeau, C. Van Delden, J. Garbino, J. Robert, F. Lamoth, J. Passweg, Y. Chalandon. Disseminated Rhizopus microsporus infection cured by salvage allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, antifungal combination therapy, and surgical resection. Transpl Infect Dis 2010. All rights reserved Abstract: Invasive Zygomycetes infection complicating prolonged neutropenia is associated with high mortality in the absence of immune recovery. We report a patient who developed disseminated zygomycosis due to Rhizopus microsporus during induction chemotherapy for acute myeloid leukemia. Rescue allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) was performed as her only chance of cure of this infection and to treat refractory leukemia. Posaconazole combined with liposomal amphotericin B contained the zygomycosis during prolonged neutropenia due to allo-HSCT followed by intense immunosuppression for grade IV acute graft-versus-host disease. Surgical removal of all infected sites after immune recovery, with prolonged posaconazole treatment, ultimately cured the infection. New combination antifungal therapies might sufficiently control disseminated zygomycosis to allow allo-HSCT to be performed, assuring life-saving immune recovery. Surgery appears to be necessary for definite cure of these infections.

Efeito da irradiação UV-C no controle da podridão parda (Monilinia fructicola) e da podridão mole (Rhizopus stolonifer) em pós-colheita de pêssegos

Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da irradiação UV-C no controle in vitro de Monilinia fructicola e Rhizopus stolonifer e no controle das doenças causadas por estes fungos em pêssegos inoculados com ferimento. No experimento in vitro, avaliou-se o crescimento micelial dos fungos em meio BDA após a exposição nas doses de UV-C de 0, 0,26, 0,52, 1,04, 3,13, 5,22, 10,44, 15,66, e 31,32 kJ.m-2 num equipamento com quatro lâmpadas com taxa de fluência de 1,74 mW.cm-2. Nos experimentos in vivo, os frutos foram tratados com irradiação UV-C de forma protetora e curativa. No tratamento protetor, os frutos foram expostos a 1,04 kJ.m-2 por 1 min. e foram inoculados imediatamente após e 16, 24 e 40 h após. No tratamento curativo, os frutos foram inoculados, incubados e irradiados com doses de UV-C de 0, 1,04, 5,22, 10,44, 15,66 e 31,32 kJ.m². Avaliou-se a incidência das doenças e a severidade da podridão parda. No experimento in vitro, apenas as doses aplicadas durante 1 e 10 min. de exposição reduziram o crescimento micelial de M. fructicola enquanto que a aplicação da luz UV-C entre 10-15 minutos reduziu o crescimento micelial de R. stolonifer e a dose aplicada durante 30 minutos inibiu completamente o crescimento micelial deste fungo. Não houve efeito protetor da luz UV-C no controle das doenças. Não houve controle curativo da podridão parda. A irradiação UV-C foi eficiente no controle curativo da podridão mole e o tempo de exposição de 10 min. foi o que apresentou melhor resultado.

Efeito de sanificantes no controle pós-colheita da podridão parda (Monilinia fructicola) e da podridão mole (Rhizopus stolonifer) em pêssegos

O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito in vitro e in vivo dos sanificantes cloreto de benzalcônio (Fegatex®), biomassa cítrica (Ecolife40®) e ozônio no controle da podridão parda (Monilinia fructicola) e da podridão mole (Rhizopus stolonifer) em pêssegos das cultivares Aurora, Dourado e Flor da Prince. Cloreto de benzalcônio e biomassa cítrica, aplicados in vitro, ambos na concentração de 1000 mL L-1, inibiram totalmente o crescimento radial (micelial) de M. fructicola, porém nenhum deles foi eficiente no controle de R. stolonifer. Cloreto de benzalcônio aplicado de forma preventiva, na concentração de 3000 mL L-1, reduziu a podridão parda em frutos inoculados sem ferimentos. Quando aplicado de forma curativa em frutos não feridos esse produto foi eficiente em todas as concentrações testadas. Nenhum produto aplicado nos frutos de forma curativa foi eficiente no controle da podridão parda, quando a inoculação do fungo foi realizada através de ferimentos. Nenhum dos produtos foi eficiente no controle da podridão mole. O ozônio (0,1 mL L-1) não foi eficiente no controle das podridões parda e mole.

Avaliação antagônica in vitro e in vivo de Trichoderma spp. a Rhizopus stolonifer em maracujazeiro amarelo

Para estudar a potencialidade antagônica de espécies de Trichoderma spp. in vitro e in vivo a Rhizopus stolonifer, patógeno causador da podridão floral do maracujazeiro, foram estudadas as espécies de Trichoderma viride, T. virens, T. harzianum e T. stromaticum. O crescimento micelial do fitopatógeno foi realizado pelo teste do pareamento de culturas, para crescimento individual foram utilizadas cinco temperaturas. Avaliou-se também o crescimento micelial em 24h e 48h, avaliando a taxa de crescimento dos isolados. Na produção de metabolitos voláteis e não voláteis foram utilizados papel celofane e sobreposição de placas. Em condição de campo os frutos/planta foram tratados com a suspensão na concentração de 2 x 10(8) Conídios/mL sendo avaliado o número médio de frutos aos 15 e 30. No pareamento de cultura todos os isolados de Trichoderma spp. apresentaram crescimento micelial, impedindo o desenvolvimento do fitopatógeno, para todos os isolados as temperaturas ideais de crescimento foram de 25ºC e 30ºC. Nos períodos de incubação de 24 e 48h, foram constatadas diferenças significativas no crescimento micelial entre os isolados os antagonistas apresentaram velocidade de crescimento maior que o fitopatógeno. Houve uma produção de metabólitos voláteis e não voláteis de ação antifúngica ao R. stolonifer. No ensaio em campo houve diferença significativa entre os tratamentos, verificando-se que o melhor resultado entre os antagonistas em estudo cujos percentuais de pegamento foram 74% para os tratamentos Trichoderma harzianum e T. virens, e os tratamentos T. viride e T. stromaticum obtiveram um porcentual de 75% enquanto a testemunha obteve um percentual de 42%.

Purificação parcial e caracterização bioquímica de lipase extracelular produzida por nova linhagem de Rhizopus sp.

Lipases são enzimas capazes de catalizar uma grande gama de reações de interesse para as indústrias alimentícia, farmacêutica, química, entre outras. Esta versatilidade se deve também às diversas possibilidades de especificidade quanto ao substrato que lipases de diferentes fontes apresentam. Por este motivo, microrganismos produtores desta enzima vêm sendo procurados por grupos de pesquisa no mundo todo. Este trabalho apresenta as propriedades de uma lipase produzida por nova linhagem fúngica de Rhizopus sp. A enzima bruta apresentou condições ótimas de atividade a 40ºC em valores de pH entre 6,0 e 6,5. e manteve 50% ou mais de sua atividade quando aquecida por 60 minutos à temperaturas entre 40ºC e 55ºC. A atividade hidrolítica da lipase bruta foi maior quando o substrato testado foi a gordura de coco, demonstrando afinidade por ácidos graxos saturados de cadeia média. As frações I e II obtidas após purificação parcial da enzima apresentaram características bioquímicas semelhantes as do extrato bruto.

Purificação parcial, por dois diferentes métodos cromatográficos, da lipase produzida por Rhizopus sp.

Lipases, especialmente as de origem microbiana, são largamente utilizadas em processos e na obtenção de produtos para as indústrias química, cosmética, farmacêutica e alimentícia. A produção de enzimas de elevada pureza é importante, principalmente, do ponto de vista do controle dos processos (ausência de interferentes), porém as etapas necessárias à purificação, em geral, provocam perdas na atividade das enzimas e aumentam seu custo final. O objetivo deste trabalho foi propor a melhor metodologia de purificação para a lipase de Rhizopus sp. através do teste de dois diferentes métodos cromatográficos (troca iônica e interação hidrofóbica) e, ainda verificar o melhor planejamento estatístico para caracterização bioquímica da mesma. Foi possível purificar parcialmente a lipase de Rhizopus sp. com o uso de coluna de DEAE Sepharose (troca aniônica) e de FENIL Sepharose (interação hidrofóbica). A primeira, embora mais seletiva para a enzima em questão, parece provocar redução de sua atividade. A presença de maiores concentrações de íons Na+1 na fração purificada por FENIL Sepharose parece contribuir para o aumento de atividade da lipase. Embora os resultados obtidos por análise multivariável para determinação das características bioquímicas da lipase sejam compatíveis com a análise univariável, aquele planejamento não foi considerado indicado no presente caso.

Fermentación en estado sólido del mijo perla (Pennisetum americahum (L.) Leeke) por Rhizopus oligosporus para la obtención de un producto rico en proteína

Tesis (Maestría en Ciencias con Especialidad en Alimentos) UANL

Improving the enantioselective bioreduction of aromatic ketones mediated by Aspergillus terreus and Rhizopus oryzae: the role of glycerol as a co-solvent

The improvement of the enzymatic performance of Aspergillus terreus and Rhizopus oryzae in enantioselective bioreductions by using glycerol as a co-solvent has been studied. In the most of the bioreductions, glycerol has demonstrated its potential for improved conversions (up to >99%) and enantioselectivities (up to >99%) when compared to reactions in aqueous or other aqueous-organic media (THF, diethyl ether, toluene, DMSO and acetonitrile). Moreover, high isolated yields of the desired chiral alcohols have been obtained on a preparative scale showing the great potential of this green solvent in biocatalysis. (C) 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Partial purification and properties of cellulase-free alkaline xylanase produced by Rhizopus stolonifer in solid-state fermentation

Rhizopus stolonifer was cultivated in wheat bran to produce a cellulase-free alkaline xylanase. The purified enzyme obtained after molecular exclusion chromatography in Sephacryl S-200 HR showed optimum temperature as 45 degrees C and hydrolysis pHs optima as pH 6.0 and 9.0. Xylanase presented higher Vmax at pH 9.0 (0.87 mu mol/mg protein) than at pH 6.0 and minor Km at pH 6.0 (7.42 mg/mL)than at pH 9.0.