Étude protéomique des partenaires d`interaction de XPA en présence et en absence de dommage à l`ADN

La réparation par excision de nucléotides (NER) permet l'élimination des lésions provoquant une distorsion de la double hélice de l’ADN. Ces lésions sont induites par plusieurs agents environnementaux comme les rayons UV, ainsi que par certaines drogues chimio- thérapeutiques tel que le cisplatine. Des défauts dans la NER conduisent à de rares maladies autosomiques héréditaires : La xérodermie pigmentaire (XP), le syndrome de Cockayne (CS), le syndrome de sensibilité aux UVSS et la trichothiodystrophie (TTD). Ces maladies sont associées soit à une prédisposition élevée au cancer de la peau et / ou à de graves anomalies du développement neurologique. Le groupe de patients XP-A représente le deuxième groupe (XP) le plus fréquent, et possède la forme la plus sévère combinant cancer de la peau avec un haut risque de dégénérescence neurologique. À date, aucune explication n`a été proposée pour les symptômes neurologiques observés chez ces patients. Nous avions suggéré ainsi que la protéine XPA possède d`autres fonctions dans d`autres processus cellulaires, ceci en interagissant avec des partenaires protéiques différents de ceux déjà connus. Afin de confirmer cette hypothèse nous avions réalisé une étude protéomique à grande échelle en combinant la spectrométrie de masse à une immunoprécipitation en Tandem d`affinité (TAP), afin d`identifier de nouvelles protéines interagissant directement avec XPA. Nous avions montré que XPA peut interagir avec MRE11, la protéine clé de la réparation par recombinaison homologue. Des études additionnelles sont requises pour confirmer cette interaction et comprendre sa fonction

L'influence de la protéine p53 sur la réponse génotoxique des cellules humaines aux ultraviolets

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôles de la protéine p53 et de l'oncoprotéine virale HBx dans la réponse cellulaire aux dommages à l'ADN

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'influence de la protéine p53 sur la réponse génotoxique des cellules humaines aux ultraviolets

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rôles de la protéine p53 et de l'oncoprotéine virale HBx dans la réponse cellulaire aux dommages à l'ADN

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Caractérisation structurale et fonctionnelle des interactions impliquant TFIIH et la machinerie de réparation de l’ADN

La réparation de l’ADN par excision des nucléotides (NER) est un mécanisme capable de retirer une large variété de lésions causant une distorsion de la double hélice, comme celles causées par les rayons ultraviolets (UV). Comme toutes les voies de réparation de l’ADN, la NER contribue à la prévention de la carcinogénèse en prévenant la mutation de l’ADN. Lors de ce processus, il y a d’abord reconnaissance de la lésion par la protéine XPC/Rad4 (humain/levure) qui recrute ensuite TFIIH. Ce complexe déroule l’ADN par son activité hélicase et recrute l’endonucléase XPG/Rad2 ainsi que d’autres protéines nécessaires à l’excision de l’ADN. Lors de son arrivée au site de lésion, XPG/Rad2 déplace XPC/Rad4. TFIIH agit également lors de la transcription de l’ADN, entre autres par son activité hélicase. Outre cette similarité de la présence de TFIIH lors de la transcription et la réparation, il est possible de se demander en quoi les deux voies sont similaires. Nous nous sommes donc intéressés aux interactions impliquant TFIIH et la machinerie de réparation de l’ADN. Nous avons donc entrepris une caractérisation structurale et fonctionnelle de ces interactions. Nous avons découvert que Rad2 et Rad4 possèdent un motif d’interaction en nous basant sur d’autres interactions de la sous-unité Tfb1 de TFIIH. Par calorimétrie à titrage isotherme, nous avons observé que les segments de ces deux protéines contenant ce motif interagissent avec une grande affinité au domaine PH de Tfb1. Le site de liaison de ces segments sur Tfb1PH est très semblable au site de liaison du domaine de transactivation de p53 et au domaine carboxy-terminal de TFIIEα avec Tfb1PH, tel que démontré par résonance magnétique nucléaire (RMN). De plus, tous ces segments peuvent faire compétition les uns aux autres pour la liaison à Tfb1PH. Nous avons aussi démontré in vivo chez la levure qu’une délétion de Tfb1PH crée une sensibilité aux radiations UV. De plus, la délétion de multiples segments de Rad2 et Rad4, dont les segments d’interaction à Tfb1PH, est nécessaire pour voir une sensibilité aux rayons UV. Ainsi, de multiples interactions sont impliquées dans la liaison de Rad2 et Rad4 à TFIIH. Finalement, les structures des complexes Rad2-Tfb1PH et Rad4-Tfb1PH ont été résolues par RMN. Ces structures sont identiques entre elles et impliquent des résidus hydrophobes interagissant avec des cavités peu profondes de Tfb1PH. Ces structures sont très semblables à la structure de TFIIEα-p62PH. Ces découvertes fournissent ainsi un lien important entre la transcription et la réparation de l’ADN. De plus, elles permettent d’émettre un modèle du mécanisme de déplacement de XPC/Rad4 par XPG/Rad2 au site de dommage à l’ADN. Ces connaissances aident à mieux comprendre les mécanismes de maintient de la stabilité génomique et peuvent ainsi mener à développer de nouvelles thérapies contre le cancer.

Régulation des processus de réparation de l’épithélium bronchique sain et Fibrose Kystique par le TNF-alpha

La Fibrose Kystique, causée par des mutations du canal CFTR, mène à la dysfonction du transport des fluides et des ions causant la déshydratation du liquide de surface des voies aériennes et ainsi une défaillance de la clairance mucocilliaire. Ce défaut entraine l’accumulation et l’épaississement du mucus au niveau des bronches qui devient alors un environnement idéal pour le développement d’infections chroniques et d’inflammation qui sont associées à la destruction progressive de l’épithélium chez les patients Fibrose Kystique. Même si leur rôle dans les processus lésionnels est très bien connu, l’impact de médiateurs inflammatoires sur la capacité de réparation ne l’est cependant pas. L’objectif de ma maitrise était donc d’étudier la régulation des mécanismes de réparation de l’épithélium bronchique sain et Fibrose Kystique par le facteur de nécrose tumoral (TNF)-alpha, une cytokine pro-inflammatoire cruciale dans l’initiation et la propagation de la réponse inflammatoire chez les patients FK. À l’aide d’un modèle de plaies mécaniques, nous avons montré que le TNF-alpha stimule la réparation de l’épithélium bronchique sain (NuLi-1) et Fibrose Kystique (CuFi-1). De façon surprenante, l’exposition chronique au TNF-alpha augmente cette stimulation tout comme le taux de migration cellulaire pendant la réparation. Cette augmentation de réparation semble être médiée par l’activation de la métalloprotéinase MMP-9, la relâche d’EGF par les cellules épithéliales et ainsi l’activation de la voie d’EGFR. De plus, l’activation de la réparation par le TNF-alpha semble aussi impliquer l’activation des canaux K+, dont nous avons démontré le rôle important dans la réparation. Contrairement à son effet sur la migration cellulaire et sur la réparation, le TNF-alpha diminue la prolifération cellulaire. En somme, en plus de son rôle dans les processus lésionnels, le TNF-alpha semble avoir un rôle complexe dans les processus de réparation puisqu’il stimule la migration et ralentit la prolifération cellulaire.

Évaluation de la cytogénotoxicité humaine induite par l’exposition à de faibles doses de benzo-a-pyrène, à l’aide de biomarqueurs précoces

Le benzo-a-pyrène (BaP) est un hydrocarbure aromatique polycyclique (HAP) cancérogène pour l’homme, qui contamine toutes les sphères de notre environnement. Son métabolite, le BaP-7,8-diol-9,10-époxyde (BPDE) est considéré comme son cancérogène ultime. Le BPDE se lie à l’ADN, formant des adduits qui doivent être réparés et qui seraient responsables des dommages à l’ADN et de la cancérogenèse induite par le BaP. Les adduits BPDE-ADN et les dommages à l’ADN (bris simple-brin [BSB] à l’ADN, aberrations chromosomiques [AC], échanges entre chromatides-sœurs [ÉCS] et micronoyaux [MN]) ont été mesurés dans les lymphocytes humains exposés à de faibles concentrations de BaP, provenant de jeunes volontaires non-fumeurs et en santé. Suite à l’exposition au BaP, le niveau d’adduits BPDE-ADN et la fréquence des AC et des MN augmentent significativement, puis diminuent aux concentrations les plus élevées de BaP testées, suggérant une induction du métabolisme de phase II du BaP. Lors de la mesure des ÉCS, nous obtenons une courbe dose-réponse linéaire, indiquant la production d’un autre type de lésions devant être réparées par le système de réparation par recombinaison homologue. Ces lésions pourraient être des bris à l’ADN ou des bases oxydées (8-OH-dG), ce qui est suggéré par l’analyse des corrélations existant entre nos biomarqueurs. Par ailleurs, la comparaison de la courbe dose-réponse des hommes et des femmes montre que des différences existent entre les sexes. Ainsi, les ÉCS, les AC et les MN sont significativement augmentés chez les hommes à la plus faible concentration de BaP, alors que chez les femmes cette augmentation, quoique présente, est non significative. Des différences interindividuelles sont également observées et sont plus importantes pour les adduits BPDE-ADN, les MN et les AC, alors que pour les ÉCS elles sont minimes. Les analyses statistiques effectuées ont permis d’établir que quatre facteurs (niveau d’exposition au BaP, adduits BPDE-ADN, fréquence des AC et nombre de MN par cellule micronucléée) expliquent jusqu’à 59 % de la variabilité observée dans le test des ÉCS, alors qu’aucun facteur significatif n’a pu être identifié dans le test des AC et des MN. L’analyse du mécanisme de formation de nos biomarqueurs précoces permet de suggérer que les bris à l’ADN et les bases oxydées devraient être classées comme biomarqueurs de dose biologique efficace, au sein des biomarqueurs d’exposition, dans le continuum exposition-maladie du BaP, étant donné qu’ils causent la formation des biomarqueurs de génotoxicité (ÉCS, AC et MN). Par ailleurs, le test des AC et des MN ont permis de confirmer l’action clastogénique du BaP en plus de mettre en évidence des effets aneugènes affectant surtout la ségrégation des chromosomes lors de la division cellulaire. Ces effets aneugènes, reliés à l’étape de progression dans la cancérogenèse, pourraient être particulièrement importants puisque l’exposition au BaP et aux HAP est chronique et dure plusieurs années, voire des décennies. La compréhension des mécanismes régissant la formation des biomarqueurs étudiés dans cette étude, ainsi que des relations existant entre eux, peut être appliquée à de nombreux contaminants connus et émergents de notre environnement et contribuer à en évaluer le mode d’action.

Le droit à réparation des victimes de violations des droits humains par les entreprises multinationales

Alors que la question de la responsabilité juridique des entreprises multinationales (EMNs) est sujette à de nombreuses controverses sur la sphère internationale, les victimes collatérales et directes des activités des EMNs sont engagées dans une tout autre bataille. En effet, de quels recours disposent les victimes de pollution environnementale causée par les activités d’une entreprise minière, ou les employés victimes de violations des droits fondamentaux du travail au sein d’une chaîne de production par les sous-traitants d’une très respectable EMN? Telles sont les interrogations animant la présente étude qui se focalise essentiellement sur la mise en oeuvre du droit à la réparation consacrée par le troisième pilier des Principes directeurs adoptés par l’ONU en 2011. Retraçant les fondements du droit à la réparation en droit international, elle met en évidence l’impossibilité de poursuivre les EMNs devant les instances internationales du fait de l’irresponsabilité juridique internationale découlant du statut actuel des EMNS. En l’absence de législation extraterritoriale et d’harmonisation juridique au niveau régional, l’analyse aborde ainsi en profondeur les opportunités et les limites de la mise en oeuvre du droit à réparation devant les instances judiciaires nationales les plus courues du moment par les victimes qui cherchent à obtenir des réparations pour les violations des droits humains par les EMNs. Si les obstacles rencontrés par les victimes devant le prétoire américain n’ont eu de cesse de se multiplier ces dernières années, l’émergence d’un principe de diligence raisonnable sous-tendant l’idée d’une responsabilité civile des EMNS devant le juge européen et canadien peut offrir une base adéquate pour asseoir l’encadrement d’un droit à réparation par les acteurs transnationaux à l’échelle locale. Les Principes directeurs privilégiant également l’implication des EMNs dans la mise en oeuvre du droit à réparation, la recherche se clôt avec l’étude du cas pratique de la réponse apportée par les EMNs aux victimes bangladaises de la tragédie du Rana Plaza survenue en 2013 à Dacca. L’analyse permet ainsi de conclure que de ce combat aux allures de David contre Goliath opposant les EMNs à leurs victimes, il est impératif que les mécanismes judiciaires nationaux soient renforcés et que l’encadrement juridique de la responsabilité internationale des EMNs sorte enfin des sentiers battus afin de remédier à l’asymétrie causée par la poursuite des intérêts économiques sur la protection effective des droits humains.

APRIN(PDS5B) et PALB2, deux protéines impliquées dans la réparation de l’ADN par recombinaison homologue et l’apparition de cancers

Au Canada, en 2015, il était estimé que 78 000 personnes allaient mourir d’un cancer, représentant 30 % de tous les décès et faisant de celui-ci la première cause de mortalité. De plus, 196 900 nouveaux cas de cancers seraient découverts au cours de cette même année (Canadian Cancer Society’s Advisory Committee on Cancer Statistics. Canadian Cancer Statistics 2015. Toronto, ON : Canadian Cancer Society; 2015). L’intégrité du génome est chaque jour menacée par des conditions environnementales qui endommagent l’ADN (ultraviolets, produits chimiques divers, etc.). Parmi les différents types de lésions, l’un des plus délétères et pouvant mener au cancer est la cassure double-brin (CDB). Celle-ci peut être réparée suivant deux mécanismes majeurs : la jonction des extrémités non homologues (Non-Homologous End-Joining ou NHEJ) ou la Recombinaison Homologue (RH). Cette dernière, prépondérante pendant les phases S/G2, consiste en la réparation d’une CDB grâce à l’utilisation d’une chromatide soeur comme modèle, permettant une réparation fidèle du dommage. La RH est sous la dépendance de diverses protéines, dont RAD51, PALB2 et BRCA2. Ces deux dernières sont connues pour être mutées dans les cancers du sein et des ovaires. Ainsi, la compréhension de l’implication de chaque acteur dans la RH est un objectif fondamental dans la lutte contre le cancer et constitue l’objectif général de cette thèse. En 2012, une étude a montré qu’une nouvelle protéine, APRIN (Androgen-induced PRoliferation INhibitor), appartenant au complexe cohésine, interagissait avec BRCA2 et jouait un rôle dans la RH. Les rôles précis d’APRIN dans ce mécanisme restaient toutefois à être définis. Le projet principal de cette thèse repose sur la caractérisation fonctionnelle d’APRIN dans la réparation par RH. Nous révélons qu’APRIN aurait un rôle spécifique et indépendant de celui de la cohésine dans la RH, et pourrait agir à diverses étapes cruciales de ce mécanisme. De plus, nos données montrent que le niveau d’expression d’APRIN pourrait être un marqueur de prédiction dans le cancer ovarien. Étant donné qu’APRIN interagit aussi avec PALB2, autre partenaire essentiel de BRCA2, nous avons également étudié et caractérisé les fonctions de divers mutants de PALB2. Nous faisons ainsi la découverte inattendue d’un nouveau phénotype induit par une troncation de cette protéine associée à certains cancers agressifs. Ainsi, cette thèse apporte des informations supplémentaires et indispensables à la compréhension de la réparation de l’ADN par RH et de la survenue de certains cancers.

The regulatory roles of APE1 and Prdx1 interaction

L’apurinic/apyrimidic endonuclease 1 (APE1) est une protéine multifonctionnelle qui joue un rôle important dans la voie de réparation de l’ADN par excision de base. Elle sert également de coactivateur de transcription et est aussi impliquée dans le métabolisme de l’ARN et la régulation redox. APE1 peut cliver les sites AP ainsi que retirer des groupements, sur des extrémités 3’ créées suite à des bris simple brin, qui bloquent les autres enzymes de réparation, permettant de poursuivre la réparation de l’ADN, puisqu’elle possède plusieurs activités de réparation de l’ADN comme une activité phosphodiestérase 3’ et une activité exonucléase 3’→5’. Les cellules de mammifères ayant subi un knockdown d’APE1 présentent une grande sensibilité face à de nombreux agents génotoxiques. APE1 ne possède qu’une seule cystéine située au 65e acide aminé. Celle-ci est nécessaire pour maintenir l’état de réduction de nombreux activateurs de transcription tels que p53, NF-κB, AP-1, c-Jun at c-Fos. Ainsi, elle se retrouve impliquée dans la régulation de l’expression génique. APE1 passe également à travers au moins 4 types de modifications post-traductionnelles : l’acétylation, la désacétylation, la phosphorylation et l’ubiquitylation. La façon dont APE1 est recrutée pour accomplir ses différentes fonctions biologiques demeure un mystère, bien que cela puisse être relié à sa capacité d’interaction avec de multiples partenaires différents. Sous des conditions de croissance normales, il a été démontré qu’APE1 interagit avec de nombreux partenaires impliqués dans de multiples fonctions. Nous émettons l’hypothèse que l’état d’oxydation d’APE1 est ce qui contrôle les partenaires avec lesquels la protéine interagira, lui permettant d’accomplir des fonctions précises. Dans cette étude nous démontrons que le peroxyde d’hydrogène altère le réseau d’interactions d’APE1. Un nouveau partenaire d’interaction d’APE1, Prdx1, un membre de la famille des peroxirédoxines responsable de récupérer le peroxyde d’hydrogène, est caractérisé. Nous démontrons qu’un knockdown de Prdx1 n’affecte pas l’activité de réparation de l’ADN d’APE1, mais altère sa détection et sa distribution cellulaire à l’intérieur des cellules HepG2 conduisant à une induction accrue de l’interleukine 8 (IL-8). L’IL8 est une chimiokine impliquée dans le stress cellulaire en conditions physiologiques et en cas de stress oxydatif. Il a été démontré que l’induction de l’IL-8 est dépendante d’APE1 indiquant que Prdx1 pourrait réguler l’activité transcriptionnelle d’APE1. Il a été découvert que Prdx1 est impliquée dans la régulation redox suite à une réponse initiée par le peroxyde d’hydrogène. Ce dernier possède un rôle important comme molécule de signalisation dans de nombreux processus biologiques. Nous montrons que Prdx1 est nécessaire pour réduire APE1 dans le cytoplasme en réponse à la présence de H2O2. En présence de Prdx1, la fraction d’APE1 présent dans le cytoplasme est réduite suite à une exposition au peroxyde d’hydrogène, et Prdx1 est hyperoxydé suite à l’interaction entre les deux molécules. Cela suggère que le signal, que produit le peroxyde d’hydrogène, sur APE1 passe par Prdx1. Un knockdown d’APE1 diminue la conversion de la forme dimérique de Prdx1 vers la forme monomérique. Cette observation implique qu’APE1 pourrait être impliquée dans la régulation de l’activité catalytique de Prdx1 en accélérant son hyperoxydation.

Caractérisation fonctionnelle du suppresseur de tumeurs BAP1

La déubiquitinase BAP1 (« BRCA1-Associated Protein1 ») a initialement été isolée pour sa capacité de promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 est muté de manière homozygote dans plusieurs cancers (tel que le cancer du rein, de la peau, de l’oeil et du sein) suggérant fortement que cette déubiquitinase est un suppresseur de tumeurs. Effectivement, la surexpression de BAP1 réduit la prolifération cellulaire et la croissance tumorale dans des modèles de xénogreffe de souris. Toutefois, la fonction biologique et le mécanisme d’action de cette déubiquitinase restent encore marginalement connus. Ainsi, les objectifs de cette thèse sont de caractériser la fonction biologique de BAP1 et de révéler les bases moléculaires de sa fonction suppressive de tumeurs. Pour déterminer la fonction biologique de BAP1, nous avons immuno-purifié et identifié les protéines associées à BAP1, qui s’avèrent être principalement des facteurs et co-facteurs de transcription. Ensuite, nous avons démontré que BAP1 est un régulateur de la transcription. Parallèlement, un autre groupe a montré que BAP1 chez la drosophile, Calypso, régule l’ubiquitination de H2A et la transcription génique. D’autre part, nos résultats d’analyse d’expression génique globale suggèrent que BAP1 jouerait un rôle important dans la réponse aux dommages à l’ADN. Effectivement, des expériences de gain et de perte de fonction (méthode de l’ARNi, modèle de cellules KO en BAP1 et de cellules déficientes en BAP1 re-exprimant BAP1) ont révélé que cette déubiquitinase régule la réponse aux bris double brin d’ADN par la recombinaison homologue. Nos résultats suggèrent que BAP1 exerce sa fonction suppressive de tumeurs en contrôlant la réparation sans erreur de l’ADN via la recombinaison homologue. En cas d’inactivation de BAP1, les cellules deviendront plus dépendantes du mécanisme de réparation par jonction d'extrémités non-homologues, qui est potentiellement mutagénique causant ainsi l’instabilité génomique. D’autres études seront nécessaires afin de déterminer le rôle exact de BAP1 dans la transcription et de comprendre comment la dérégulation de l’ubiquitination de H2A contribue au développement du cancer. Définir les mécanismes de suppression tumorale est de grand intérêt, non seulement pour comprendre la carcinogénèse mais également pour le développement de nouvelles thérapies contre cette maladie.

La poésie québécoise comme source d’inspiration musicale

La version intégrale de ce mémoire est disponible uniquement pour consultation individuelle à la Bibliothèque de musique de l’Université de Montréal (http://www.bib.umontreal.ca/MU)

Étude du rôle de la phosphorylation du complexe Mre11-Rad50-Xrs2 dans le maintien de l'intégrité génomique

L'ADN de chaque cellule est constamment soumis à des stress pouvant compromettre son intégrité. Les bris double-brins sont probablement les dommages les plus nocifs pour la cellule et peuvent être des sources de réarrangements chromosomiques majeurs et mener au cancer s’ils sont mal réparés. La recombinaison homologue et la jonction d’extrémités non-homologues (JENH) sont deux voies fondamentalement différentes utilisées pour réparer ce type de dommage. Or, les mécanismes régulant le choix entre ces deux voies pour la réparation des bris double-brins demeurent nébuleux. Le complexe Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) est le premier acteur à être recruté à ce type de bris où il contribue à la réparation par recombinaison homologue ou JENH. À l’intersection de ces deux voies, il est donc idéalement placé pour orienter le choix de réparation. Ce mémoire met en lumière deux systèmes distincts de phosphorylation du complexe MRX régulant spécifiquement le JENH. L’un dépend de la progression du cycle cellulaire et inhibe le JENH, tandis que l’autre requiert la présence de dommages à l’ADN et est nécessaire au JENH. Ensembles, nos résultats suggèrent que le complexe MRX intègre différents phospho-stimuli pour réguler le choix de la voie de réparation.

La régénération axonale suivant l'axotomie du nerf sciatique et stimulation électrique directe et transcutanée chez la souris

La stimulation électrique directe (SED), pour une heure, améliore la régénération de nerfs périphériques chez le rat après la réparation. Cliniquement, ceci augmenterait le temps opératoire, rehaussant les risques de complications périopératoires. Objectif: Cette étude examine si la stimulation électrique transcutanée (SETC) est aussi efficace à améliorer la régénération de nerfs périphériques que la stimulation électrique directe. Méthode: Le nerf sciatique droit de 28 souris a été axotomisé. Une réparation par microsuture est effectuée. Quatre groupes sont étudiés : (1) sham; (2) suture seulement; (3) suture et SED; (4) suture et SETC. La stimulation est appliquée pour 1 heure à 20 Hz. Les souris sont étudiées pour un total de 12 semaines. La récupération sciatique est évaluée aux semaines 0, 1, 2 et aux 2 semaines par la suite par analyse de démarche sur la poutre. Résultats: La cinématique post-récupération démontre un index fonctionnel sciatique et angle de décollement significativement améliorés pour les groupes SED et SETC aux semaines 8, 10 et 12. Conclusions: 12 semaines après l’axotomie du nerf sciatique, la récupération fonctionnelle est significativement améliorée avec la SED et la SETC. Donc, la SETC est aussi bénéfique pour la promotion de la régénération nerveuse et réinnervation musculaire fonctionnelle que la SED.