Purificação, caracterização e análise da atividade bioinseticida, de um inibidor de tripsina em sementes de catanduva (Piptadenia moniliformis)

One Kunitz-type trypsin inhibitors (PmTI) was purified from Piptadenia moniliformis seeds, a tree of the sub-family Mimosoideae, by TCA precipitation, affinity chromatography on immobilized trypsin-Sepharose, DEAE cellulose (ion exchange) and Superose 12 (molecular exclusion) column FPLC/AKTA. The inhibitor has Mr of 25 kDa by SDS-PAGE and chromatography molecular exclusion. The N-terminal sequence of this inhibitor showed high homology with other family Kunitz inhibitors. This also stable variations in temperature and pH and showed a small decrease in its activity when incubated with DDT in the concentration of 100mM for 120 minutes. The inhibition of trypsin by PmTI was competitive, with Ki of 1.57 x10-11 M. The activity of trypsin was effectively inhibited by percentage of inhibition of 100%, among enzymes tested, was not detected inhibition for the bromelain, was weak inhibitor of pancreatic elastase (3.17% of inhibition) and inhibited by 76.42% elastase of neutrophils, and inhibited in a moderate, chymotrypsin and papain with percentage of inhibition of 42.96% and 23.10% respectively. In vitro assays against digestive proteinases from Lepidoptera, Diptera and Coleoptera pests were carried out. Several degrees of inhibition were found. For Anthonomus grandis and Ceratitis capitata the inhibition was 89.93% and 70.52%, respectively, and the enzymes of Zabrotes subfasciatus and Callosobruchus maculatus were inhibited by 5.96% and 9.41%, respectively, and the enzymes of Plodia. interpunctella and Castnia licus were inhibited by 59.94% and 23.67, respectively. In vivo assays, was observed reduction in the development of larvae in 4rd instar of C. capitata, when PmTI was added to the artificial diet, getting WD50 and LD50 of 0.30% and 0.33%, respectively. These results suggest that this inhibitor could be a strong candidate to plant management programs cross transgenic

Um novo inibidor de tripsina multifuncional de sementes de Erythrina velutina: caracterizacao e propriedades farmacologicas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Estudos estruturais de interacções proteína-ligando: aldeído oxidorredutase e tripsina

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Bioquímica Estrutural e Funcional

Endonuclease com incompatibilidade heteroduplex para detectar mutação e variações genéticas de inibidores da tripsina em soja

O objetivo deste trabalho foi avaliar a variação genética do inibidor de tripsina em variedades cultivadas (Glycine max) e silvestres (Glycine soja) de soja. Foram avaliadas as variações genéticas do inibidor de tripsina Kunitz, representado pela proteína 21-kDa (KTI), e do inibidor de tripsina-quimotripsina Bowman-Birk (BBI), em variedades de soja cultivadas (G. max) e selvagens (G. soja). Ensaios de clivagem foram feitos com endonuclease de incompatibilidade heteroduplex, para a detectar mutações no gene de KTI, com uma única nuclease específica de cadeia simples, obtida a partir de extractos de aipo (CEL I). As variedades de soja estudadas apresentaram baixo nível de variação genética em KTI e BBI. A análise por PCR -RFLP dividiu o BBI-A em A1 e A2 e mostrou que o Tib do KTI é o tipo dominante. A digestão com enzimas de restrição não foi capaz de detectar diferenças entre os tipos de ti-null e outros alelos Ti, enquanto o ensaio com endonucleases com incompatibilidade heteroduplex com CEL I pôde detectar o tipo ti-null. O método de digestão com CEL I fornece uma ferramenta genética simples e útil para a análise de SNP. O método apresentado pode ser utilizado como ferramenta para a triagem rápida e útil de genótipos desejáveis em futuros programas de melhoramento de soja.

Construção de modelos de interação in silico e in vitro do inibidor do tipo Kunitz de Adenanthera pavonina L. para as enzimas cisteínicas e serínicas

Serines proteinases inhibitors (PIs) are widely distributed in nature and are able to inhibit both in vitro and in vivo enzymatic activites. Seed PIs in than leguminous are classified in seven families, Bowman-Birk and Kunitz type families that most studied representing an important role in the first line of defense toward insects pests. Some Kunitz type inhibitors possess activities serine and cysteine for proteinases named bifunctional inhibitor, as ApTKI the inhibitor isolate from seed of Adenanthera pavonina. The A. pavonina inhibitor presenting the uncommon property and was used for interaction studies between proteinases serine (trypsin) and cysteine (papain). In order to determinate the in vitro interaction of ApTKI against enzymes inhibitor purification was carried cut by using chromatographic techniques and inhibition assays. The 3D model of the bifunctional inhibitor ApTKI was constructed SWISS-MODEL program by homology modeling using soybean trypsin inhibitor (STI, pdb:1ba7), as template which presented 40% of identity to A. pavonina inhibitor. Model quality was evaluated by PROCHECK program. Moreover in silico analyzes of formed complex between the enzymes and ApTKI was evaluated by HEX 4.5 program. In vitro results confirmed the inhibitory assays, where the inhibitor presented the ability to simultaneously inhibit trypsin and papain. The residues encountered in the inhibitor model of folder structural three-dimensional that make contact to enzymes target coud explain the specificity pattern against serine and cysteine proteinases

Construção de modelos de interação in silico e in vitro do inibidor do tipo Kunitz de Adenanthera pavonina L. para as enzimas cisteínicas e serínicas

Serines proteinases inhibitors (PIs) are widely distributed in nature and are able to inhibit both in vitro and in vivo enzymatic activites. Seed PIs in than leguminous are classified in seven families, Bowman-Birk and Kunitz type families that most studied representing an important role in the first line of defense toward insects pests. Some Kunitz type inhibitors possess activities serine and cysteine for proteinases named bifunctional inhibitor, as ApTKI the inhibitor isolate from seed of Adenanthera pavonina. The A. pavonina inhibitor presenting the uncommon property and was used for interaction studies between proteinases serine (trypsin) and cysteine (papain). In order to determinate the in vitro interaction of ApTKI against enzymes inhibitor purification was carried cut by using chromatographic techniques and inhibition assays. The 3D model of the bifunctional inhibitor ApTKI was constructed SWISS-MODEL program by homology modeling using soybean trypsin inhibitor (STI, pdb:1ba7), as template which presented 40% of identity to A. pavonina inhibitor. Model quality was evaluated by PROCHECK program. Moreover in silico analyzes of formed complex between the enzymes and ApTKI was evaluated by HEX 4.5 program. In vitro results confirmed the inhibitory assays, where the inhibitor presented the ability to simultaneously inhibit trypsin and papain. The residues encountered in the inhibitor model of folder structural three-dimensional that make contact to enzymes target coud explain the specificity pattern against serine and cysteine proteinases

Caracterização química de extratos hidrossolúveis desidratados de arroz e soja

O presente trabalho teve por objetivo caracterizar quimicamente os extratos hidrossolúveis desidratados de arroz (Oryza sativa L.) e de soja (Glycine max (L.) Merrill). Os processos utilizados para a obtenção dos extratos hidrossolúveis foram: maceração do arroz e da soja, desintegração, centrifugação, adição de ácido cítrico, fervura e secagem por atomização. A caracterização química foi realizada através das seguintes determinações: composição centesimal aproximada, composição de minerais e atividade do inibidor de tripsina. Com o aumento das proporções de soja (0 a 50%), os extratos hidrossolúveis desidratados tiveram aumento nos teores de proteína, extrato etéreo, cinzas e fibra crua, porém diminuição no teor de carboidratos. Os teores de P, K, Mg, Cu e Co foram altos em alguns extratos hidrossolúveis desidratados estudados, os quais foram semelhantes à indicação diária na "Recommended Dietary Allowances", enquanto os demais minerais se mostraram em pequenas quantidades ou apenas traços. Não foi detectada atividade do inibidor de tripsina.

Efeito da proporção canjiquinha: soja na solubilidade, dispersibilidade e propriedades emulsificantes de mingaus desidratados

Com o objetivo de verificar a possibilidade do uso dos mingaus desidratados elaborados com canjiquinha e soja em diferentes proporções (100:0; 90:10; 80:20; 70:30; 60:40 e 50:50%), em produtos alimentícios, foram estudadas a solubilidade e as propriedades emulsificantes das misturas. Os processos utilizados para a obtenção dos mingaus foram: decorticagem dos grãos de soja, branqueamento, desintegração e homogeneização da canjiquinha e soja, bem como secagem por atomização. O aumento das proporções de soja (0 a 50%) causou aumento do N solúvel em água, do índice de solubilidade de N, da proteína dispersível em água, do índice de dispersibilidade de proteína, e provocou uma ligeira diminuição da atividade emulsificante e da estabilidade de emulsão. A atividade residual do inibidor de tripsina não foi detectada nos mingaus desidratados estudados.

Influência da proporção arroz:soja sobre a solubilidade e as propriedades espumantes dos mingaus desidratados

Para verificar a possibilidade do uso dos mingaus desidratados elaborados com arroz e soja em diferentes proporções (100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 e 50:50%) em produtos alimentícios, foram estudadas a solubilidade e as propriedades espumantes destes. No processo para a obtenção destes mingaus desidratados, foram seguidas as etapas de decorticagem dos grãos de soja, branqueamento, desintegração de arroz e soja branqueados, homogeneização e secagem por atomização. Através das análises, foi verificado que com as crescentes proporções de soja houve um aumento do nitrogênio solúvel em água, do índice de solubilidade de nitrogênio, da proteína dispersível em água, do índice de dispersibilidade de proteína, da expansão de espuma e da sinérese, bem como uma diminuição no volume de espuma após 30 e 60 min. Contudo, os valores de índice de solubilidade de nitrogênio só foram relevantes nos mingaus desidratados contendo mais de 10% de soja, enquanto que os valores de propriedades espumantes não foram altos em nenhum mingau desidratado estudado. Portanto, os mingaus desidratados contendo respectivamente 80:20, 70:30, 60:40 e 50:50% de arroz:soja, são recomendados para o uso em mingaus, bebidas, sopas e molhos, onde não é conveniente a presença de espuma. A atividade residual do inibidor de tripsina não foi detectada nos mingaus desidratados estudados.

Características químicas dos mingaus desidratados de arroz e soja

O presente trabalho teve por objetivo caracterizar quimicamente os mingaus desidratados de arroz e soja nas respectivas proporções 100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 e 50:50% e verificar a possibilidade do uso de alguns destes mingaus como ingredientes na formulação de alimentos infantis com base nos resultados discutidos. O processo utilizado para sua obtenção foi decorticagem dos grãos de soja, branqueamento, desintegração e homogeneização do arroz e soja, assim como secagem por atomização. A caracterização química foi realizada através das seguintes determinações: composição centesimal, composição de minerais e de aminoácidos, e atividade do inibidor de tripsina. Com o aumento das proporções de soja (de 0 a 50%), os mingaus desidratados tiveram aumento nos teores de proteína, extrato etéreo, cinzas, fibra bruta, fósforo, cálcio, potássio, magnésio, ferro, cobre, zinco, selênio, manganês e molibdênio, porém diminuição nos teores de carboidrato, sódio e cromo. Contudo, os valores de cobalto não foram alterados. Os teores de potássio, magnésio, ferro e cobre foram altos e os teores de cromo, selênio, manganês e molibdênio foram suficientes em 100g de mingaus desidratados de arroz e soja com 40 e 50% de soja, atendendo 100% das recomendações da RDA para lactentes, podendo estes formulados para alimentos infantis. Houve uma melhoria nos escores de aminoácidos essenciais com as crescentes proporções de soja, exceto para os aminoácidos sulfurados. A composição em aminoácidos foi adequada e comparável ao padrão da FAO/WHO para lactentes, exceto para lisina e metionina. Em relação a lisina, os mingaus desidratados com 30, 40 e 50% de soja mostraram os maiores escores para pré-escolares, não havendo deficiência para escolares. Por outro lado, a metionina não foi deficiente para pré-escolares e escolares. A atividade residual do inibidor de tripsina não foi observada nos mingaus desidratados estudados.

Efeito da temperatura de extrusão na absorção de água, solubilidade e dispersibilidade da farinha pré-cozida de milho-soja (70:30)

Com o objetivo de verificar a possibilidade do uso das farinhas pré-cozidas de milho-soja (70:30) por extrusão em produtos alimentícios, foram estudadas suas características tecnológicas. A mistura crua de milho e soja foi extrusada num extrusor Brabender de dupla-rosca com velocidade de alimentação constante de 20,8Kg/h, velocidade da rotação de parafuso de 100rpm e diâmetro de matriz de 5mm. Os perfis da temperatura de barril (TB) foram: zona 1,60ºC (constante); zona 2,90ºC (constante); zona 3, 90, 110, 130 ou 150ºC e zona 4 (matriz), 110, 130 ou 150ºC. Os resultados mostraram que, o aumento da TB nas zonas 3 e 4 causou um aumento na absorção de água, nitrogênio solúvel em água, índice de solubilidade de nitrogênio, proteína dispersível em água e índice de dispersibilidade de proteína. Não foi verificada a atividade do inibidor de tripsina nas farinhas extrusadas estudadas. Sugere-se, portanto, o uso destas nos produtos cárneos e de panificação.

Remoção de polifenóis da farinha de folhas de mandioca

A farinha de folhas de mandioca apresenta baixa digestibilidade, mesmo possuindo um teor relativamente elevado em proteínas, principalmente, devido à presença de substâncias como os polifenóis. Visando melhorar o aproveitamento protéico desta farinha, empregaram-se três solventes (água, etanol 50mL/100mL e hidróxido de amônio 1mol/L) para remover os polifenóis. Folhas maduras de mandioca foram coletadas na fase vegetativa, em três repetições, colocadas em bandejas de papel e secas à sombra sobre bancadas de madeira, em recinto fechado e arejado, em temperatura ambiente. Após secagem, retiraram-se os pecíolos e as folhas foram moídas e passadas em peneira de 40mesh. A farinha foi submetida, antes e após a remoção dos polifenóis, às análises de umidade, fibra detergente neutra (FDN), fibra detergente ácida (FDA), açúcares totais, proteína bruta, vitamina C total, beta-caroteno, cianeto, inibidor de tripsina, polifenóis e digestibilidade protéica in vitro. Após remoção dos polifenóis, houve diminuição dos teores de açúcares totais, vitamina C total, inibidor de tripsina e polifenóis e aumento de FDN, FDA, proteína bruta, beta-caroteno e digestibilidade protéica in vitro. Dos solventes empregados para remover polifenóis, o hidróxido de amônio foi o mais eficaz, com índice de remoção de 94%, seguido pelo etanol (83%) e água (65%). A digestibilidade da proteína in vitro aumentou em 74%, quando o solvente empregado na remoção dos polifenóis foi o hidróxido de amônio.

Qualidade nutricional e escore químico de aminoácidos de diferentes fontes protéicas

As proteínas são moléculas essenciais para aos organismos animais, devendo, portanto, estar presentes na alimentação em quantidades adequadas. Além do aspecto quantitativo deve-se levar em conta o aspecto qualitativo, isto é, seu valor nutricional, que dependerá de sua composição, digestibilidade, biodisponibilidade de aminoácidos essenciais, ausência de toxicidade e de fatores antinutricionais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a digestibilidade in vivo, o escore químico de aminoácidos (EQ) e o escore químico de aminoácido corrigido pela digestibilidade protéica (PDCAAS) das seguintes fontes de proteína: carne de rã sem osso, carne de rã com osso, carne de rã mecanicamente separada (CMS), carne bovina, ovo em pó, caseína, trigo, milho, soja convencional, soja isenta de inibidor de tripsina Kunitz e de lipoxigenases (soja KTI-LOX-), proteína texturizada de soja (PTS) e feijão. As proteínas de origem animal apresentaram maiores valores de digestibilidade que as de origem vegetal. Carne de rã sem osso apresentou a proteína com maior digestibilidade protéica de todas as proteínas estudadas, não diferindo, entretanto, da caseína, CMS, carne bovina e rã com osso. Das proteínas de origem animal, a do ovo em pó foi aquela que apresentou menor digestibilidade protéica. Nenhuma das proteínas de origem animal apresentou aminoácidos essenciais limitantes quando comparadas com o padrão da FAO/WHO. Feijão, soja convencional, soja KTI-LOX- e PTS, tiveram os aminoácidos sulfurados (metionina+cisteína) como limitantes. Enquanto que para trigo e milho, o aminoácido mais limitante foi a lisina. Soja KTI-LOX- e PTS apresentaram valores de PDCAAS superiores aos da soja convencional, mostrando uma possível elevação na qualidade protéica da soja melhorada geneticamente e da soja processada.

Clonagem e expressão do gene que codifica o inibidor de quimotripsina de Erythrina velutina WILLD. - caracterização e avaliação de seu potencial farmacológico

Proteinases are enzymes distributed widely founded in several organisms and perform many different functions, from maintaining homeostasis to the worsening of some diseases such as cancer, autoimmune diseases and infections. The proteins responsible of controlling the action of these enzymes are the inhibitors, that are classified based on their target proteases and are founded since simple organisms, such as bacteria, to higher organisms, such as larger plants and mammals. Plant proteinase inhibitors act by reducing or inactivating the activity of target proteases, thus, these proteins have been studied as potential tools in the treatment of diseases related to protease activities. In this context, an inhibitor of chymotrypsin from Erythrina velutina, called EvCI was previously purified and it was observed that this protein plays in vitro anticoagulant activity and anti-inflammatory activity in in vivo model. Aiming to reduce the environmental impact caused by the purification EvCI in high amounts and to facilitate the process of obtaining this protein, the recombinant chymotrypsin inhibitor from Eryhrina velutina was produced after cloning and expression in Escherichia coli. The bacteria were grown in LB medium and after induction of the expression this material was subjected to procedures for cell lysis and the product was applied on Nickel-affinity column. The proteins adsorbed were digested by thrombin and applied on Chymotrypsin-Sepharose affinity column, obtaining the purified inhibitor, named recEvCI. After electrophoresis, the recombinant inhibitor showed an approximately molecular mass of 17 kDa, and reduced the chymotrypsin and elastase activities in vitro. The recombinant inhibitor was sequenced and was found similar amino acids residues when compared to other inhibitors deposited in the database, with some modifications. recEvCI showed high stability under pH variations and reducing conditions, maintaining its activity around 80%. This protein increased the blood coagulation time in vitro by acting on the intrinsic pathway and did not show cytotoxicity against strains of mouse 3T3 fibroblasts and RAW 264.7 macrophages. recEvCI showed microbicide activity related to release of nitric oxide and consequently the activation of macrophages, futhermore having proinflammatory effects assessed by increased release of TNF-α. These results indicate that recEvCI can be biotechnologically used as a new tool in the control of coagulation-related diseases as well as can be an activating agent of the immune system in immunosuppressed individuals

Alterações bromatológicas em soja e milho processados por extrusão

Avaliaram-se os efeitos da temperatura do processo de extrusão sobre as características das frações nitrogenadas e dos carboidratos, do extrato etéreo, da digestibilidade in vitro da proteína e do fator antitríptico da soja e do milho. O experimento foi conduzido em delineamento experimental inteiramente casualizado, com três repetições, em esquema fatorial 5 × 4, composto de cinco combinações de soja e milho (100% soja; 75% soja e 25% milho; 50% soja e 50% milho; 25% soja e 75% milho; 100% milho, com base na matéria seca) e quatro temperaturas de extrusão (sem extrusão; e extrusão a 80, 100 ou 120ºC). O processo de extrusão promoveu aumento na fração lipídica e redução nos teores de fibra em detergente neutro (FDN) e fibra em detergente ácido (FDA), que variaram de acordo com a proporção de milho e soja e com a temperatura de processamento, conseqüentemente, os teores de proteína insolúvel em detergente neutro (PIDN) e proteína insolúvel em detergente ácido (PIDA) sofreram redução. A mesma tendência foi observada nos teores de lignina, que foram menores nas misturas com até 50% de soja, processadas a 120ºC. A extrusão, independentemente da temperatura, promoveu aumento da fração A dos carboidratos, tanto no milho como na soja. Nas frações B2 e C diminuíram com a maior participação de soja na mistura. A extrusão reduziu as frações nitrogenadas A, B1 e C, fato observado nas misturas contendo soja. O processamento promoveu aumento da fração B2, exceto no milho a 100%. Alterações menos significativas foram observadas na fração B3. O processamento por extrusão não altera a digestibilidade in vitro da proteína de milho e soja, no entanto, reduz a quantidade de inibidor de tripsina quando as misturas desses grãos são processadas a 120ºC.