Um novo inibidor de tripsina multifuncional de sementes de Erythrina velutina: caracterizacao e propriedades farmacologicas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

A sepse é uma doença complexa, de alta gravidade e durante o seu desenvolvimento pode ocorrer eventos inflamatórios graves, que podem levar o paciente ao óbito. Inibidores de peptidases isolados de sementes de leguminosas estão sendo estudados devido suas variadas atividades biomédicas ou farmacológicas. Nesse sentido, o presente estudo consistiu na avaliação das atividades multifuncionais do inibidor de tripsina presente nas sementes de Erythrina velutina (EvTIb). Dois inibidores de tripsina foram purificados por fracionamento com sulfato de amônio (30-60%), cromatografia de afinidade em tripsina-sepharose e cromatografia de fase reversa. Os inibidores purificados foram denominados de EvTIa e EvTIb e suas massas moleculares determinadas por espectrometria de massa por electrospray (ESI) foram: 19.228,16 Da e 19.210,48 Da, respectivamente. Dentre eles, o EvTIb apresentou maior atividade específica para tripsina e maior percentual de rendimento de extração, sendo, portanto, o escolhido para as análises adicionais. Os fragmentos desse inibidor gerados por tratamento enzimático com tripsina e pepsina foram analisados por espectrometria de massa MALDI-ToF-ToF, permitindo elucidar sua estrutura primária parcial. O EvTIb exibiu uma atividade de inibição do tipo não-competitiva para a tripsina com IC50 de 22 nmol.L-1 e constante de inibição (Ki) de 10 nmol.L-1. Além da atividade de inibição para tripsina, EvTIb também inibiu o fator Xa e a elastase neutrofílica, porém não inibiu trombina, quimotripsina ou peptidase 3. EvTIb se manteve estável a variação de pH e temperatura. EvTIb não foi citotóxico e não inibiu o crescimento bacteriano de Escherichia coli e Staphylococcus aureus. EvTIb foi capaz de prolongar o tempo de coagulação de maneira dose-dependente. Finalmente, observou-se que EvTIb foi capaz de restabelecer os níveis hemostáticos, inibir a migração leucocitária em camundongos sépticos e diminuir a secreção de TNF-α e não teve ação sobre a liberação de IL-6. Por outro lado, EvTIb promoveu um aumento na liberação de IFN- α e IL-12. Esses dados sugerem que EvTIb pode constituir em uma nova molécula com potencial de uso no tratamento da sepse e doenças relacionadas à coagulação