Automatic segmentation and 3D feature extraction of protein aggregates in Caenorhabditis Elegans

In the last years, it has become increasingly clear that neurodegenerative diseases involve protein aggregation, a process often used as disease progression readout and to develop therapeutic strategies. This work presents an image processing tool to automatic segment, classify and quantify these aggregates and the whole 3D body of the nematode Caenorhabditis Elegans. A total of 150 data set images, containing different slices, were captured with a confocal microscope from animals of distinct genetic conditions. Because of the animals’ transparency, most of the slices pixels appeared dark, hampering their body volume direct reconstruction. Therefore, for each data set, all slices were stacked in one single 2D image in order to determine a volume approximation. The gradient of this image was input to an anisotropic diffusion algorithm that uses the Tukey’s biweight as edge-stopping function. The image histogram median of this outcome was used to dynamically determine a thresholding level, which allows the determination of a smoothed exterior contour of the worm and the medial axis of the worm body from thinning its skeleton. Based on this exterior contour diameter and the medial animal axis, random 3D points were then calculated to produce a volume mesh approximation. The protein aggregations were subsequently segmented based on an iso-value and blended with the resulting volume mesh. The results obtained were consistent with qualitative observations in literature, allowing non-biased, reliable and high throughput protein aggregates quantification. This may lead to a significant improvement on neurodegenerative diseases treatment planning and interventions prevention

Estimação da área foliar por método não destrutivo, utilizando medidas lineares das folhas de espécies de Passiflora

Objetivou-se, com este trabalho, desenvolver uma equação confiável, que possibilite calcular a área foliar de forma rápida e não destrutiva, utilizando medidas lineares da folha, para as diferentes espécies de Passiflora (P. alata, P. coccinea, P. gibertii, P. ligularis, P. misera, P. mucronata, P. nitida, P. setacea). Foram coletadas trezentas folhas, de diferentes tamanhos, de cada espécie. Realizaram-se análises de regressão da área foliar versus comprimento da nervura principal, maior largura da folha e o produto destas. A área foliar foi medida com um dispositivo de medição automática e as medidas lineares foram determinadas utilizando-se régua. O modelo linear escolhido, para todas as espécies, foi o que utiliza o produto das variáveis independentes, por apresentar maior coeficiente de determinação (R²) e maior significância do coeficiente de regressão. Os modelos apresentaram coeficiente de determinação ajustado superior a 0,927 e índice de desempenho ótimo, segundo a classificação de Camargo e Sentelhas. No processo de validação do modelo, mostrou-se que a correlação da área foliar medida com a área foliar observada foi muito alta. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que a área foliar das espécies de Passifloras podem ser preditas, usando-se as determinações do comprimento e da largura das folhas.

Enraizamento adventício de estacas do maracujazeiro silvestre Passiflora mucronata Lam.: forma de veiculação e concentrações do ácido indol-3-butírico

Passiflora mucronata Lam. apresenta como características ser ornamental, medicinal e resistente à bacteriose nas folhas, além de ser altamente resistente à antracnose nos frutos e ramos. Objetivou-se, com este trabalho, avaliar a forma de veiculação, líquida ou sólida, e as concentrações do ácido indol-3-butírico (AIB) no enraizamento adventício de estacas de P. mucronata. O experimento foi conduzido no delineamento de blocos ao acaso, em esquema fatorial 2x5 (formas de veiculação do AIB: líquida e sólida x concentrações de AIB: 0; 250; 500; 750 e 1000 mg L-1, se líquido, ou mg Kg-1, se sólido), com quatro repetições, de 16 estacas cada. As características avaliadas foram enraizamento (%), número de raiz, comprimento da maior raiz (cm), volume de raiz (cm³) e massa de matéria seca de raiz (g). Verificou-se que o enraizamento de estacas de P. mucronata Lam. independe da forma como é veiculado o AIB, se sólida ou líquida, porém a qualidade do sistema radicular, avaliada por meio do número, volume e massa de matéria seca de raízes, foi superior à obtida ao se empregar o AIB sólido. O comportamento do enraizamento, do número e do comprimento de raízes foi linear crescente, até a máxima concentração de AIB (1000 mg L-1 ou mg Kg-1).

Identificação de compostos que modulam a patogénese da doença de Machado-Joseph em C.elegans: autofagia como alvo terapêutico: identification of small compounds that modulate pathogenesis of Machado-Joseph disease in a C.elegans model: targeting autophagy

A doença de Machado-Joseph (DMJ) ou ataxia espinocerebelosa do tipo 3 (SCA3), conhecida por ser a mais comum das ataxias hereditárias dominantes em todo o mundo, é uma doença neurodegenerativa autossómica dominante que leva a uma grande incapacidade motora, embora sem alterar o intelecto, culminando com a morte do doente. Atualmente não existe nenhum tratamento eficaz para esta doença. A DMJ é resultado de uma alteração genética causada pela expansão de uma sequência poliglutamínica (poliQ), na região C-terminal do gene que codifica a proteína ataxina-3 (ATXN3). Os mecanismos celulares das doenças de poliglutaminas que provocam toxicidade, bem como a função da ATXN3, não são ainda totalmente conhecidos. Neste trabalho, usamos, pela sua simplicidade e potencial genético, um pequeno animal invertebrado, o nemátode C. elegans, com o objetivo de identificar fármacos eficazes para o combate contra a patogénese da DMJ, analisando simultaneamente o seu efeito na agregação da ATXN3 mutante nas células neuronais in vivo e o seu impacto no comportamento motor dos animais. Este pequeno invertebrado proporciona grandes vantagens no estudo dos efeitos tóxicos de proteínas poliQ nos neurónios, uma vez que a transparência das suas 959 células (das quais 302 são neurónios) facilita a deteção de proteínas fluorescentes in vivo. Para além disso, esta espécie tem um ciclo de vida curto, é económica e de fácil manutenção. Neste trabalho testámos no nosso modelo transgénico da DMJ com 130Qs em C.elegans dois compostos potencialmente moduladores da agregação da ATXN3 mutante e da resultante disfunção neurológica, atuando pela via da autofagia. De modo a validar a possível importância terapêutica da ativação da autofagia os compostos candidatos escolhidos foram o Litío e o análogo da Rapamicina CCI-779, testados independentemente e em combinação. A neuroproteção conferida pelo Litío e pelo CCI-779 independentemente sugere que o uso destes fármacos possa ser considerado uma boa estratégia como terapia para a DMJ, a testar em organismos evolutivamente mais próximos do humano. A manipulação da autofagia, segundo vários autores, parece ser benéfica e pode ser a chave para o desenvolvimento de novos tratamentos para várias doenças relacionadas com a agregação proteica e o envelhecimento.

Detecção e Quantificação de Neurónios em C.elegans

Nesta dissertação é apresentado um estudo dos sistemas de processamento automático de imagem em contexto de um problema relacionado com a individualização de neurónios em imagens da nematoda C. elegans durante estudos relacionados com a doença de Parkinson. Apresenta-se uma breve introdução à anatomia do verme, uma introdução à doença de Parkinson e uso do C. elegans em estudos relacionados e também é feita a análise de artigos em contexto de processamento de imagem para contextualizar a situação atual de soluções para o problema de extração de características e regiões específicas. Neste projeto é desenvolvida uma pipeline com o auxilio do software CellProfiler para procurar uma resposta para o problema em questão.

Biologia da polinização e sistema reprodutivo de Passiflora coccinea Aubl. Em Manaus, Amazonas, Brasil1

Foi estudada a biologia da polinização e o sistema reprodutivo de Passiflora coccinea uma Passifloraceae comum na região Amazônica, conhecida popularmente por maracujá-poranga ou tomé-assu. Este estudo foi realizado em uma área perturbada, na Estação Experimental de Silvicultura Tropical do INPA (03º06'08" S, 59º58'54" W), em agosto e setembro de 1999. Dados de morfometria, horário de abertura e tempo de vida das flores foram obtidos. Diariamente foram observados os animais visitantes, o tipo de alimento procurado, horário e frequência das visitas às flores. Foram realizadas experiências sobre o sistema de reprodução, como também, observada a produção natural de frutos na área. A flor de P. coccinea apresenta a síndrome da ornitofilia pois tem antese diurna, é vermelha, não possui odor e apresenta néctar em abundância. Os beija-flores Amazilia sp. e Phaethornis superciliosus foram considerados seus polinizadores. Duas espécies de Hymenoptera c duas de Lepidoptera foram consideradas "ladras de pólen" e "ladras de néctar", respectivamente, pois não contactam a superfície estigmatífera. O sistema de reprodução desta espécie de maracujá é a xenogamia visto que não foram produzidos frutos por apomixia e por autogamia. A taxa natural de produção de frutos aumentou de 15% para aproximadamente 54% com a realização de polinizações manuais.

Estudo farmacognóstico e atividade in vitro sobre a coagulação sanguínea e agregação plaquetária das folhas de Passiflora nitida Kunth (Passifloraceae)

O gênero Passiflora (Passifloraceae) é utilizado principalmente para tratar doenças do SNC e cardiovasculares. A espécie Passiflora nitida Kunth é comumente conhecida como “maracujá-do-mato". A literatura relata o consumo in natura dos frutos desta espécie pela população local para distúrbios gastrointestinais. Considerando o potencial farmacológico do gênero, este trabalho teve por objetivo realizar estudo de caracterização fitoquímica desta espécie e estudar os efeitos dos extratos aquoso (EA), etanólico (EE) e hexânico (EH) de suas folhas sobre a coagulação sanguínea e agregação plaquetária. Para a caracterização fitoquímica foram realizados testes de cromatografia em camada delgada e ressonância magnética nuclear. O efeito dos extratos sobre a coagulação foi avaliado pelos testes de tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa). O efeito sobre a agregação plaquetária foi avaliado em plasma rico em plaquetas por método espectrofotométrico, usando adenosina difosfato (ADP) e adrenalina (ADR) como indutores da agregação. Os extratos EA, EE e EH apresentaram atividade coagulante pelo teste do TP e o EE apresentou atividade anticoagulante para o TTPa. Quando induzidos por ADP, os extratos EA, EE e EH apresentaram valores de concentração inibitória 50% (CI50, µg/mL) de 450,5 ± 50,7; 511,2 ± 35,5 e 394,4 ± 8,9, respectivamente, e quando induzidos por ADR apresentaram valores de 438,7 ± 5,2; 21,0 ± 1,9 e 546,9 ± 49,9, respectivamente. O EE apresentou atividade inibitória sobre a agregação. A caracterização fitoquímica foi sugestiva da presença de flavonóides e cumarinas, aos quais podem ser atribuídos, em parte, os efeitos biológicos estudados.

Passiflora fissurosa, uma nova espécie de Passifloraceae para o Amazonas, Brasil

Passiflora fissurosa M.A.D.Souza sp. nov., até o momento conhecida apenas da Reserva Florestal Adolpho Ducke, no Amazonas, Brasil, é descrita e ilustrada. Foi inserida no Subgênero Passiflora, Superseção Passiflora, Seção Laurifoliae e Série Laurifoliae, por apresentar folhas simples e inteiras, pecíolo biglandular, brácteas foliáceas, livres, maiores que 1 cm, pertencendo ao grupo de espécies com as duas séries externas da corona subiguais. Morfologicamente é semelhante a P. nitida, que difere pelo opérculo horizontal-encurvado com margem ereto-divergente, anel nectarífero presente, límen vertical e ovário glabro. A designação do epíteto deve-se à característica do ritidoma, suberoso e profundamente fissurado, característica somente encontrada em P. phellos, também pertencente à Série Laurifoliae, mas do grupo de espécies com a primeira série da corona menor que a segunda.

Studies on the mineral nutrition and fertilization of the passion fruit plant (Passiflora edulis f. flavicarpa): II - placement of fertilizer phosphorus

A localização do superfosfato (marcado com P32) no maracujá em produção foi estudada em condições de plantação comercial. Verificou-se que as aplicações em sulcos circulares ou faixas superficiais ao redor da planta tem eficiência equivalente sendo esses métodos três vezes superiores à localização do adubo em furos no solo. A pulverização foliar, por sua vez, mostrou-se 20 vezes mais eficiente que a aplicação no solo de acordo com os dois primeiros métodos.

Studies on the mineral nutrition and fertilization of the passion fruit plant (Passiflora edulis F. flavicarpa): II. placement of fertilizer phosphorus

1. Tagged superphosphate was applied to 2.5 year old passion fruit plants from a commercial plantation established in a sandy loam. 2. 100 grams of the fertilizer were distributed in the following ways: in a circular furrow 20 cm around the plant 40 cm from the stems; in a circular strip 10 cm wide, 40 cm from the stems; in six holes around the plants, 40 cm from the stems 20 cm deep, 2.5 cm in diameter. 3. 10 grams of the fertilizer in 11 of water were sprayed to the leaves. 4. Three weeks after the treatments were made, leaf samples were taken for analysis. 5. Determinations of specific activities both in the leaves and in the fertilizer used have shown that R in the plant was derived from the superphosphate in the following relative proportions (by making the first treatment equal to 100): circular furrow = 100; circular strip = 120; holes = 30; foliar spray = 230.

Extração de nutrientes durante o desenvolvimento do fruto do maracujazeiro amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg)

Com o objetivo de aquilatar a extração dos macro e micronutrientes, com exceção do cloro e do molibdênio, pelo fruto do maracujá amarelo, frutos foram colhidos de 10 a 80 dias de idade e analisados. Observou-se um aumento no peso do fruto até ao final da colheita. Nitrogênio e potássio figuram entre os elementos extraídos em maiores quantidades, 359 mg e 350 mg, respectivamente. Entre os micronutrientes, coube ao zinco a máxima absorção, 936 mg, seguido pelo ferro, 720 mg. O cobre foi absorvido em menor quantidade 72 mg.

Efeito da utilização do ácido indolil-3-butírico e do tratamento térmico na propagação vegetativa do gervão (Stachytarpheta elegans L.)

Estudou-se o efeito da aplicação de diferentes concentrações do ácido indoIiI-3-butírico (0, 20, 40, 60, 80, 100 e 200 ppm), em condições de campo e tratadas à frio (15°C), na indução de raízes em estacas de Gervão (Stachytarpheta elegans L.). Através dos dados obtidos concluiu se que houve melhor enraizamento nas concentrações de 40 e 60 ppm, em condições de campo, e que as estacas tratadas com 40 ppm e que posteriormente sofreram tratamento térmico (15°C) por 45 dias, apresentaram grande número de brotações (gemas) na parte aérea.

Polinização de Passiflora edulis f. flavicarpa (Passiflorales, Passifloraceae), por abelhas (Hymenoptera, Anthophoridae) em Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro

The yellow passion Passiflora edulis f. flavicarpa Deg. is allogamous, self incompatible, and it depends of insects pollinators to disseminate the pollen grains. The field work was conducted at Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro, Brazil, from October 17 to November 9 and December 12 to 21, 1995. It was analyzed 1565 flower buds, from which 423 showed well developed ovaries, five days after opening, this represents 27% of fruit set by natural pollination. It was observed 76,86 % of completely curved flowers, 21,22 % of partially curved flowers, and 1,92 % flowers without curvature. Five species of bees where observed on the flowers, from which two were the effective pollinator of yellow passion flower: Xylocopa (Megaxylocopa) frontalis (Olivier, 1789) and X. (Neoxylocopa) ordinaria Smith, 1874.

The novel hydroxylamine derivative NG-094 suppresses polyglutamine protein toxicity in Caenorhabditis elegans.

Aggregation-prone polyglutamine (polyQ) expansion proteins cause several neurodegenerative disorders, including Huntington disease. The pharmacological activation of cellular stress responses could be a new strategy to combat protein conformational diseases. Hydroxylamine derivatives act as co-inducers of heat-shock proteins (HSPs) and can enhance HSP expression in diseased cells, without significant adverse effects. Here, we used Caenorhabditis elegans expressing polyQ expansions with 35 glutamines fused to the yellow fluorescent protein (Q35-YFP) in body wall muscle cells as a model system to investigate the effects of treatment with a novel hydroxylamine derivative, NG-094, on the progression of polyQ diseases. NG-094 significantly ameliorated polyQ-mediated animal paralysis, reduced the number of Q35-YFP aggregates and delayed polyQ-dependent acceleration of aging. Micromolar concentrations of NG-094 in animal tissues with only marginal effects on the nematode fitness sufficed to confer protection against polyQ proteotoxicity, even when the drug was administered after disease onset. NG-094 did not reduce insulin/insulin-like growth factor 1-like signaling, but conferred cytoprotection by a mechanism involving the heat-shock transcription factor HSF-1 that potentiated the expression of stress-inducible HSPs. NG-094 is thus a promising candidate for tests on mammalian models of polyQ and other protein conformational diseases.