Poly(ethylene-co-acrylic acid) random copolymers : amphiphilic properties and self-assembly in aqueous medium

Les travaux de recherche présentés ici avaient pour objectif principal la synthèse de copolymères statistiques à base d’éthylène et d’acide acrylique (AA). Pour cela, la déprotection des groupements esters d’un copolymère statistique précurseur, le poly(éthylène-co-(tert-butyl)acrylate), a été effectuée par hydrolyse à l’aide d’iodure de triméthylsilyle. La synthèse de ce précurseur est réalisée par polymérisation catalytique en présence d’un système à base de Palladium (Pd). Le deuxième objectif a été d’étudier et de caractériser des polymères synthétisés à l’état solide et en suspension colloïdale. Plusieurs copolymères précurseurs comprenant différents pourcentages molaires en tert-butyl acrylate (4 à 12% molaires) ont été synthétisés avec succès, puis déprotégés par hydrolyse pour obtenir des poly(éthylène-coacide acrylique) (pE-co-AA) avec différentes compositions. Seuls les copolymères comprenant 10% molaire ou plus de AA sont solubles dans le Tétrahydrofurane (THF) et uniquement dans ce solvant. De telles solutions peuvent être dialysées dans l’eau, ce qui conduit à un échange lent entre cette dernière et le THF, et l’autoassemblage du copolymère dans l’eau peut ensuite être étudié. C’est ainsi qu’ont pu être observées des nanoparticules stables dans le temps dont le comportement est sensible au pH et à la température. Les polymères synthétisés ont été caractérisés par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ainsi que par spectroscopie Infra-Rouge (IR), avant et après déprotection. Les pourcentages molaires d’AA ont été déterminés par combinaison des résultats de RMN et ii de titrages conductimètriques. A l’état solide, les échantillons ont été analysés par Calorimétrie différentielle à balayage (DSC) et par Diffraction des rayons X. Les solutions colloïdales des polymères pE-co-AA ont été caractérisées par Diffusion dynamique de la lumière et par la DSC-haute sensibilité. De la microscopie électronique à transmission (TEM) a permis de visualiser la forme et la taille des nanoparticules.

Distribution intracellulaire et trafic des récepteurs à tyrosine kinase EphA4 et EphB2 à la synapse mature dans le système nerveux central murin

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

The effect of Nystatin on the inner ear : an experimental guinea pig study

Objectifs: Le Nystatin est un antibiotique efficace pour le traitement d’otomycose. Bien que sa sécurité au niveau de l’oreille externe soit bien établie, son utilisation n’est pas recommandée lorsqu’il y a une perforation tympanique. L’objectif de cette étude est d’évaluer le potentiel ototoxique du Nystatin lorsque celui-ci est appliqué directement au niveau de l’oreille moyenne. Méthodes: Nous avons fait une étude expérimentale avec 18 cochons d’Indes de souche Hartley que nous avons divisés en deux groupes. En exposant l’oreille moyenne de chaque animal au Nystatin (groupe I) ou à la néomycine (groupe II) et chaque oreille controlatérale à une solution physiologique (NaCl), la fonction auditive a été évaluée avec un test de potentiels évoqués auditif du tronc cérébral avant et après les injections. Une étude par microscopie électronique a permis une comparaison histologique de l’état des cellules ciliées cochléaires entre les 2 groupes. Résultats: Les pertes auditives moyennes du groupe « Nystatin » étaient de 13.0 dB et comparables aux pertes moyennes observées dans les oreilles ayant été injectées avec du NaCl (4.0 dB dans le groupe I et 15.1 dB dans le groupe II). Le groupe de contrôle « néomycine » a subi une perte auditive moyenne de 39.3 dB, ce qui représente une différence cliniquement et statistiquement significative (p<0.001). L’étude histologique avec une microscopie à balayage électronique a démontré une conservation de l’architecture des cellules ciliées cochléaires dans les groupe Nystatin et NaCl. La néomycine a causé une destruction marquée de ces structures. Conclusions: Le Nystatin ne provoque pas d’atteinte auditive ni de destruction des cellules ciliées externes après injection directe dans l’oreille moyenne chez le cochon d’Inde.

Données nouvelles sur l’innervation à dopamine du striatum et son co-phénotype glutamatergique

Une sous-population des neurones à dopamine (DA) du mésencéphale ventral du rat et de la souris étant connue pour exprimer l'ARN messager du transporteur vésiculaire 2 du glutamate (VGLUT2), nous avons eu recours à l'immunocytochimie en microscopie électronique, après simple ou double marquage de l'enzyme de synthèse tyrosine hydroxylase (TH) et de VGLUT2, pour déterminer la présence de l'une et/ou l'autre protéine dans les terminaisons (varicosités) axonales de ces neurones et caractériser leur morphologie ultrastructurale dans diverses conditions expérimentales. Dans un premier temps, des rats jeunes (P15) ou adultes (P90), ainsi que des rats des deux âges soumis à l'administration intraventriculaire cérébrale de la cytotoxine 6-hydroxydopamine (6-OHDA) dans les jours suivant la naissance, ont été examinés, afin d'étayer l'hypothèse d'un rôle de VGLUT2 au sein des neurones DA, au cours du développement normal ou pathologique de ces neurones. Chez le jeune rat, ces études ont montré: i) la présence de VGLUT2 dans une fraction importante des varicosités axonales TH immunoréactives du coeur du noyau accumbens ainsi que du néostriatum; ii) une augmentation de la proportion de ces terminaisons doublement marquées dans le noyau accumbens par suite de la lésion 6-OHDA néonatale; iii) le double marquage fréquent des varicosités axonales appartenant à l'innervation DA aberrante (néoinnervation), qui se développe dans la substance noire, par suite de la lésion 6-OHDA néonatale. Des différences significatives ont aussi été notées quant à la dimension des terminaisons axonales marquées pour la TH seulement, VGLUT2 seulement ou TH et VGLUT2. Enfin, à cet âge (P15), toutes les terminaisons doublement marquées sont apparues dotées d'une spécialisation membranaire synaptique, contrairement aux terminaisons marquées pour la TH ou pour VGLUT2 seulement. Dans un deuxième temps, nous avons voulu déterminer le devenir du double phénotype chez le rat adulte (P90) soumis ou non à la lésion 6-OHDA néonatale. Contrairement aux observations recueillies chez le jeune rat, nous avons alors constaté: i) l'absence complète de terminaisons doublement marquées dans le coeur du noyau accumbens et le néostriatum d'animaux intacts, de même que dans les restes de la substance noire des animaux 6-OHDA lésés; ii) une très forte baisse de leurnombre dans le coeur du noyau accumbens des animaux 6-OHDA lésés. Ces observations, suggérant une régression du double phénotype TH/VGLUT2 avec l'âge, sont venues renforcer l'hypothèse d'un rôle particulier d'une co-libération de glutamate par les neurones mésencéphaliques DA au cours du développement. Dans ces conditions, il est apparu des plus intéressants d'examiner l'innervation DA méso-striatale chez deux lignées de souris dont le gène Vglut2 avait été sélectivement invalidé dans les neurones DA du cerveau, ainsi que leurs témoins et des souris sauvages. D'autant que malgré l'utilisation croissante de la souris en neurobiologie, cette innervation DA n'avait jamais fait l'objet d’une caractérisation systématique en microscopie électronique. En raison de possibles différences entre le coeur et la coque du noyau accumbens, l'étude a donc porté sur les deux parties de ce noyau ainsi que le néostriatum et des souris jeunes (P15) et adultes (P70-90) de chaque lignée, préparées pour l'immunocytochimie de la TH, mais aussi pour le double marquage TH et VGLUT2, selon le protocole précédemment utilisé chez le rat. Les résultats ont surpris. Aux deux âges et quel que soit le génotype, les terminaisons axonales TH immunoréactives des trois régions sont apparues comparables quant à leur taille, leur contenu vésiculaire, le pourcentage contenant une mitochondrie et une très faible incidence synaptique (5% des varicosités, en moyenne). Ainsi, chez la souris, la régression du double phénotype pourrait être encore plus précoce que chez le rat, à moins que les deux protéines ne soient très tôt ségréguées dans des varicosités axonales distinctes des mêmes neurones DA. Ces données renforcent aussi l’hypothèse d’une transmission diffuse (volumique) et d’un niveau ambiant de DA comme élément déterminant du fonctionnement du système mésostriatal DA chez la souris comme chez le rat.

Récepteur EphA7 : expression régionale dans le cerveau et localisation ultrastructurale dans l’hippocampe chez le rat et la souris adultes

Bourse de maîtrise du Groupe de recherche sur le système nerveux central GRSNC, (2009,2010) Bourse d’études supérieures du Canada Frederick Banting et Charles Best, IRSC Instituts de recherche en santé du Canada, (2011)

Rôle du récepteur EphA4 dans la plasticité structurale neurono-gliale du noyau supraoptique à la suite d’un régime à l’eau salée

Les noyaux supraoptiques (NSO) et paraventriculaires (NPV) de l’hypothalamus montrent un phénomène réversible de plasticité structurale neurono-gliale dans diverses conditions physiologiques telles que la parturition, l’allaitement ou lors d’une surcharge en sel. En effet, les feuillets astrocytaires qui enveloppent normalement les somas et dendrites des neurones à ocytocine (OT) ou à vasopressine (AVP) se rétractent alors, autour des neurones à OT, laissant place à la formation de nouvelles synapses, surtout GABAergiques. Nous avons émis l’hypothèse voulant que ces mouvements cellulaires soient régulés par des molécules connues pour leurs rôles dans l’adhérence et la motilité cellulaires, notamment les récepteurs Eph et les éphrines (Efn). Nous avons étudié le rôle de l’un de ces récepteurs, EphA4, un récepteur à tyrosine kinase reconnaissant l’ensemble des Efn, A ou B, puis tenté d’identifier les Efn partenaires dans le NSO, à la suite d’une surcharge en sel. Pour démontrer la présence d’EphA4 dans le NSO et déterminer l’effet d’une surcharge en sel sur son expression et sa localisation, nous avons utilisé l’hybridation in situ et l’immunohistochimie en microscopie électronique, sur des coupes de cerveaux de souris ou rats traités ou non à l’eau salée pendant 1-7 j, avec des ribosondes ou des anticorps spécifiques pour EphA4. Ces travaux ont démontré une augmentation de l’expression d’EphA4 dans le NSO, notamment dans des dendrites, après le régime salé. La distribution de cette expression correspondait à celle des neurones OT et était absente de la glia limitans. Nous avons ensuite déterminé l’effet d’une absence d’EphA4 sur les mouvements astrocytaires et la synaptogènese autour des dendrites à OT et AVP, en utilisant des souris EphA4 knockouts et des souris de type sauvage des mêmes portées. Nous avons ainsi mesuré la couverture astrocytaire des dendrites OT ou AVP, identifiées par immunocytochimie anti-OT ou anti-AVP, en microscopie électronique. Ces mesures ont confirmé la rétraction des feuillets astrocytaires et la synaptogenèse autour des dendrites OT, mais pas autour des dendrites AVP, chez les souris de type sauvage, et démontré que la rétraction des feuillets astrocytaires et la synaptogenèse sur les dendrites OT ne se produisait pas chez les souris knockouts soumises à la surcharge en sel. L’ensemble de ces résultats démontre un rôle d’EphA4 dans cette plasticité structurale neurono-gliale. Afin d’identifier l’Efn partenaire d’EphA4 dans cette fonction, nous avons utilisé l’hybridation in situ et l’immunohistochimie pour les EfnB3 et -A3. L’hybridation in situ n’a pas démontré d’expression de l’EfnB3 dans le NSO, tandis que les résultats pour l’EfnA3 restent à quantifier. Cependant, l’immunohistochimie anti-EfnA3 montre un marquage d’astrocytes dans le NSO et la glia limitans, marquage qui semble augmenter après surcharge en sel, mais il reste à démontrer que l’anticorps anti-EfnA3 est bien spécifique et à quantifier les éventuels changements sur un plus grand nombre d’animaux. L’ensemble de ces observations démontre un rôle du récepteur EphA4 dans les mécanismes à la base des changements structuraux neurono-gliaux du NSO et pointe vers l’EfnA3 comme partenaire d’EphA4 dans ce modèle.

Préparations de docosanol nanoformulées pour usage topique

La réduction de la taille des particules jusqu’à l’obtention de nanocristaux est l’une des approches utilisées afin d’améliorer la pénétration cutanée des médicaments à usage topique. Nous proposons que la fabrication d’une formulation semi solide (hydrogel) à base de nanosuspension de docosanol, aboutira à une diffusion du principe actif supérieure à celle du produit commercial Abreva®, à travers des membranes synthétiques de polycarbonates. Le broyage humide est la technique proposée pour la production des nanoparticules de docosanol. Nous proposons aussi la préparation d’une formulation semi-solide (hydrogel) à usage topique à partir de la nanosuspension de docosanol. La nanosuspension de docosanol est obtenue par dispersion du docosanol en solution aqueuse en présence du polymère stabilisant hydroxypropylcellulose (HPC) et du surfactant laurylsulfate de sodium (SDS) suivi d’un broyage humide à faible ou à haute énergie. L’hydrogel de docosanol nanoformulé est préparé à l’aide de la nanosuspension de docosanol qui subit une gélification par le carbopol Ultrez 21 sous agitation mécanique suivie d’une neutralisation au triéthanolamine TEA. La taille des particules de la nanosuspension et de l’hydrogel a été déterminée par diffusion dynamique de la lumière (DLS). Une méthode analytique de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) munie d’un détecteur évaporatif (ELSD) a été développée et validée pour évaluer la teneur de docosanol dans les préparations liquides, dans les différentes nanosuspensions et dans les hydrogels de docosanol. L’état de cristallinité des nanocristaux dans la nanosuspension et dans l’hydrogel a été étudié par calorimétrie différentielle à balayage. La morphologie de la nanosuspension et de l’hydrogel de docosanol a été examinée par microscopie électronique à balayage (MEB). Les propriétés rhéologiques et de stabilité physique à différentes températures ont été aussi étudiées pour la formulation semi-solide (hydrogel). De même, la libération in vitro du docosanol contenu dans l’hydrogel et dans le produit commercial Abreva® a été étudiée à travers deux membranes de polycarbonates de taille de pores 400 et 800 nm. Dans le cas de nanosuspensions, des cristaux de docosanol de taille nanométrique ont été produits avec succès par broyage humide. Les nanoparticules de tailles variant de 197 nm à 312 nm ont été produites pour des pourcentages différents en docosanol, en polymère HPC et en surfactant SDS. Après lyophilisation, une augmentation de la taille dépendant de la composition de la formulation a été observée tout en restant dans la gamme nanométrique pour la totalité presque des formulations étudiées. Dans le cas des hydrogels examinés, la taille moyenne des particules de docosanol est maintenue dans la gamme nanométrique avant et après lyophilisation. L’analyse thermique des mélanges physiques, des nanosuspensions et des hydrogels de docosanol a révélé la conservation de l’état de cristallinité des nanocristaux de docosanol après broyage et aussi après gélification. L’examen par microscopie électronique à balayage (MEB) a montré que la nanosuspension et l’hydrogel ont tous deux une morphologie régulière et les nanoparticules ont une forme sphérique. De plus les nanoparticules de la nanosuspension ont presque la même taille inférieure à 300 nm en accord avec le résultat obtenu par diffusion dynamique de la lumière (DLS). Les nanoparticules de l’hydrogel ont une légère augmentation de taille par rapport à celle de la nanosuspension, ce qui est en accord avec les mesures de DLS. D’après les mesures rhéologiques, l’hydrogel de docosanol a un comportement pseudoplastique et un faible degré de thixotropie. L’étude de stabilité physique a montré que les formulations d’hydrogel sont stables à basse température (5°C) et à température ambiante (21°C) pendant une période d’incubation de 13 semaines et instable au-delà de 30°C après deux semaines. La méthode HPLC-ELSD a révélé des teneurs en docosanol comprises entre 90% et 110% dans le cas des nanosuspensions et aux alentours de 100% dans le cas de l’hydrogel. L’essai de diffusion in vitro a montré qu’il y a diffusion de docosanol de l’hydrogel à travers les membranes de polycarbonates, qui est plus marquée pour celle de pore 800 nm, tandis que celui du produit commercial Abreva® ne diffuse pas. Le broyage humide est une technique bien adaptée pour la préparation des nanosuspensions docosanol. Ces nanosuspensions peuvent être utilisée comme base pour la préparation de l’hydrogel de docosanol nanoformulé.

Regenerative potential of corneal endothelium from patients with fuchs endothelial corneal dystrophy

La dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD, pour l’abréviation du terme anglais « Fuchs endothelial corneal dystrophy ») est une maladie de l'endothélium cornéen. Sa pathogenèse est mal connue. Aucun traitement médical n’est efficace. Le seul traitement existant est chirurgical et consiste dans le remplacement de l’endothélium pathologique par un endothélium sain provenant de cornées de la Banque des yeux. Le traitement chirurgical, en revanche, comporte 10% de rejet immunologique. Des modèles expérimentaux sont donc nécessaires afin de mieux comprendre cette maladie ainsi que pour le développement de traitements alternatifs. Le but général de cette thèse est de développer un modèle expérimental de la FECD en utilisant le génie tissulaire. Ceci a été réalisé en trois étapes. 1) Tout d'abord, l'endothélium cornéen a été reconstruit par génie tissulaire en utilisant des cellules endothéliales en culture, provenant de patients atteints de FECD. Ce modèle a ensuite été caractérisé in vitro. Brièvement, les cellules endothéliales cornéennes FECD ont été isolées à partir de membranes de Descemet prélevées lors de greffes de cornée. Les cellules au deuxième ou troisième passages ont ensuite été ensemencées sur une cornée humaine préalablement décellularisée. Suivant 2 semaines de culture, les endothélia cornéens reconstruits FECD (n = 6) ont été évalués à l'aide d'histologie, de microscopie électronique à transmission et d’immunomarquages de différentes protéines. Les endothélia cornéens reconstruits FECD ont formé une monocouche de cellules polygonales bien adhérées à la membrane de Descemet. Les immunomarquages ont démontré la présence des protéines importantes pour la fonctionnalité de l’endothélium cornéen telles que Na+-K+/ATPase α1 et Na+/HCO3-, ainsi qu’une expression faible et uniforme de la protéine clusterine. 2) Deux techniques chirurgicales (DSAEK ; pour « Descemet stripping automated endothelial keratoplasty » et la kératoplastie pénétrante) ont été comparées pour la transplantation cornéenne dans le modèle animal félin. Les paramètres comparés incluaient les défis chirurgicaux et les résultats cliniques. La technique « DSAEK » a été difficile à effectuer dans le modèle félin. Une formation rapide de fibrine a été observée dans tous les cas DSAEK (n = 5). 3) Finalement, la fonctionnalité in vivo des endothélia cornéens reconstruits FECD a été évaluée (n = 7). Les évaluations in vivo comprenaient la transparence, la pachymétrie et la tomographie par cohérence optique. Les évaluations post-mortem incluaient la morphométrie des cellules endothéliales, la microscopie électronique à transmission et des immunomarquage de protéines liées à la fonctionnalité. Après la transplantation, la pachymétrie a progressivement diminué et la transparence a progressivement augmenté. Sept jours après la transplantation, 6 des 7 greffes étaient claires. La microscopie électronique à transmission a montré la présence de matériel fibrillaire sous-endothélial dans toutes les greffes d’endothelia reconstruits FECD. Les endothélia reconstruits exprimaient aussi des protéines Na+-K+/ATPase et Na+/HCO3-. En résumé, cette thèse démontre que les cellules endothéliales de la cornée à un stade avancé FECD peuvent être utilisées pour reconstruire un endothélium cornéen par génie tissulaire. La kératoplastie pénétrante a été démontrée comme étant la procédure la plus appropriée pour transplanter ces tissus reconstruits dans l’œil du modèle animal félin. La restauration de l'épaisseur cornéenne et de la transparence démontrent que les greffons reconstruits FECD sont fonctionnels in vivo. Ces nouveaux modèles FECD démontrent une réhabilitation des cellules FECD, permettant d’utiliser le génie tissulaire pour reconstruire des endothelia fonctionnels à partir de cellules dystrophiques. Les applications potentielles sont nombreuses, y compris des études physiopathologiques et pharmacologiques.

Localisation régionale et subcellulaire du récepteur EphA7 dans l'hippocampe et le cervelet du rat adulte

EphA7 est un membre de la famille des récepteurs à tyrosine kinase, Eph, qui assume plusieurs rôles durant le développement du système nerveux central. Par ailleurs, il continue d’être fortement exprimé dans le cerveau adulte, notamment dans les régions reconnues pour leur grande plasticité synaptique, telles que l’hippocampe et le cervelet. Par hybridation in situ, nous avons cartographié la distribution de l’ARNm d’EphA7 dans le cerveau de rats et souris adultes. Les couches pyramidales du CA1 et CA3 et granulaire du gyrus dentelé de la formation de l’hippocampe ont montré le plus fort marquage. Un niveau d’ARNm d’EphA7 plus modéré a été observé dans l’habenula, le striatum, l’amygdale, le cervelet et le cortex cingulaire, piriforme et entorhinal. Quant à la protéine détectée par immunohistochimie, elle était fortement exprimée dans le neuropile de l’hippocampe et la couche des cellules de Purkinje du cervelet. En microscopie électronique, dans toutes les couches de l’hippocampe et du cervelet examinées, des épines dendritiques, des dendrites, des axones non-myélinisés, des terminaisons axonales et quelquefois des prolongements astrocytaires constituaient les éléments immunopositifs. Comme on pouvait déjà le voir en microscopie photonique, les corps cellulaires des cellules pyramidales et granulaires de l’hippocampe ainsi que des cellules de Purkinje du cervelet montraient aussi du marquage, surtout intracellulaire. L’analyse quantitative a révélé la localisation préférentielle d’EphA7 dans des dendrites et épines dendritiques. La majorité des épines marquées formaient des synapses asymétriques (excitatrices) avec des terminaisons axonales non marquées. La double localisation préférentielle d’EphA7 dans les dendrites ainsi que les densités post-synaptiques des épines dendritiques est compatible avec l’hypothèse d’un rôle d’EphA7 dans le maintien ou la fonction de certaines synapses du SNC adulte.

Electrospinning and characterization of supramolecular poly(4-vinyl pyridine)-small molecule complexes

La chimie supramoléculaire est basée sur l'assemblage non covalent de blocs simples, des petites molécules aux polymères, pour synthétiser des matériaux fonctionnels ou complexes. La poly(4-vinylpyridine) (P4VP) est l'une des composantes supramoléculaires les plus utilisées en raison de sa chaîne latérale composée d’une pyridine pouvant interagir avec de nombreuses espèces, telles que les petites molécules monofonctionnelles et bifonctionnelles, grâce à divers types d'interactions. Dans cette thèse, des assemblages supramoléculaires de P4VP interagissant par liaisons hydrogène avec de petites molécules sont étudiés, en ayant comme objectifs de faciliter l'électrofilage de polymères et de mieux comprendre et d'optimiser la photoréponse des matériaux contenant des dérivés d'azobenzène. Une nouvelle approche est proposée afin d'élargir l'applicabilité de l'électrofilage, une technique courante pour produire des nanofibres. À cet effet, un complexe entre la P4VP et un agent de réticulation bifonctionnel capable de former deux liaisons hydrogène, le 4,4'-biphénol (BiOH), a été préparé pour faciliter le processus d’électrofilage des solutions de P4VP. Pour mieux comprendre ce complexe, une nouvelle méthode de spectroscopie infrarouge (IR) a d'abord été développée pour quantifier l'étendue de la complexation. Elle permet de déterminer un paramètre clé, le rapport du coefficient d'absorption d'une paire de bandes attribuées aux groupements pyridines libres et liées par liaisons hydrogène, en utilisant la 4-éthylpyridine comme composé modèle à l’état liquide. Cette méthode a été appliquée à de nombreux complexes de P4VP impliquant des liaisons hydrogène et devrait être généralement applicable à d'autres complexes polymères. La microscopie électronique à balayage (SEM) a révélé l'effet significatif du BiOH sur la facilité du processus d’électrofilage de P4VP de masses molaires élevées et faibles. La concentration minimale pour former des fibres présentant des perles diminue dans le N, N'-diméthylformamide (DMF) et diminue encore plus lorsque le nitrométhane, un mauvais solvant pour la P4VP et un non-solvant pour le BiOH, est ajouté pour diminuer l'effet de rupture des liaisons hydrogène causé par le DMF. Les liaisons hydrogène dans les solutions et les fibres de P4VP-BiOH ont été quantifiées par spectroscopie IR et les résultats de rhéologie ont démontré la capacité de points de réticulation effectifs, analogues aux enchevêtrements physiques, à augmenter la viscoélasticité de solutions de P4VP pour mieux résister à la formation de gouttelettes. Cette réticulation effective fonctionne en raison d'interactions entre le BiOH bifonctionnel et deux chaînes de P4VP, et entre les groupements hydroxyles du BiOH complexé de manière monofonctionnelle. Des études sur d’autres agents de réticulation de faible masse molaire ont montré que la plus forte réticulation effective est introduite par des groupes d’acide carboxylique et des ions de zinc (II) qui facilitent le processus d’électrofilage par rapport aux groupements hydroxyles du BiOH. De plus, la sublimation est efficace pour éliminer le BiOH contenu dans les fibres sans affecter leur morphologie, fournissant ainsi une méthode élégante pour préparer des fibres de polymères purs dont le processus d’électrofilage est habituellement difficile. Deux complexes entre la P4VP et des azobenzènes photoactifs portant le même groupement tête hydroxyle et différents groupes queue, soit cyano (ACN) ou hydrogène (AH), ont été étudiés par spectroscopie infrarouge d’absorbance structurale par modulation de la polarisation (PM-IRSAS) pour évaluer l'impact des groupements queue sur leur performance lors de l'irradiation avec de la lumière polarisée linéairement. Nous avons constaté que ACN mène à la photo-orientation des chaînes latérales de la P4VP et des azobenzènes, tandis que AH mène seulement à une orientation plus faible des chromophores. La photo-orientation des azobenzènes diminue pour les complexes avec une teneur croissante en chromophore, mais l'orientation de la P4VP augmente. D'autre part, l'orientation résiduelle après la relaxation thermique augmente avec la teneur en ACN, à la fois pour le ACN et la P4VP, mais la tendance opposée est constatée pour AH. Ces différences suggèrent que le moment dipolaire a un impact sur la diffusion rotationnelle des chromophores. Ces résultats contribueront à orienter la conception de matériaux polymères contenant des azobenzène efficaces.

Caractérisation du rôle de l’amyline (IAPP) dans le diabète de type 2 : études de dérivés peptidiques et de composés inhibiteurs de la formation d’amyloïde

L’amyloïdose, une maladie progressive et incurable, implique une vaste panoplie de pathologies et de pathogénèses, qui est expliquée par la grande variabilité biologique et structurale des protéines responsables de la formation des dépôts d’amyloïde. L’amyline (polypeptide amyloïde des îlots pancréatiques, IAPP) est une protéine très susceptible de subir des changements de conformation impliquant les feuillets bêta et conférant aussi des propriétés physicochimiques distinctes. Cette protéine prend alors une forme fibrillaire et se dépose dans les îlots de Langerhans chez les humains atteints de diabète de type 2 ou d’insulinome. Ces dépôts d’amyloïde pancréatique (AIAPP) ont été décrits chez certaines espèces animales telles que les félins domestiques, les grands félins, le raton laveur et les primates non humains. La formation de dépôts d’amyloïde contribue à la pathogénèse du diabète de type 2, mais les mécanismes qui induisent la conversion de l’amyline (IAPP) en amyloïde (AIAPP) ne sont pas complètement compris. Les hypothèses du projet sont que certaines variations présentes dans les séquences peptidiques de l’IAPP provenant de différentes espèces animales jouent un rôle critique pour la formation de fibrilles et que plusieurs composés chimiques aromatiques/phénoliques sont capables d’abroger la formation de dépôts d’amyloïde. Le projet de recherche consiste donc à caractériser la propension des différentes isoformes animales d’IAPP à former de l’amyloïde in vitro afin d’identifier les acides aminés jouant un rôle clé dans cette transformation structurale et ultimement d’inhiber la formation d’amyloïde pancréatique. Le projet se divise en deux volets principaux. Le premier consiste à identifier les différentes séquences peptidiques de l’IAPP retrouvées chez les espèces animales. L’objectif est d’identifier les acides aminés jouant un rôle clé dans la formation d’amyloïde. Le gène de l’IAPP a été séquencé chez plus d’une quarantaine d’espèces. Le potentiel d’agrégation des séquences obtenues a été simulé à l’aide d’outils bioinformatique. Une librairie de 23 peptides a été commandée afin de procéder à des analyses physicochimiques in vitro permettant d’évaluer le potentiel amyloïdogénique (test fluorimétrique à la thioflavine T, essai de liaison au rouge Congo, dichroïsme circulaire, microscopie électronique à transmission) et cytotoxique (sur une lignée cellulaire provenant d’insulinome : INS-1). Les analyses effectuées à partir de la librairie constituée de 23 peptides ont permis d’identifier trois séquences ne formant pas d’amyloïde et qui proviennent des espèces animales suivantes : le tamarin lion doré (Leontopithecus rosalia), le grand dauphin (Tursiops truncatus) et l’alpaga (Vicugna pacos). Un site potentiellement critique est le segment 8-20 présentant le motif NFLVH qui ne forme plus d’amyloïde lorsqu’il est remplacé par le motif DFLGR ou KFLIR. Les acides aminés 29P, 14K et 18R sont également impliqués dans l’inhibition de la transformation structurale en fibrille. La dernière partie du projet consiste à inhiber la formation de l’amyloïde en utilisant des composés chimiques commercialisés (hypoglycémiants, anti-inflammatoires non stéroïdiens) ou nouvellement synthétisés dans notre laboratoire (les aryles éthyles urées). Un criblage d’une soixantaine de composés chimiques a été conduit dans cette étude. Leur efficacité a été testée sur l’IAPP humaine, qui possède un fort potentiel amyloïdogénique. Les techniques utilisées sont les mêmes que celles exploitées précédemment. L’essai de liaison croisée photo-induite ("photo-induced cross-linking of unmodified proteins", PICUP) a été réalisé afin d’étudier les formes intermédiaires (monomères, oligomères). Un total de 11 composés chimiques a démontré un potentiel à inhiber l’agrégation des fibrilles. Pour la classe des hypoglycémiants, le glyburide, le répaglinide et la troglitazone ont montré l’activité thérapeutique la plus élevée pour retarder et réduire la formation de fibrilles. Les anti-inflammatoires antiamyloïdogènes actifs incluaient le diclofenac, le méloxicam, le phénylbutazone, le sulindac et le ténoxicam. Les aryles étyles urées les plus intéressantes étaient la EU-362 et la EU-418. Tous ces composés ont conféré une protection cellulaire contre l’activité cytotoxique des fibrilles. Les molécules actives possèdent des éléments structuraux communs tels des substituants donneurs d’électrons (alcool, amine, halogène) sur un noyau benzène. En conclusion, ce projet de recherche a permis de caractériser l’IAPP chez diverses espèces animales, dont plusieurs chez lesquelles elle n’avait pas encore été décrite, de déterminer les sites jouant un rôle clé dans sa transformation en amyloïde et, ultimement, de tester le potentiel thérapeutique de nouveaux agents antiamyloïdogènes dans le diabète de type 2. Nous espérons que ce projet ouvrira ainsi la porte à de nouvelles stratégies de traitement.

Caractérisation et surexpression des fimbriae de type chaperon-placier de Salmonella enterica sérovar Typhi

Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) est l’agent responsable de la fièvre typhoïde et cause environ 200 000 morts et 27 millions de cas annuellement. C’est un pathogène entérique dont le réservoir est restreint à l’Homme. Les raisons de cette restriction d’hôte sont méconnues et pourraient dépendre de l’expression de facteurs d’adhésion à des étapes importantes au cours de la pathogenèse. L’annotation bioinformatique du génome de S. Typhi identifie 12 fimbriae de type chaperon-placier (FCP), un curli ainsi qu’un pilus de type IV. L’objectif de ce projet de recherche est d’étudier ces systèmes d’adhésion peu caractérisés. D’abord, le niveau d’expression de ces gènes a été évalué dans différentes conditions de culture in vitro en utilisant une approche de gènes rapporteurs. L’expression des 14 systèmes d’adhésion a été détectée. Nos résultats indiquent qu’une carence en fer favorise l’expression des opérons bcf et csg. Indépendamment du fer, l’expression de bcf, csg, pil, sef, sta, stc, stg et sth est influencée par la richesse nutritive du milieu. L’incubation en milieu LB liquide favorise l’expression de la plupart des systèmes d’adhésion par rapport à un milieu LB liquide sans agitation ou un milieu LB solide. En somme, l’expression des systèmes d’adhésion de S. Typhi a été observée et est influencée par des conditions environnementales. Dans un second volet, nous avons tent de surexprimer les différents systèmes d’adhésion chez une souche d’E. coli ou de S. Typhi afimbriaire. Avec cette approche, nous avons été en mesure de démontrer que l’opéron tcf encode pour un fimbria fonctionnel que l’on a pu observer en microscopie électronique. L’expression de tcf chez une souche afimbriaire d’E. coli et S. Typhi a également diminué leur capacité d’adhésion à des cellules épithéliales intestinales humaines lors d’essais in vitro. Nos observations démontrent que l’expression des systèmes d’adhésion retrouvés chez S. Typhi est influencée par les conditions enviroi9onnementales. Au moins un de ces systèmes est fonctionnel. Ceci suggère une contribution des systèmes d’adhésion retrouvés chez S. Typhi lors de l’interaction de ce pathogène avec l’humain.

Développement d'une méthode de quantification des varicosités synaptiques et asynaptiques établies par les neurones dopaminergiques

Les neurones dopaminergiques (DA) de la substance noire compacte (SNc) et de l’aire tegmentaire ventrale (ATV) développent des contacts de type synaptique et non synaptique. Malgré de nombreux travaux sur la synaptogénèse en général, aucune méthode autre que la microscopie électronique, n’a été développée pour quantifier les varicosités synaptiques et asynaptiques issues des neurones DA. L’objectif principal de ce projet était de développer une méthode d’analyse et de quantification des varicosités synaptiques et asynaptiques des neurones DA. L’hypothèse proposée est qu’il devait être possible de détecter la présence de synapses en visualisant la colocalisation d’une protéine présynaptique telle que synaptotagmine 1 (SYT1) avec un marqueur post-synaptique tel que la postsynaptic density protein 95 (PSD95). Pour ce faire, nous avons préparé des cultures primaires de neurones DA à l’aide d’une lignée de souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle du promoteur de la tyrosine hydroxyalse (TH). Nous avons ensuite visualisé les terminaisons axonales à l'aide de marquages immunocytochimiques de protéines pré et post-synaptiques. L’analyse quantitative des images a été effectuée avec le logiciel de traitement d’image Image-J. Nos résultats montrent que, via l’association d’un marqueur présynaptique tel que SYT1 avec un marqueur postsynaptique tel que PSD95, seule une minorité des terminaisons établies par les neurones DA sont de type synaptique. En contraste, des neurones glutamatergiques du cortex, établissent une majorité de terminaisons associées à un marqueur postsynaptique. Nos résultats valident donc la mise en place d'une technique d'analyse permettant de quantifier la proportion de terminaisons synaptiques et asynaptiques établies par les neurones DA.

Applying scanning electron microscopy for the ultrastructural and clinical analysis of periprosthetic capsules in implant-based breast reconstruction

La reconstruction en deux étapes par expanseur et implant est la technique la plus répandue pour la reconstruction mammmaire post mastectomie. La formation d’une capsule périprothétique est une réponse physiologique universelle à tout corps étranger présent dans le corps humain; par contre, la formation d’une capsule pathologique mène souvent à des complications et par conséquent à des résultats esthétiques sous-optimaux. Le microscope électronique à balayage (MEB) est un outil puissant qui permet d’effectuer une évaluation sans pareille de la topographie ultrastructurelle de spécimens. Le premier objectif de cette thèse est de comparer le MEB conventionnel (Hi-Vac) à une technologie plus récente, soit le MEB environnemental (ESEM), afin de déterminer si cette dernière mène à une évaluation supérieure des tissus capsulaires du sein. Le deuxième objectif est d‘appliquer la modalité de MEB supérieure et d’étudier les modifications ultrastructurelles des capsules périprothétiques chez les femmes subissant différents protocoles d’expansion de tissus dans le contexte de reconstruction mammaire prothétique. Deux études prospectives ont été réalisées afin de répondre à nos objectifs de recherche. Dix patientes ont été incluses dans la première, et 48 dans la seconde. La modalité Hi-Vac s’est avérée supérieure pour l’analyse compréhensive de tissus capsulaires mammaires. En employant le mode Hi-Vac dans notre protocole de recherche établi, un relief 3-D plus prononcé à été observé autour des expanseurs BIOCELL® dans le groupe d’approche d’intervention retardée (6 semaines). Des changements significatifs n’ont pas été observés au niveau des capsules SILTEX® dans les groupes d’approche d’intervention précoce (2 semaines) ni retardée.

Analyse du métabolisme du soufre de la bactérie autotrophique acidophile Acidithiobacillus thiooxidans ATCC 19377

Les impacts environnementaux dues à l'extraction minière sont considérables. C'est l'action des microorganismes, en utilisant leur métabolisme du soufre sur les déchets miniers, qui engendre les plus grands défis. Jusqu'à présent, peu de recherches ont été effectués sur les microorganismes environnementaux pour la compréhension globale de l'action du métabolisme du soufre dans une optique de prévention et de rémédiation des impacts environnementaux de l'extraction minière. Dans cette étude, nous avons étudié une bactérie environnementale, Acidithiobacillus thiooxidans, dans le but de comprendre le métabolisme du soufre selon le milieu de culture et le niveau d'acidité du milieu. Nous avons utilisé la transcriptomique à haut débit, RNA-seq, en association avec des techniques de biogéochimie et de microscopie à électrons pour déterminer l'expression des gènes codants les enzymes du métabolisme du soufre. Nous avons trouvé que l'expression des gènes des enzymes du métabolisme du soufre chez ce microorganisme sont dépendantes du milieu, de la phase de croissance et du niveau d'acidité présent dans le milieu. De plus, les analyses biogéochimiques montrent la présence de composés de soufre réduits et d'acide sulfurique dans le milieu. Finalement, une analyse par microscopie électronique révèle que la bactérie emmagasine des réserves de soufre dans son cytoplasme. Ces résultats permettent une meilleure compréhension de son métabolisme et nous rapprochent de la possibilité de développer une technique de prédiction des réactions ayant le potentiel de causer des impacts environnementaux dus à l'extraction minière.