Análise TG-ROC de testes de imunofluorescência no diagnóstico de leishmaniose visceral canina

OBJETIVO: Analisar a acurácia do diagnóstico de dois protocolos de imunofluorescência indireta para leishmaniose visceral canina. MÉTODOS: Cães provenientes de inquérito soroepidemiológico realizado em área endêmica nos municípios de Araçatuba e de Andradina, na região noroeste do estado de São Paulo, em 2003, e área não endêmica da região metropolitana de São Paulo, foram utilizados para avaliar comparativamente dois protocolos da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para leishmaniose: um utilizando antígeno heterólogo Leishmania major (RIFI-BM) e outro utilizando antígeno homólogo Leishmania chagasi (RIFI-CH). Para estimar acurácia utilizou-se a análise two-graph receiver operating characteristic (TG-ROC). A análise TG-ROC comparou as leituras da diluição 1:20 do antígeno homólogo (RIFI-CH), consideradas como teste referência, com as diluições da RIFI-BM (antígeno heterólogo). RESULTADOS: A diluição 1:20 do teste RIFI-CH apresentou o melhor coeficiente de contingência (0,755) e a maior força de associação entre as duas variáveis estudadas (qui-quadrado=124,3), sendo considerada a diluição-referência do teste nas comparações com as diferentes diluições do teste RIFI-BM. Os melhores resultados do RIFI-BM foram obtidos na diluição 1:40, com melhor coeficiente de contingência (0,680) e maior força de associação (qui-quadrado=80,8). Com a mudança do ponto de corte sugerido nesta análise para a diluição 1:40 da RIFI-BM, o valor do parâmetro especificidade aumentou de 57,5% para 97,7%, embora a diluição 1:80 tivesse apresentado a melhor estimativa para sensibilidade (80,2%) com o novo ponto de corte. CONCLUSÕES: A análise TG-ROC pode fornecer importantes informações sobre os testes de diagnósticos, além de apresentar sugestões sobre pontos de cortes que podem melhorar as estimativas de sensibilidade e especificidade do teste, e avaliá-los a luz do melhor custo-benefício.

Establishment of a protocol for obtention of neuronal stem cells lineages from the dog olfactory epithelium

A morphological and cell culture study from nasal mucosa of dogs was performed in order to establish a protocol to obtain a cell population committed to neuronal lineage, as a proposal for the treatment of traumatic and degenerative lesions in these animals, so that in the future these results could be applied to the human species. Twelve mongrel dogs of 60-day aged pregnancy were collected from urban pound dogs in São Paulo. Tissue from cribriform ethmoidal lamina of the fetuses was collected at necropsy under sterile conditions around 1h to 2h postmortem by uterine sections and sections from the fetal regions described above. Isolated cells of this tissue were added in DMEM/F-12 medium under standard conditions of incubation (5% CO², >37ºC). Cell culture based on isolated cells from biopsies of the olfactory epithelium showed rapid growth when cultured for 24 hours, showing phase-bright sphere cells found floating around the fragments, attached on culture flasks. After 20 days, a specific type of cells, predominantly ellipsoids or fusiform cells was characterized in vitro. The indirect immunofluorescence examination showed cells expressing markers of neuronal precursors (GFAP, neurofilament, oligodendrocyte, and III â-tubulin). The cell proliferation index showed Ki67 immunostaining with a trend to label cell groups throughout the apical region, while PCNA immunostaining label predominantly cell groups lying above the basal lamina. The transmission electron microscopy from the olfactory epithelium of dogs revealed cells with electron-dense cytoplasm and preserving the same distribution as those of positive cell staining for PCNA. Metabolic activity was confirmed by presence of euchromatin in the greatest part of cells. All these aspects give subsidies to support the hypothesis about resident progenitor cells among the basal cells of the olfactory epithelium, committed to renewal of these cell populations, especially neurons.

Remyelination in experimentally demyelinated connexin 32 KnockOut mice

The aim of this study was to evaluate the role of connexin 32 (Cx 32) during remyelination of the peripheral nervous system, through a local injection of either 0,1% ethidium bromide solution or saline in the sciatic nerve of Cx 32 knockout mice. Euthanasia was performed ranging from 1, 2, 3, 7, 15, 21 to 30 days after injection. Histochemical, immunohistochemical, immunofluorescence and transmission electron microscopical techniques were used to analyze the development of the lesions. Within the sciatic nerves, Schwann cells initially showed signs of intoxication and rejected their sheaths; after seven days, some thin newly formed myelin sheaths with uneven compactness and redundant loops (tomacula) were conspicuous. We concluded that the regeneration of lost myelin sheaths within the PNS followed the pattern already reported for this model in other laboratory species. Therefore, these results suggest that absence of Cx 32 did not interfere with the normal pattern of remyelination in this model in young mice.

Imunofluorescência para neuropeptídeos na mucosa nasal humana: avaliação de técnica para peptídeo intestinal vasoativo (VIP)

Os neuropeptídeos são neurotransmissores relevantes na fisiologia nasal e o conhecimento crescente acerca de seu papel na fisiopatologia de doenças nasais abre novas perspectivas. A sua investigação na mucosa nasal humana baseia-se em grande parte em marcação imunológica, método complexo e sujeito a inúmeros fatores de erro. Com o intuito de viabilizar este tipo de pesquisa em nosso meio, um método de imunofluorescência para peptídeo intestinal vasoativo (VIP) na mucosa nasal humana é proposto e avaliado. FORMA DE ESTUDO: Coorte transversal. MATERIAL E MÉTODO: Oito pacientes submetidos a cirurgia funcional do nariz têm um fragmento de mucosa coletado da concha inferior. O tecido foi fixado em solução de Zamboni (paraformaldeído 4% tamponado e ácido pícrico 0,4%), congelado em nitrogênio líquido e armazenado. Cortes de 14 µm foram realizados e submetidos à reação de imunofluorescência para VIP (Península Laboratories). As imagens microscópicas foram documentadas em fotografia convencional. A especificidade, sensibilidade e reprodutibilidade de execução foram avaliadas. A reprodutibilidade de interpretação de resultados foi avaliada através da comparação de graus de marcação (0 a 4) atribuídos às fotos por seis observadores. RESULTADOS: Os resultados mostraram ser o método suficientemente específico, sensível, além de reprodutível em sua execução. A interpretação de resultados mostrou depender do perfeito esclarecimento do observador no julgamento das imagens de imunofluorescência, mas mostrou uniformidade. CONCLUSÃO: O método proposto foi considerado útil na pesquisa de neuropeptídeos na mucosa nasal humana.

Otoproteção da amifostina aos efeitos ototóxicos da cisplatina: estudo em cobaias albinas por emissões otoacústicas produtos de distorção e microscopia eletrônica de varredura

A Cisplatina é uma potente droga antineoplásica, largamente utilizada para o tratamento do câncer, tanto em adultos quanto em crianças. Dentre seus efeitos colaterais, a ototoxicidade se apresenta como um dos mais importantes e leva à perda auditiva irreversível, bilateral, para as altas freqüências (4KHz -8KHz). Estudos têm tentado identificar drogas que, associadas à cisplatina, possam atuar como otoprotetores. Sabe-se que o mecanismo da ototoxicidade pela cisplatina está relacionado a alterações nos mecanismos antioxidantes das células ciliadas, principalmente as células ciliadas externas da cóclea. A amifostina tem conhecida ação antioxidante, com conhecido efeito otoprotetor aos efeitos lesivos da radioterapia. OBJETIVO: Nossa proposta foi avaliar através de emissões otoacústicas, por produtos de distorção (EOAPD) e por microscopia eletrônica de varredura (MEV), a existência de possível efeito otoprotetor da amifostina no tratamento com cisplatina. FORMA DE ESTUDO: Experimental. MATERIAL E MÉTODO: O estudo foi realizado em cobaias albinas, que foram divididas em três grupos: Grupo 1: 6 animais -12 orelhas - cisplatina 8,0 mg/Kg/dia (via intraperitoneal) por três dias; Grupo 2: 6 animais - 12 orelhas - amifostina 100 mg/Kg/ dia (via intraperitoneal) e 90 minutos após, cisplatina 8,0 mg/Kg/dia (via intraperitoneal) por três dias; Grupo 3: 03 animais - 06 orelhas - amifostina 100 mg/Kg/dia (via intraperitoneal) por três dias. RESULTADO: Encontramos EOAPD presentes e células ciliadas externas presentes, sem lesão anatômica a MEV, nos grupos 2 e 3. Concluímos que a amifostina, por sua ação antioxidante, atua como otoprotetor a ototoxicidade pela cisplatina. No entanto, seu uso não é recomendável nos casos de tumores potencialmente curáveis, por não se saber exatamente a influência da cisplatina na eficácia da quimioterapia.

Papilomatose laríngea: análise morfológica pela microscopia de luz e eletrônica do HPV-6

Papilomatose laríngea é neoplasia benigna mais freqüente nas crianças, causada pelo HPV, principalmente subtipos 6 e 11 e caracteriza-se pela presença de lesões proliferativas exofíticas e recidivantes sobre a mucosa das vias aérea, em especial na laringe. Forma de Estudo: Clínico prospectivo. OBJETIVOS: Demonstrar alterações epiteliais morfológicas (pela microscopia de luz e eletrônica) em lesões papilíferas casadas pelo HPV-6. MATERIAL E MÉTODOS: Fragmentos de lesões de papilomatose laríngea, colhidos durante procedimento cirúrgico de quatro crianças (1 masculino, 3 femininas), foram submetidos à tipagem do HPV (por método de PCR), análise pela microscopia de luz e microscopia eletrônica (varredura e transmissão). RESULTADOS: Na tipagem, todos os papilomas eram do subtipo 6. A microscopia de varredura identificou projeções epiteliais de vários tamanhos, com células superficiais em descamação. A microscopia de luz demonstrou lesões exofíticas, revestidas por epitélio hiperplásico com coilócitos e binucleações, característicos do HPV. A membrana basal e o córion adjacente estavam íntegros. À microscopia eletrônica de transmissão identificou-se vacuolização perinuclear e alargamento das junções intercelulares. CONCLUSÕES: As alterações morfológicas apresentadas pelo HPV-6 demonstram o caráter não-invasivo da lesão, sendo necessário estudos morfológicos adicionais relacionando os outros tipos de HPV, considerados mais agressivos, com os achados ultra-estruturais.

Aspectos clínicos, histológicos e de microscopia eletrônica dos granulomas de intubação das pregas vocais

Granulomas são lesões bilaterais e pediculadas das apófises vocais. Etiologias: intubação, refluxo, traumatismos, fonotraumatismo e idiopática. OBJETIVO: Analisar aspectos clínicos e morfológicos dos granulomas de intubação. MATERIAL E MÉTODOS: Estudo retrospectivo dos pacientes submetidos à microcirurgia por granulomas de intubação, atendidos na Instituição onde foi realizado, a partir de 2002. Analisaram-se: idade, sexo, indicação e tempo da intubação, sintomas, laudos de videolaringoscopia e número de biópsia. Realizou-se estudo histológico em todos os casos e de microscopia eletrônica em três deles. RESULTADOS: 10 pacientes (7 F e 3 M), idade entre 2 anos e 72 anos e tempo de intubação entre 4 horas e 21 dias. Rouquidão foi o principal sintoma. A histologia mostrou hiperplasia epitelial, intenso inflamação importante no corion e proliferação vascular. Na MEV observou-se epitélio escamoso com escassa descamação. À MET, junções intercelulares alargadas e desmossomos alterados. No corion havia lagos sanguíneos, intensa inflamação, e fibroblastos com alterações estruturais como núcleos irregulares e cisternas dilatadas. CONCLUSÕES: Granulomas pós-intubação aparecem em qualquer idade, mesmo em intubação por curto período, e causam rouquidão precocemente. As principais alterações morfológicas são observadas no corion, como proliferação vascular, inflamação e alterações estruturais em fibroblastos indicando disfunção e dano celular.

Identificação de cepas de Escherichia coli enteropatogênicas em amostras de fezes, por reação de imunofluorescência direta

Foi realizado diagnóstico etiológico de casos de diarréia aguda em 121 pacientes internados na Clínica Pediátrica do Hospital da Santa Casa de São Paulo, Brasil. Foram utilizados os métodos bacteriológico clássico e de reação de imunofluorescência direta para a identificação de cepas de Escherichia coli enteropatogênicas: para estudo da sensibilidade das cepas de Escherichia coli isoladas, a diferentes antibióticos, foi usado o método de Concentração Inibitória Minima (CIM). Dos 56 casos positivos, 89,3% correspondiam a diferentes sorotipos enteropatogênicos de Escherichia coli, quando utilizada a técnica de imunofluorescência direta. O método bacteriológico clássico revelou ainda, nos 121 casos examinados, 4 cepas de Salmonella e 2 de Shigella. No estudo da CIM verificou-se maior sensibilidade das cepas de Escherichia coli enteropatogênicas estudadas à Gentamicina e Amikacina, do que aos outros antibióticos.

Diagnóstico da esquistossomose mansônica mediante técnica de imunofluorescência com esporocistos em tecidos de planorbídeos

Propõe-se uma técnica de imunofluorescência para diagnóstico da esquistossomose mansônica, adotando-se tecidos de Biomphalaria glabrata contendo esporocistos secundários de Schistosoma mansoni. A reação de imunofluorescência indireta é executada sobre cortes histológicos preparados por inclusão em parafina.

Análise de exames de imunofluorescência direta para o diagnóstico de tracoma

Para confirmação de foco de tracoma em locais onde não existiam casos anteriormente relatados, a Secretaria de Estado da Saúde preconiza a realização de exames laboratoriais principalmente pelo fato da doença ter sido considerada erradicada no Estado de São Paulo, Brasil, na década de 70. Foram colhidas, durante investigações epidemiológicas, lâminas de raspado conjuntival de indivíduos com diagnóstico clínico de tracoma inflamatório (TF/TI). Analisaram-se os resultados dos exames laboratoriais por imunofluorescência direta (IFD), quanto à freqüência de exames adequados para análise e sua positividade segundo a quantidade de corpúsculos elementares (EBs) encontrados (sensibilidade do teste). Foram estudadas 385 lâminas, sendo que 241 (62,6%) foram consideradas adequadas para análise. Considerando-se o critério de positividade de 5 ou + EBs, a sensibilidade do teste foi de 19,9%. O teste de IFD apesar de ser o melhor teste laboratorial para ser utilizado em trabalhos de campo, não apresenta sensibilidade suficiente para confirmar todos os casos clínicos diagnosticados de tracoma, mas pode confirmar a circulação do agente etiológico em uma comunidade. Portanto, em zonas endêmicas o diagnóstico clínico de tracoma continua sendo o critério para confirmação de casos.

Microscopia eletrônica de varredura de ovos de Haemagogus leucocelaenus (Diptera: Culicidae)

OBJETIVO: Observar detalhes morfológicos de ovos de Haemagogus leucocelaenus visualizados pela primeira vez por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e realizar morfometria das principais estruturas. MÉTODOS: Foram utilizados ovos de Hg. leucocelaenus provenientes de fêmeas capturadas na Reserva Biológica do Tinguá, RJ, sendo parte destinada à eclosão e outra ao processamento de MEV, dos quais três foram submetidos à análise morfométrica. O material foi fixado em glutaraldeído 2,5% e pós-fixado em tetróxido de ósmio 1%, ambos em tampão cacodilato de sódio 0.1M, pH 7.2, processado e observado ao MEV Jeol 5310. Medições foram realizadas com o auxílio do software de análise Semafore. RESULTADOS: Os ovos apresentaram contorno elíptico com aproximadamente 574 µm de comprimento e 169 µm de largura, sendo o índice do ovo (l/wratio) 3,39 µm. O exocório é extremamente regular, possuindo ornamentação hexagonal e algumas vezes pentagonal. Nas células coriônicas, observaram-se tubérculos simetricamente dispostos com relação ao eixo longitudinal, e, no interior delas, tubérculos menores, individualizados, dispostos na periferia, e poucos agrupados no centro. A superfície do retículo coriônico não apresentou rugosidades. O aparelho micropilar apresenta colar proeminente, contínuo, com disco micropilar bem evidente. CONCLUSÕES: A ornamentação do exocório apresenta diferenças em relação aos tubérculos das células coriônicas e ao retículo coriônico externo entre os ovos de Hg. leucocelaenus comparados aos ovos de Hg. janthinomys e Hg. equinus, bem como com relação aos de Aedes aegypti, Ae. albopictus e Ae bahamensis.

Análise TG-ROC de testes de imunofluorescência no diagnóstico de leishmaniose visceral canina

OBJETIVO: Analisar a acurácia do diagnóstico de dois protocolos de imunofluorescência indireta para leishmaniose visceral canina. MÉTODOS: Cães provenientes de inquérito soroepidemiológico realizado em área endêmica nos municípios de Araçatuba e de Andradina, na região noroeste do estado de São Paulo, em 2003, e área não endêmica da região metropolitana de São Paulo, foram utilizados para avaliar comparativamente dois protocolos da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para leishmaniose: um utilizando antígeno heterólogo Leishmania major (RIFI-BM) e outro utilizando antígeno homólogo Leishmania chagasi (RIFI-CH). Para estimar acurácia utilizou-se a análise two-graph receiver operating characteristic (TG-ROC). A análise TG-ROC comparou as leituras da diluição 1:20 do antígeno homólogo (RIFI-CH), consideradas como teste referência, com as diluições da RIFI-BM (antígeno heterólogo). RESULTADOS: A diluição 1:20 do teste RIFI-CH apresentou o melhor coeficiente de contingência (0,755) e a maior força de associação entre as duas variáveis estudadas (qui-quadrado=124,3), sendo considerada a diluição-referência do teste nas comparações com as diferentes diluições do teste RIFI-BM. Os melhores resultados do RIFI-BM foram obtidos na diluição 1:40, com melhor coeficiente de contingência (0,680) e maior força de associação (qui-quadrado=80,8). Com a mudança do ponto de corte sugerido nesta análise para a diluição 1:40 da RIFI-BM, o valor do parâmetro especificidade aumentou de 57,5% para 97,7%, embora a diluição 1:80 tivesse apresentado a melhor estimativa para sensibilidade (80,2%) com o novo ponto de corte. CONCLUSÕES: A análise TG-ROC pode fornecer importantes informações sobre os testes de diagnósticos, além de apresentar sugestões sobre pontos de cortes que podem melhorar as estimativas de sensibilidade e especificidade do teste, e avaliá-los a luz do melhor custo-benefício.

“Papel dos recetores purinérgicos no crescimento e temodelação do tecido cavernoso”

A adenosina é um nucleósido ubíquo envolvido na regulação de controlo do tónus vascular do tecido cavernoso, desempenhando um papel importante na fisiopatologia da Disfunção Erétil (DE) resistente aos fármacos relaxantes musculares clássicos. Apesar da importância comprovada dos recetores da adenosina na fisiopatologia da DE no homem, pouca informação é conhecida no que diz respeito à expressão e localização dos recetores purinérgicos no Tecido Cavernoso de Ratazana (TCR). Neste trabalho avaliou-se o fenótipo dos recetores purinérgicos responsáveis pela regulação do tónus do tecido erétil de ratazana por imunofluorescência indireta aplicada à microscopia confocal em co-culturas de células endoteliais e musculares lisas do TCR. Para além da caracterização imunofenotípica, desenvolveu-se uma técnica que permite diferenciar funcionalmente em tempo real (por microscopia confocal funcional) células musculares lisas e células endoteliais isoladas de TCR em co-cultura marcadas com a sonda fluorescente Fluo-4NW. Esta técnica permite distinguir cada um dos subtipos celulares mediante o padrão e a magnitude das oscilações dos níveis intracelulares de Ca2+ ([Ca2+]i) em resposta ao ATP (agonista P2) e à fenilefrina (PE, agonista α-adrenérgico). Nas células musculares lisas, observou-se uma resposta mais acentuada ao agonista α-adrenérgico, PE, e uma resposta menos significativa ao ATP. O contrário foi observado relativamente às células endoteliais. A incubação das células musculares lisas e endoteliais com ATP (300 μM) causou um aumento dos níveis de [Ca2+]i. O efeito do ATP (300 μM) parece envolver a ativação de recetores dos subtipos P2X1 e P2X3 sensíveis ao bloqueio com NF023 (3μM) e A317491 (100 nM), respetivamente. Já o aumento dos níveis [Ca2+]i produzido pelo ADP (300 μM) parece envolver a ativação de recetores P2Y1, P2Y12 e P2Y13 mediante o antagonismo produzido pelos antagonistas MRS 2179 (0,3μM), AR-C66096 (0,1 μM) e MRS 2211 (10μM), respetivamente. Os dois tipos celulares expressam imunorreatividade contra recetores A2A, A2B, P2X1, P2X3, P2Y1, P2Y12 e P2Y13.

Desenvolvimento de um método de análise quantitativa de concentração celular e PHB por microscopia de fluorescência e análise de imagem

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Bioquímica

Placentite chagásica apresentação de um caso com estudo à microscopia óptica e eletrônica

Novo caso de placentite chagásica no Triângulo Mineiro, observou-se, à mioroscopia óptica, o parasitismo de miócitos das paredes vasculares, fato não descrito anteriormente na literatura. O estudo à microscopia eletrônica revelou. (1) abundantes amastigotas do Trypanosoma cruzi em células de Hofbauer; (2) proliferação fibroblástica e colágena na parede de pequenas artérias e arteríolas, ocluindo-lhes, por vezes, o lume; (3) parasitas em células musculares degeneradas e fibroblastos da parede vascular. Este é o primeiro relato de placentite chagásica humana com análise ultra-estrutural.