Efeito do FGF10 na maturação oocitária e produção de embriões bovinos in vitro

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Efeitos da demecolcina na cinética de maturação, microtúbulos e na enucleação química de oócitos bovinos

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Maturação nuclear de ovócitos de cadelas em estro e anestro submetidos à maturação in vitro

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Investigação da mutagenicidade do azocorante comercial BDCP (Black Dye Commercial Product), antes e após tratamento microbiano, utilizando o sistema teste de Allium cepa

Pós-graduação em Ciências Biológicas (Biologia Celular e Molecular) - IBRC

Análise citogenética clássica e molecular em Chelonoidis carbonaria e Phrynops geoffroanus (Testudines)

Pós-graduação em Genética - IBILCE

Ativação partenogenética de oócitos maturados in vitro de Cebus apella

O objetivo deste trabalho foi avaliar a maturação oocitária in vitro (MIV) na espécie C. apella, relacionando com a expansão das células do cumulus e promovendo a produção in vitro de embriões (PIVE), por meio da ativação partenogenética e fecundação in vitro (FIV). Os oócitos puncionados dos folículos antrais medindo 2-9 mm de diâmetro foram classificados em desnudos (OD), com poucas células do cumulus (PCC) e complexo cumulus-oophorus intacto (CCO intacto). A expansão das células do cumulus foi analisada nos tempos de 0, 36 e 40 h de MIV e classificada em cinco categorias de expansão. A competência meiótica nos oócitos foi verificada pela extrusão do 1º corpúsculo polar (CP) após 40 h de MIV. Os oócitos foram divididos em 3 grupos para PIVE: grupo controle (FIV), ativação partenogenética utilizando 5 μM de ionomicina em associação com 2 mM de 6-DMAP ou em associação com 50 μM de roscovitina. Para a FIV, os espermatozóides obtidos do coágulo seminal, foram diluídos em água de coco em pó (ACP-118®) e submetidos ao resfriamento para serem levados posteriormente ao cultivo in vitro com os oócitos. O aumento no tempo da MIV e a presença de várias células do cumulus associadas aos oócitos proporcionaram maior expansão das células do cumulus, pois somente os CCO intactos alcançaram a expansão total em 40 h de MIV (p < 0,005). A presença das células do cumulus nos oócitos (PCC e CCO intactos) maturados in vitro por 40 h promoveu a competência meiótica (metáfase II) significamente mais elevada que os OD (p < 0,005). Após 6 h de resfriamento em ACP-118® e separação pelo método do swin-up, os espermatozóides utilizados na FIV possuíam 80% de motilidade e vigor 4. O tratamento com ionomicina/roscovitina promoveu a extrusão do 2º CP e formação pronuclear e com ionomicina/6-DMAP formou pronúcleos, sem extrusão do 2º CP. O protocolo utilizando a ionomicina/6-DMAP e da FIV originou as primeiras divisões embrionárias, observada pela taxa de clivagem. Os resultados encontrados sugerem que em C. apella a presença e a expansão total das células do cumulus estão relacionadas com a competência oocitária. A utilização dos oócitos maturados in vitro e dos espermatozóides diluídos e resfriados em ACP-118® promoveu a PIVE por diferentes métodos nesta espécie.

Interação núcleo-citoplasmática em embriões e expressão de genes imprinted em fetos bovinos produzidos in vivo, in vitro e partenogenéticos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Influência da sazonalidade e da condição ovariana sobre a produção embrionária in vitro de gato doméstico (Felis catus, Linnaeus. 1758)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Análise das possíveis regiões organizadoras nucleolares e da atividade nucleolar em Triatoma melanocephalae T. lenti, importantes vetores da doença de Chagas

Triatoma melanocephalae T. lentisão espécies crípticas de triatomíneos pertencentes ao subcomplexo Brasiliensis. Esses organismos foram agrupados no subcomplexo apenas por caracteres morfológicos e pela disposição geográfica. Sendo assim, estudos citogenéticos são considerados como importantes ferramentas na classificação dos triatomíneos e, com isso, podem auxiliar na criação de um plano de profilaxia da doença. Por meio da técnica citogenética de impregnação por íons prata, foi possível visualizar a atividade nucleolar e as Regiões Organizadoras Nucleolares (RONs) desses insetos. T. melanocephalaapresentou três RONs ativas nos autossomos durante a prófase I. T. lenti apresentou duas RONs ativas nos autossomos durante a prófase I e a metáfase I. Ambas as espécies apresentaram o fenômeno de persistência do material nucleolar encontrado em triatomíneos. Sendo assim, por meio da análise das RONs, foi possível observar que T. lenti, quando comparado com os outros organismos do subcomplexo, apresentou marcações semelhantes à T. tibiamaculata e que T. melanocephalanão apresenta nenhuma relação direta com o subcomplexo. Palavras-chave: Citogenética. Taxonomia. Triatominae. Subcomplexo Brasiliensis. ABSTRACT Analysis of nucleolus organizer regions and nucleolar activity in important vectors of Chagas disease (Triatoma melanocephala and T. lenti) Triatoma melanocephalaand T. lentiare important vectors of Chagas disease. These cryptic species of triatomines are grouped in the subcomplexbrasiliensisdue only to morphological characters and geographical distribution. Cytogenetic studies are important to the classification of insects and can assist in creating a disease prevention plan. The aim of the present study was to determine nucleolar activity and nucleolus organizer regions (NORs) in these insects using the cytogenetic method of silver ion impregnation. T. melanocephalaexhibited three active NORs in autosomes during prophase I. T. lentiexhibited two active NORs in autosomes during prophase I and metaphase I. Both species exhibit the persistent nucleolar material found in triatomines. The analysis of NORs in the present study revealed that T. lenti exhibited labeling similar to that found in T. tibiamaculata, which belongs to the subcomplex, whereas T. melanocephalashows no direct relationship with the subcomplex. Keywords: Cytogenetics. Taxonomy. Triatominae. Brasiliensissubcomplex.

Efeitos do fator de crescimento dos fibrobalstos 8 (FGF8) durante a maturação in vitro do complexo cumulus-oócito bovino

Pós-graduação em Ciências Biológicas (Farmacologia) - IBB

Efeitos da adição do IGF-1 ou IGF-LongR3 sobre aspectos celulares e moleculares de complexos cumulus-oócito durante a maturação oocitária in vitro em bovinos

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Efeito do fator de crescimento epidermal (EGF) na maturação in vitro de oócitos caninos

Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Oócitos aparentemente maduros injetados em telófase I apresentam piores resultados de reprodução assistida

OBJETIVO: Avaliar o estágio de maturação nuclear de oócitos com o primeiro corpúsculo polar (CP) visível de pacientes inférteis submetidas à estimulação ovariana para injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) e comparar os resultados da injeção intracitoplasmática de espermatozoide entre os oócitos em telófase I (TI) e metáfase II (MII), e entre aqueles em metáfase II com e sem fuso celular visível. MÉTODOS: Estudo prospectivo que incluiu 106 pacientes inférteis submetidas à injeção intracitoplasmática de espermatozoide. Foram incluídas pacientes com idade menor ou igual a 38 anos, hormônio folículo estimulante (FSH) basal menor que 10 mIU/mL e índice de massa corpórea (IMC) menor que 30 kg/m². Foram excluídas pacientes com doenças sistêmicas, com qualquer infecção ativa, tabagistas ou que fizeram uso de medicações hormonais e anti-inflamatórias hormonais e não hormonais nos últimos dois meses, previamente à programação para o procedimento de reprodução assistida. Os oócitos com extrusão do primeiro corpúsculo polar foram avaliados pela microscopia de polarização, imediatamente antes da realização da injeção intracitoplasmática de espermatozoide, e caracterizados quanto ao estágio de maturação nuclear (telófase I ou metáfase II). Os oócitos em metáfase II foram avaliados de acordo com a presença ou não do fuso meiótico. Foram analisadas as taxas de fertilização, clivagem e o número de embriões de boa qualidade no segundo dia (D2) de desenvolvimento. Os dados foram analisados comparativamente através do teste exato de Fisher. Em todas as análises foi considerado o nível de significância de 5% (p<0,05). RESULTADOS: O fuso meiótico de 516 oócitos foi visualizado através da microscopia de polarização. Dezessete dos 516 oócitos avaliados estavam em telófase I (3,3%) e 499 (96,7%) em metáfase II. Os oócitos injetados em telófase I apresentaram taxas de fertilização significativamente menores do que os injetados em metáfase II (53 e 78%, respectivamente) e não produziram nenhum embrião de boa qualidade no segundo dia. Comparando-se os oócitos com e sem fuso celular visível, não foi observada diferença significativa nos resultados de injeção intracitoplasmática de espermatozoide. CONCLUSÕES: Oócitos injetados em telófase I apresentaram menores taxas de fertilização quando comparados aos em metáfase II. É possível que a análise do estágio de maturação nuclear oocitária, por meio da microscopia de polarização, possa ser utilizada como fator de predição das taxas de fertilização pós-injeção intracitoplasmática de espermatozoide.

Análise invasiva e não invasiva do fuso meiótico de oócitos humanos obtidos de ciclos estimulados: dados preliminares

OBJETIVOS: Avaliar a concordância entre as técnicas de microscopia de polarização e microscopia confocal na avaliação do fuso meiótico de oócitos humanos maturados in vivo. MÉTODOS: Estudo prospectivo que avaliou oócitos com o primeiro corpúsculo polar extruído obtidos de mulheres inférteis submetidas à estimulação ovariana para realização de injeção intracitoplasmática de espermatozoide. Os oócitos com o primeiro corpúsculo polar extruído foram avaliados por meio da microscopia de polarização e, imediatamente após, foram fixados e corados para avaliação dos microtúbulos e cromatina pela microscopia confocal de alto desempenho. Foram comparadas as técnicas de microscopia de polarização e confocal, de acordo com a visualização ou não do fuso meiótico pela microscopia de polarização e a presença ou não de anomalias meióticas à análise pela microscopia confocal. Foram calculados os intervalos de confiança, o índice de Kappa e a concordância entre as metodologias, considerando a análise da microscopia de imunofluorescência como padrão-ouro para avaliação de normalidade do fuso e distribuição cromossômica oocitária. RESULTADOS: Observou-se que 72,7% dos oócitos em metáfase II com fuso celular não visível à polarização apresentaram anormalidades meióticas à análise confocal e que 55,6% dos oócitos em metáfase II com fuso celular visível à polarização apresentaram-se como oócitos anormais à análise confocal. Somente 44,4% dos oócitos com fuso celular visível à polarização apresentaram-se como normais à análise confocal. A concordância entre os métodos foi de 51,1% (Kappa: 0,11; IC95% -0,0958 - 0,319). CONCLUSÕES: A baixa concordância entre a microscopia de polarização e a confocal na avaliação do fuso meiótico oocitário sugere que a visualização do fuso meiótico de oócitos humanos em metáfase II pela microscopia de polarização tem limitado o valor preditivo de normalidade meiótica oocitária.

Isolation and characterization of mesenchymal stem cells derived from bovine Wharton's jelly and their potential for use in cloning by nuclear transfer.

RESUMO: A geleia de Wharton é uma fonte de células tronco mesenquimais (CTMs) que ainda não havia sido testada para a produção de embriões bovinos por transferência nuclear (TN). O objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar e testar as CTMs derivadas da geleia de Wharton para produção de embriões e gestações por transferência nuclear em bovinos. O cordão umbilical foi coletado durante o nascimento e as células derivadas da geleia de Wharton (CGWs) foram isoladas por explante e cultivadas em Dulbecco?s Modified Eagle Medium. Fibroblastos (FB) da pele foram isolados após 6 meses de vida. As análises morfológicas foram realizadas pelas microscopias de campo claro e eletrônica de varredura durante o cultivo celular. Caracterização fenotípica e genotípica por citometria de fluxo, imunocitoquímica, RT-PCR e indução da diferenciação em linhagens celulares foi realizada com as CGWs. No procedimento de TN, ovócitos no estágio de metáfase II foram enucleados usando micromanipuladores, fusionados com CGWs ou FB e então ativados artificialmente. Micrografias de microscopia de varredura revelaram que CGWs tiveram forma variada sob cultivo. Os marcadores mesenquimais de CTMs (CD29+, CD73+, CD90+ and CD105+) foram expressos em cultura de CGWs bovina, como evidenciado por citometria de fluxo, imunocitoquímica e RT-PCR. Quando induzidas, estas células diferenciaram-se em osteócitos, condrócitos e adipócitos. Após classificação, as CGWs foram utilizadas na TN. A taxa de formação de blastocistos por TN com CGWs no sétimo dia de cultivo foi de 25,80±0,03%, similar a produção de blastócitos por TN com fibroblastos de pele (19,00±0,07). Gestações foram obtidas e mostraram que CGWs constituem um novo tipo celular para ser usado na clonagem animal. ABSTRACT: Wharton?s jelly is a source of mesenchymal stem cells (MSCs) that had not yet been tested for bovine embryo production by nuclear transfer (NT). Thus, the objective of this study was to isolate, characterize and test MSCs derived from Wharton?s jelly for embryo and pregnancy production by NT in cattle. The umbilical cord was collected during calving and cells derived from Wharton?s jelly (WJCs) were isolated by explant and cultured in Dulbecco?s Modified Eagle Medium. Skin Fibroblasts (FB) were isolated after 6 months of life. Morphological analysis was performed by bright field and scanning electron microscopy (SEM) during cell culture. Phenotypic and genotypic characterization by flow cytometry, immunocytochemistry, RT-PCR and differentiation induction in cell lineages were performed for WJC. In the NT procedure, oocytes at the arrested metaphase II stage were enucleated using micromanipulators, fused with WJCs or FB and later activated artificially. SEM micrographs revealed that WJCs have variable shape under culture. Mesenchymal markers of MSCs (CD29+, CD73+, CD90+ and CD105+) were expressed in bovine-derived WJC cultures, as evidenced by flow cytometry, immunocytochemistry and RT-PCR. When induced, these cells differentiated into osteocytes, chondrocytes and adipocytes. After classification, the WJCs were used in NT. Blastocyst formation rate by NT with WJCs at day 7 was 25.80±0.03%, similar to blatocyst rate with NT using skin fibroblasts (19.00±0.07%). Pregnancies were obtained and showed that WJCs constitute a new cell type for use in animal cloning.