Development of novel microsatellites from Moniliophthora perniciosa, causal agent of the witches` broom disease of Theobroma cacao

Moniliophthora perniciosa is the causal agent of the witches` broom disease of cacao. Based on available genomic sequences, we identified 30 new microsatellite loci, which were analysed using 50 isolates from four populations sampled over a wide geographical area in Brazil, including three populations from the Amazon, the fungal putative centre of diversity, plus one from Bahia. Nine loci were polymorphic, with an average of 2.9 alleles per locus. The level of polymorphism observed was low, but these markers may allow the evaluation of pathogen diversity and the establishment of molecular standards for isolate fingerprinting to support cacao breeding.

A qualitative host-pathogen interaction in the Theobroma cacao-Moniliophthora perniciosa pathosystem

The aim of this study was to test whether resistance of clones of Theobroma cacao ( cocoa) varied between isolates of Moniliophthora (formerly Crinipellis) perniciosa, the cause of witches' broom disease. Developing buds of vegetatively propagated T. cacao grown in greenhouses in the UK were inoculated with 16 000 spores of M. perniciosa per meristem in water, under conditions where water condensed on the inoculated shoot for at least 12 h after inoculation. The proportion of successful inoculations varied between clones and was inversely correlated with time to symptom production or broom formation. A specific interaction was demonstrated among three single-spore isolates of M. perniciosa and the clone Scavina 6 (SCA 6) and a variety of susceptible clones. Isolates Castenhal-I and APC3 were equally likely to infect SCA 6 and the other clones, but isolate Gran Couva A9 never infected SCA 6, although it was as virulent on the other clones. The interaction was maintained when the wetness period was extended to 70 h. Offspring of SCA 6 x Amelonado matings were all susceptible to both Castenhal-I and GC-A5, with no evidence of greater variability in susceptibility to GC-A5 than Castanhal-I. This suggests recessive inheritance of a single homozygous factor conferring resistance to GC-A5, from SCA 6. The progenies were slightly more susceptible to Castanhal-I than GC-A5. The implications for managing the disease are discussed.

The mitochondrial genome of the phytopathogenic basidiomycete Moniliophthora perniciosa is 109 kb in size and contains a stable integrated plasmid

We present here the sequence of the mitochondrial genome of the basidiomycete phytopathogenic hemibiotrophic fungus Moniliophthora perniciosa, causal agent of the Witches` Broom Disease in Theobroma cacao. The DNA is a circular molecule of 109103 base pairs, with 31.9 % GC, and is the largest sequenced so far. This size is due essentially to the presence of numerous non-conserved hypothetical ORFs. It contains the 14 genes coding for proteins involved in the oxidative phosphorylation, the two rRNA genes, one ORF coding for a ribosomal protein (rps3), and a set of 26 tRNA genes that recognize codons for all amino acids. Seven homing endonucleases are located inside introns. Except atp8, all conserved known genes are in the same orientation. Phylogenetic analysis based on the cox genes agrees with the commonly accepted fungal taxonomy. An uncommon feature of this mitochondrial genome is the presence of a region that contains a set of four, relatively small, nested, inverted repeats enclosing two genes coding for polymerases with an invertron-type structure and three conserved hypothetical genes interpreted as the stable integration of a mitochondrial linear plasmid. The integration of this plasmid seems to be a recent evolutionary event that could have implications in fungal biology. This sequence is available under GenBank accession number AY376688. (c) 2008 The British Mycological Society. Published by Elsevier Ltd. All rights reserved.

Differential gene expression between the biotrophic-like and saprotrophic mycelia of the witches` broom pathogen Moniliophthora perniciosa

Moniliophthora perniciosa is a hemibiotrophic fungus that causes witches` broom disease (WBD) in cacao. Marked dimorphism characterizes this fungus, showing a monokaryotic or biotrophic phase that causes disease symptoms and a later dikaryotic or saprotrophic phase. A combined strategy of DNA microarray, expressed sequence tag, and real-time reverse-transcriptase polymerase chain reaction analyses was employed to analyze differences between these two fungal stages in vitro. In all, 1,131 putative genes were hybridized with cDNA from different phases, resulting in 189 differentially expressed genes, and 4,595 reads were clusterized, producing 1,534 unigenes. The analysis of these genes, which represent approximately 21% of the total genes, indicates that the biotrophic-like phase undergoes carbon and nitrogen catabollite repression that correlates to the expression of phytopathogenicity genes. Moreover, downregulation of mitochondrial oxidative phosphorylation and the presence of a putative ngr1 of Saccharomyces cerevisiae could help explain its lower growth rate. In contrast, the saprotrophic mycelium expresses genes related to the metabolism of hexoses, ammonia, and oxidative phosphorylation, which could explain its faster growth. Antifungal toxins were upregulated and could prevent the colonization by competing fungi. This work significantly contributes to our understanding of the molecular mechanisms of WBD and, to our knowledge, is the first to analyze differential gene expression of the different phases of a hemibiotrophic fungus.

Effect of acibenzolar-S-methyl and Saccharomyces cerevisiae on the activation of Eucalyptus defences against rust

Tree defence mechanisms against the fungus Puccinia psidii were examined by comparing the activities of defence-related enzymes (chitinase, peroxidase and phenylalanine ammonia-lyase) of two Eucalyptus grandis x E. urophylla (urograndis) hybrids, previously classified as either susceptible to rust (VR hybrid) or moderately resistant to rust (C0 hybrid). Furthermore, the potential of disease control by artificial activation of host defences using either acibenzolar-S-methyl (ASM) or Saccharomyces cerevisiae extract was also investigated. Greenhouse inoculation trials revealed that the C0 hybrid had lower disease severity than the VR hybrid but following foliar applications of either ASM or S. cerevisiae extract treatment, disease severity (evaluated at 15 days after inoculation) was reduced in both hybrids. This enhanced resistance was associated with the induction of a hypersensitive reaction which appeared to be effective in controlling rust in both clones. The activity of all enzymes differed between clones and inducer treatment. The role of the defence-related enzymes in imparting resistance to eucalypt hybrids against rust is discussed.

Genetic structure of a population of Ganoderma boninense on oil palm

Ganoderma boninense (the causal agent of basal stem rot of oil palm in Papua New Guinea) has a tetrapolar mating system with multiple alleles. Investigations into the population structure of G. boninense, using interfertility between isolates as a marker, revealed that the population on oil palm was comprised predominantly of genetically distinct individuals, although a number of isolates were found to share single mating alleles. No direct hereditary relationship was found between isolates on neighbouring or spatially separated diseased palms, indicating that outcrossing had probably occurred over several generations in the founder population prior to colonization of oil palm. In this study, a total of 81 A and 83 B mating type alleles (factors) were detected with 18 allelic repeats at the A locus and 17 at the B locus. Alleles appeared to be randomly dispersed throughout the population in each study block, although there was a significantly (P

Influência da vassoura de bruxa na fenologia do Cupuaçuzeiro

O cultivo do cupuaçuzeiro [Theobroma grandiflorum (Willd. ex Spreng.) Schum.] está em franca expansão na Amazônia brasileira. O principal fator limitante é a vassoura de bruxa, doença causada pela Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, cujo único controle econômico conhecido é a poda fitossanitária. A fenologia de dez cupuaçuzeiros em monocultivo, em solo Latossolo Amarelo distrófico adubado na região de Manaus, AM, foi avaliada de maio 1987 a dezembro 1990. O número de flores foi reduzido pela vassoura e pela poda, mas a duração e periodicidade da floração não foram muito afetadas. O número médio de frutos por planta caiu de 36 em 1987 para 6 em 1989, afetado pela vassoura e pela poda, tendo recuperado para 15 em 1990. A frutificação foi antecipada e sua duração reduzida em comparação ao estudo anterior, possivelmente devido à adubação e/ou ao genótipo estudado. O vingamento caiu de 1,4% em 1987 para 0,5% em 1989 e aumentou para 1,8% em 1990, sugerindo a recuperação das plantas. A brotação foliar e queda das folhas aumentaram marcadamente como resultado da influência da vassoura de bruxa em 1988 e foram reduzidas pela poda no período de 1989-90. Os fenofases não foram muito afetados pela vassoura de bruxa embora o número de flores e frutos tenham sido.

Calogênese do híbrido Theobroma grandiflorum x T. obovatum (Sterculiaceae)

O declínio da cacauicultura na amazônia tem sido causado pela doença vassoura-de-bruxa (Crinipellis perniciosa). Um híbrido interespecífico do mesmo gênero (Theobroma grandiflorum x T. obovatum) tem demonstrando resistência a esta doença. Avaliou-se a calogênese deste híbrido com a finalidade de sua propagação massiva. Os explantes usados (tegumento, cotilédone e embrião) foram postos para desenvolver em condições estéreis em meio de cultura LPm mais água de coco (50 ml/l), glucose (20 g/l), 2,4 - D (2 mg/l), Thidiazuron - TDZ nas concentrações de 0, 5 e 10 µg/l, carvão ativado (2 g/l) em gelrite (2 g/l) a um pH de 5,8. Cada concentração de TDZ x tipo de tecido foi considerado um tratamento. As culturas foram mantidas no escuro, à temperatura de 22 ± 2 ºC. Os tecidos não mostraram diferenças significativas quanto a proporção do explante recoberto por calos (p= 0,14) embora notou-se que nos cotilédones tenha sido maior. A dosagem de TDZ nitidamente não influenciou no recobrimento de calos (p= 0,94). Quanto a freqüência, os tecidos mostraram diferentes capacidades de desenvolver calos (p= 0,02) sem mostrar-se influenciados pela dosagem de TDZ (p = 0,66). Os explantes de cotilédones foram os que formaram calos em maior freqüência. Houve uma leve tendência de que quanto menor a dosagem de TDZ maior a freqüência de calos obtidos. Não foi constatada interação entre tipo de calo/frasco x dosagem de TDZ (p = 0,32).

Efeitos do fracionamento da adubação mineral, da adubação orgânica e da calagem na produtividade e incidência de vassoura-de-bruxa em cacaueiros da Amazônia

A resposta do cacaueiro à aplicação de micronutrientes, matéria orgânica, calcário e fracionamento da adubação foi determinada em dois experimentos, instalados em solos das unidades Terra Roxa estruturada eutrófica (TR) e Latossolo Amarelo (LA), no Estado do Pará, no período de 1988 a 1993. As lavouras de cacau do híbrido Sca 6 x Be 10 foram implantadas pelo sistema de derrubada total e queima da floresta primária, utilizando-se sombreamento provisório de bananeira (Musa spp.) e permanente de Erythrina poeppigiana ou Gmelina arborea. Os tratamentos foram distribuídos em blocos casualizados, com três repetições, sendo a parcela constituída de 20 plantas úteis. Os resultados de produção de cacau demonstraram que não houve interação significativa entre tratamentos e solos ou ano de condução do experimento. O fracionamento da adubação NPK em três aplicações/ano e a adubação NPK + Zn foram os melhores tratamentos, provocando incrementos (P < 0,05) na produtividade do cacaueiro da ordem de 27,5% e 10,9%, respectivamente. A menor incidência (P < 0,05) de frutos atacados pela enfermidade vassoura-de-bruxa, causada pelo fungo Crinipellis perniciosa, foi observada nos tratamentos em que se aplicaram uma mistura de micronutrientes (B, Cu, Zn, Fe e Mo) ou esterco de gado na dosagem de 5 t ha-1; as porcentagens de frutos doentes dos demais tratamentos não diferiram da adubação NPK (testemunha). Para o aumento da produtividade, a estratégia de adubação mais eficiente foi o fracionamento da adubação NPK (60 kg ha-1 de N, P(2)0(5) e K(2)0) em três aplicações ao ano. O efeito de micronutrientes e do esterco de gado na infecção da vassoura-de-bruxa merece ser investigado com mais atenção.

Aspectos epidemiológicos da vassoura-de-bruxa do cupuaçuzeiro na microrregião de Belém, PA

Foi conduzido experimento no campo da Embrapa-Centro de Pesquisa Agropecuária do Trópico Úmido, em Belém, PA (1°28' S; 48°27' W), de junho/91 a maio/94, com plantas de cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum (Willd. ex Spreng.) K. Schum.) com sete anos de idade, objetivando acompanhar o desenvolvimento de vassouras-de-bruxa vegetativas causadas por Crinipellis perniciosa ((Stahel) Singer), desde a sua emissão até a produção de basidiocarpos. Foram determinados coeficientes de correlação entre as variáveis epidemiológicas (emissão de vassouras, período verde, período de secamento, período pré-frutificativo, produção de basidiocarpos) e as variáveis climáticas (umidade relativa do ar máxima, brilho solar, precipitação pluvial). A emissão de vassouras vegetativas foi maior em julho e agosto. Estas permaneceram verdes por 34,9 a 65,2 dias e secaram entre 5,8 e 10 dias. Após sua emissão, as vassouras demoraram de 79,5 a 347 dias para iniciar a produção de basidiocarpos, que ocorreu principalmente a partir de maio, com pico em junho. As variáveis climáticas, umidade relativa do ar máxima e brilho solar, correlacionaram-se significativamente apenas com a produção de basidiocarpos, com efeito negativo e positivo, respectivamente.

Atividades de quitinase e beta-1,3-glucanase após eliciação das defesas do tomateiro contra a mancha-bacteriana

O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência de eliciadores biológicos e químicos sobre as atividades de duas proteínas relacionadas à patogênese (PR), quitinase e beta-1,3-glucanase, em folhas de tomateiro, e avaliar o potencial desses eliciadores na redução do progresso da mancha-foliar causada por Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Plantas de tomateiro da cultivar Santa Cruz Kada foram pulverizadas com: acibenzolar-S-metil (ASM; 0,2 g L-1); formulação biológica proveniente de biomassa cítrica, denominada Ecolife (5 mL L-1); suspensão de quitosana (MCp; 200 g L-1), proveniente de micélio de Crinipellis perniciosa; extrato aquoso de ramos de lobeira (Solanum lycocarpum) infectados por C. perniciosa (VLA; 300 g L-1). As plantas foram desafiadas com um isolado virulento da bactéria, quatro dias depois das pulverizações. Plantas pulverizadas com extratos biológicos mostraram redução da mancha-bacteriana. ASM proporcionou 49,3% de proteção, e foi igual à MCp e Ecolife e superior ao VLA. Este último não diferiu significativamente de MCp e Ecolife. Observou-se maior atividade das duas enzimas nas plantas tratadas, principalmente nas primeiras horas após as pulverizações.

Análise da curva de progresso temporal da vassoura-de-bruxa do cupuaçuzeiro

A evolução de lançamentos e de flores de cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum) com sintomas de vassoura-de-bruxa e a produção de basidiocarpos do patógeno (Crinipellis perniciosa) foram monitoradas em plantas enxertada e não-enxertadas de um campo experimental no município de Belém, PA. Modelos epidemiológicos (logístico, Gompertz, e as somas logístico + logístico e Gompertz + Gompertz) foram ajustados a curvas de progresso da doença bianuais (1993 e 1994 para incidência da doença em lançamentos e basidiocarpos produzidos nesses lançamentos) e anuais (1994), para incidência da doença em flores e basidiocarpos produzidos nessas flores. A soma de duas equações logísticas apresentou bom ajuste aos dados bianuais e o modelo logístico, aos dados anuais. O início da manifestação dos sintomas esteve, geralmente, associado ao período seco enquanto que a produção de basidiocarpos coincidiu com o período chuvoso. A maior emissão de vassouras-de-bruxa ocorreu de julho a outubro e a maior frutificação, entre maio e julho.

Hypocrea stromatica sp. nov. teleomorfo de Trichoderma stromaticum

Trichoderma stromaticum é um fungo antagonista a Crinipellis perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao). Estromas periteciais de Hypocrea sp. formaram-se sobre a superfície de frutos mumificados e vassouras secas de cacaueiros em áreas onde T. stromaticum tinha sido pulverizado, experimentalmente, no controle biológico de C. perniciosa. Ascósporos obtidos dos estromas de Hypocrea sp. originaram colônias idênticas às de T. stromaticum. DNA genômico de colônias provenientes de ascósporos desta Hypocrea sp., de conídios de T. stromaticum e de Fusarium sp. (controle negativo) foi extraído e amplificado com oito "primers" decâmeros para obtenção de marcadores RAPD. Observaram-se similaridades genéticas de 0,82 a 0,96 entre os isolados ascospóricos e conidiais com base nos marcadores RAPD e de 0,06 a 0,09 entre estes e o isolado de Fusarium sp. O teleomorfo de T. stromaticum é denominado H. stromatica Bezerra, Costa & Bastos sp. nov.

Caracterização de uma população de cacaueiro para mapeamento de genes de resistência à vassoura-de-bruxa e podridão-parda

O cacaueiro (Theobroma cacao) é alvo de diversas enfermidades, sendo que a podridão-parda, causada por Phytophthora spp. é a principal delas mundialmente. Entretanto, no Brasil, a vassoura-de-bruxa causada por Crinipellis perniciosa, é a mais devastadora. A busca de fontes de resistência às doenças é a etapa básica para programas de melhoramento genético e, nesse sentido, este estudo objetivou caracterizar quantitativamente uma progênie oriunda do cruzamento entre os clones SIC-864 e CCN-51, dois genótipos contrastantes para diversas características, inclusive para resistência à vassoura-de-bruxa e podridão-parda. Foram avaliados em condições de campo o número médio de frutos por planta por ano, porcentagem de frutos sadios, porcentagem de frutos com vassoura-de-bruxa, porcentagem de frutos com podridão-parda, número médio de vassouras vegetativas por planta por ano e número médio de vassouras de almofada floral por planta por ano, durante um período de quatro anos. As estatísticas descritivas da produtividade e da resistência a doenças foram calculadas considerando os valores máximo, médio e mínimo, o desvio padrão, o coeficiente de variação, e a distribuição da freqüência. O coeficiente de repetibilidade foi calculado para estimar a acurácia da variação fenotípica por efeitos ambientais pelos métodos da análise de variância, componentes principais e análise estrutural. Foi demonstrado o caráter segregante dessa progênie para resistência à vassoura-de-bruxa e à podridão-parda e para outras características, mostrando a utilidade da população para estudos de mapeamento genético utilizando marcadores moleculares, visando identificar genes de resistência e "quantitative trait loci" (QTLs) dissimilares dos encontrados no clone Scavina-6, tradicionalmente usado em programas de melhoramento genético do cacaueiro.

Efeito de extratos vegetais no progresso de doenças foliares do cafeeiro orgânico

Avaliou-se o efeito da aplicação de extratos vegetais em induzir resistência à ferrugem, à cercosporiose e à mancha de Phoma em cafeeiro orgânico. O ensaio foi instalado em lavoura orgânica em Santo Antônio do Amparo, MG, cultivada com cafeeiros cv. "Acaiá MG-474-19", de quatro anos. Utilizou-se o delineamento em blocos casualizados com quatro repetições. Os tratamentos foram: 1. Testemunha pulverizada com Viça-café plus® aplicado em dezembro, janeiro e fevereiro; 2. Testemunha pulverizada com água; 3. Extrato aquoso de casca de fruto de café (CFC); 4. Extrato aquoso de folha de café com ferrugem (EFID); 5. Extrato aquoso de lobeira (Solanum lycocarpum) infectada com Crinipellis perniciosa (VLA) e 6. Extrato comercial de biomassa cítrica (Ecolife®). Os cafeeiros foram pulverizados mensalmente de 4 de março a 26 de junho de 2005. CFC e EFID reduziram a incidência da ferrugem, da cercosporiose e da mancha de Phoma comparativamente aos percentuais de doença observados nas testemunhas pulverizadas com água e com Viça-café. CFC reduziu a severidade da cercosporiose em 47%, comparado ao tratamento pulverizado com água. EFID e VLA reduziram a severidade da ferrugem em 31 e 27%. O melhor resultado foi proporcionado pelo EFID ao reduzir em 61% a incidência de Phoma em relação à testemunha pulverizada com água. O produto Ecolife® teve um desempenho intermediário aos melhores tratamentos e às testemunhas. EFID, CFC e VLA levaram a maior acúmulo de lignina nos tecidos foliares, diferenciando-se das testemunhas.