海洋藻类功能性蛋白质的纯化、鉴定及其应用的研究

使用膨化柱和离子交换或羟基磷灰石柱层析相结合的方法，分别从多管藻、坛紫菜及钝顶螺旋藻中分离纯化了R-藻红蛋白溶液和C-藻蓝蛋白。光谱检测及电泳分析结果证明完全符合经典的藻胆蛋白纯度标准。彭化床最突出的优点是克服了常规分离方法堵塞色谱柱的难题，纯化速度快、产量高、不需要常规色谱方法所要求的填料的平衡及粗提液的预处理，仅需一步操作就可以得到满足一般食品添加剂纯度要求的藻胆蛋白，极大地简化了后续的纯化程序，减少了分离纯化的步骤和时间，而其产率及纯度均高于常规的藻胆蛋白分离方法。这同时也降低了藻胆蛋白分离纯化的成本。 本文通过戊二醛或环氧氯丙烷交联的方法，合成了四种壳聚糖-氨基酸共聚小球。并选取吸附性好的戊二醛交联孔球和戊二醛交联微球系统测定了其对R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白的吸附和缓释性能。 纯化了藓羽藻中与其细胞器团聚密切相关的一种凝集素并进行了部分性质的鉴定。N端前15个氨基酸序列及LC-ESI-MS质谱分析结果证明此凝集素属于一种新的蛋白质族。实验证明，凝血活性与细胞器团聚活性并不完全依赖于此凝集素分子相同的结构域。 通过异双功能试剂SPDP处理藓羽藻凝集素使之衍生化，DTT处理R-PE在其分子内引入外源巯基，然后将活化的R-藻红蛋白与凝集素进行交联反应。交联产物经凝胶过滤纯化并检测，但电泳及荧光显微镜检测结果并不能证明交联探针的成功制备。

Biochemical and Biotechnological Studies on the Cyanobacterium Synechocystis salina Wislouch

The group cyanobacteria includes a large number of organisms characterised by a low state of cellular organization. Their cells lack a well defined nucleus. Cell division is by division of the protoplast by an ingrowth of the septum. These organisms are characterised generally by a blue green colouration of the cell, the chief pigments being chlorophyll-a, carotenes, xanthophylls, C phycocyanin and C phycoerythrin. The product of photosynthesis is glycogen. These organisms lack flagellate reproductive bodies and there is a total lack of sexual reproduction. They are also unique because of the presence of murein in the place of cellulose (cell wall) and the absence of chloroplast, mitochondria and endoplasmic reticulum. Just like bacteria some of them possess Plasmids and can fix atmospheric nitrogen. In the present study growth kinetics, heavy metal tolerance, tolerance mechanisms, heavy metal intake, and antibacterial activity of §ynechocystics salina Wislouch - a nanoplanktonic, euryhaline, Cyanobacterium present in Cochin back waters has been carried out for the potential biotechnological application of this organism. _§; salina occur as small spherical cells of 3n diameter (sometimes in pairs) with bluish green colour. The species is characterised by jerky movement of the cells and is structrually similar to other cyanobacteria

Purificação, modelagem e simulação da adsorção de bioprodutos por troca iônica em coluna de leito expandido

A produção de proteínas através de microrganismos tornou-se uma técnica muito importante na obtenção de compostos de interesse da indústria farmacêutica e alimentícia. Extratos brutos nos quais as proteínas são obtidas são geralmente complexos, contendo sólidos e células em suspensão. Usualmente, para uso industrial destes compostos, é necessário obtê-los puros, para garantir a sua atuação sem interferência. Um método que vem recebendo destaque especialmente nos últimos 10 anos é o uso da cromatografia de troca iônica em leito expandido, que combina em uma única etapa os passos de clarificação, concentração e purificação da molécula alvo, reduzindo assim o tempo de operação e também os custos com equipamentos para realização de cada etapa em separado. Combinado a este fato, a última década também é marcada por trabalhos que tratam da modelagem matemática do processo de adsorção de proteínas em resinas. Está técnica, além de fornecer informações importantes sobre o processo de adsorção, também é de grande valia na otimização da etapa de adsorção, uma vez que permite que simulações sejam feitas, sem a necessidade de gasto de tempo e material com experimentos em bancada, especialmente se é desejado uma ampliação de escala. Dessa forma, o objetivo desta tese foi realizar a modelagem e simulação do processo de adsorção de bioprodutos em um caldo bruto na presença de células, usando inulinase e C-ficocianina como objeto de estudo e purificar C-ficocianina utilizando resina de troca iônica em leito expandido. A presente tese foi então dividida em quatro artigos. O primeiro artigo teve como objeto de estudo a enzima inulinase, e a otimização da etapa de adsorção desta enzima em resina de troca iônica Streamline SP, em leito expandido, foi feita através da modelagem matemática e simulação das curvas de ruptura em três diferentes graus de expansão (GE). As máximas eficiências foram observadas quando utilizadas maiores concentrações de inulinase (120 a 170 U/mL), e altura de leito entre 20 e 30 cm. O grau de expansão de 3,0 vezes foi considerado o melhor, uma vez que a produtividade foi consideravelmente superior. O segundo artigo apresenta o estudo das condições de adsorção de C-ficocianina em resina de troca iônica, onde foi verificado o efeito do pH e temperatura na adsorção e após construída a isoterma de adsorção. A isoterma de adsorção da C-ficocianina em resina Streamline Q XL feita em pH 7,5 e a 25°C (ambiente), apresentou um bom ajuste ao modelo de Langmuir (R=0,98) e os valores qm (capacidade máxima de adsorção) e Kd (constante de equilíbrio) estimados pela equação linearizada da isoterma, foram de 26,7 mg/mL e 0,067mg/mL. O terceiro artigo aborda a modelagem do processo de adsorção de extrato não clarificado de C-ficocianina em resina de troca iônica Streamline Q XL em coluna de leito expandido. Três curvas de ruptura foram feitas em diferentes graus de expansão (2,0, 2,5 e 3,0). A condição de adsorção de extrato bruto não clarificado de C-ficocianina que se mostrou mais vantajosa, por apresentar maior capacidade de adsorção, é quando se alimenta o extrato até atingir 10% de saturação da resina, em grau de expansão 2,0, com uma altura inicial de leito de 30 cm. O último artigo originado nesta tese foi sobre a purificação de C-ficocianina através da cromatografia de troca iônica em leito expandido. Uma vez que a adsorção já havia sido estudada no artigo 2, o artigo 4 enfoca na otimização das condições de eluição, visando obter um produto com máxima pureza e recuperação. A pureza é dada pela razão entre a absorbância a 620 nm pela absorbância a 280 nm, e dizse que quando C-ficocianina apresenta pureza superior a 0,7 ela pode ser usada em como corante em alimentos. A avaliação das curvas de contorno indicou que a faixa de trabalho deve ser em pH ao redor de 6,5 e volumes de eluição próximos a 150 mL. Tais condições combinadas a uma etapa de pré-eluição com 0,1M de NaCl, permitiu obter C-ficocianina com pureza de 2,9, concentração 3 mg/mL, e recuperação ao redor de 70%.

Produção e extração da enzima anidrase carbônica e de ficobiliproteínas a partir de microalgas

Muito interesse tem sido focado no potencial biotecnológico das microalgas, principalmente devido à identificação de diversas substâncias sintetizadas por estes organismos, dentre elas a anidrase carbônica e as ficobiliproteínas. A anidrase carbônica é uma metaloenzima que catalisa a hidratação reversível do CO2 em bicarbonato com alta eficiência, sendo utilizada para captação de CO2 através de sistemas biológicos. A C-ficocianina e a aloficocianina, corantes naturais, são os dois principais componentes das ficobiliproteínas em cianobactérias e apresentam diversas aplicações dentro da indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica. O objetivo principal desta tese foi avaliar a produção e a extração da anidrase carbônica e das ficobiliproteínas a partir de diferentes microalgas. Para isso, primeiramente foi realizado uma investigação da produção da anidrase carbônica pela microalga Dunaliella tertiolecta, onde foi estudada a extração da enzima e sua aplicação em sistemas de captura enzimática de CO2. Posteriormente foi avaliada a produção da enzima ao longo do cultivo de diferentes microalgas marinhas e dulcícolas (Dunaliella tertiolecta, Tetraselmis sueccica, Phaeodactylum tricornutum, Nannochloropsis oculata, Isochysis galbana, Chlorella vulgaris e Scenedesmus obliquus). A produção da enzima e de ficobiliproteínas, também, foi estudada para as cianobactérias Spirulina platensis LEB 52, Spirulina sp. LEB 18 e Synechococcus nidulans. Todos os cultivos foram acompanhados em termos de biomassa e pH. Por último, foi realizado um estudo de extração da enzima de P. tricornutum e extração conjunta da anidrase carbônica e de ficobiliproteínas da cianobactéria S. sp. LEB 18. Os cultivos foram realizados em frascos erlenmeyer contendo os meios Conway (marinhas), BG-11 (dulcícolas) e Zarrouk 20% (cianobactérias). Na avaliação da ruptura celular foram testadas as técnicas de maceração em gral e pistilo, agitação em vórtex com pérolas de vidro, sonicação com pérolas de vidro, homogeneizador ultrassônico, secagem, congelamento e descongelamento e a combinação de tratamentos. Maiores rendimentos de extração da enzima a partir da microalga D. tertiolecta foram obtidos utilizando tratamento ultrassônico, juntamente com baixas concentrações de biomassa úmida (0,1 e 0,2 g/L), e a mesma apresentou potencial para aplicação em processos de captação enzimática do CO2. Durante os cultivos, a microalga C. vulgaris se destacou como maior produtora da enzima anidrase carbônica, atingindo valores de atividade enzimática de 44,0 U/L. As cianobactérias apresentaram valores de atividade entre 41,6 e 45,9 U/L, sendo que a S. sp. LEB 18 foi a que apresentou maiores produções de C-ficocianina e aloficocianina no ponto de máxima atividade volumétrica, 65,9 e 82,2 µg/mL, respectivamente. A enzima extraída da biomassa de S. platensis LEB 52 catalisou a hidratação do CO2 que precipitou na forma de CaCO3. Maiores rendimentos de extração da enzima a partir das microalgas P. tricornutum e S. sp. LEB 18 foram obtidos utilizando homogeneizador ultrassônico, que foram 31,3 U/g e 25,5 U/g, respectivamente. A biomassa de S. sp. LEB 18, também apresentou potencial para a extração de ficobiliproteínas, obtendo- se altas concentrações de C-ficocianina (100,5 mg/g) e aloficocianina (69,9 mg/g). Através dos resultados obtidos, pode-se verificar a potencialidade das microalgas e das cianobactérias para produção da enzima anidrase carbônica e das ficobiliproteínas, biomoléculas de alto valor industrial. Este trabalho apresenta processos eficientes para a extração da enzima e de ficobiliproteínas tanto para escala laboratorial como industrial.

Characterization of the artificially covalent conjugate of B-phycoerythrin and R-phycocyanin and the phycobilisome from Porphyridium cruentum

B-phycoerythrin (BPE) and R-phycocyanin (RPC) were purified from Porphyridium cruentum by Sephadex G-200 chromatography, then the BPE was attached covalently to the RPC by reacting their amino groups to form the artificially covalent BPE-RPC conjugate in which the excitation energy can transfer from the BPE to the RPC with low efficiency. Meanwhile, the intact phycobilisome (PBS) consisting of BPE, RPC, APC and L-CM was isolated and purified from Porphyridium cruentum, and the purified PBS was found to keep intact if the solution contains sucrose. Comparison of spectroscopic properties between the purified PBS and the BPE-RPC conjugate suggests that the BPE-RPC conjugate is much more stable than the purified PBS. The construction of BPE-RPC conjugate with low efficiency of the excitation energy transfer may be useful for preparing phycobiliprotein probes. (C) 2002 Elsevier Science Ireland Ltd. All rights reserved.

Optimisation of Spirulina platensis convective drying: evaluation of phycocyanin loss and lipid oxidation

The aim of the study was the optimisation of Spirulina platensis drying on convective hot air through the response surface methodology. The responses were thiobarbituric acid (TBA) and phycocyanin loss percentage values in final product. Experiments were carried out in perforated tray drier with parallel air flow, and the wet samples thickness and drying air temperatures were in range of 3–7 mm and 50–70 °C, respectively. The statistical analysis showed significant effect (P < 0.05) for air temperature and samples thickness. In the best drying condition, 55 °C and 3.7 mm, presented the phycocyanin loss percentage and the TBA values of approximately 37% and 1.5 mgMDA kg−1, respectively. In this drying condition, the fatty acids composition of the microalgae Spirulina did not show significance difference (P > 0.05) in relation to fresh biomass. The lipid profile of dried product presented high percentage of polyunsaturated fatty acids (34.4%), especially the gamma-linolenic acid (20.6%).

Identifying programs to reduce road trauma to A.C.T. motorcyclists

A broad range of motorcycle safety programs and systems exist in Australia and New Zealand. These vary from statewide licensing and training systems run by government licensing and transport agencies to safety programs run in small communities and by individual rider groups. While the effectiveness of licensing and training has been reviewed and recommendations for improvement have been developed (e.g. Haworth & Mulvihill, 2005), little is known about many smaller or innovative programs, and their potential to improve motorcycle safety in the ACT.

Impacts of periodic tillage on soil C stocks : a synthesis

Long-term loss of soil C stocks under conventional tillage and accrual of soil C following adoption of no-tillage have been well documented. No-tillage use is spreading, but it is common to occasionally till within a no-till regime or to regularly alternate between till and no-till practices within a rotation of different crops. Short-term studies indicate that substantial amounts of C can be lost from the soil immediately following a tillage event, but there are few field studies that have investigated the impact of infrequent tillage on soil C stocks. How much of the C sequestered under no-tillage is likely to be lost if the soil is tilled? What are the longer-term impacts of continued infrequent no-tillage? If producers are to be compensated for sequestering C in soil following adoption of conservation tillage practices, the impacts of infrequent tillage need to be quantified. A few studies have examined the short-term impacts of tillage on soil C and several have investigated the impacts of adoption of continuous no-tillage. We present: (1) results from a modeling study carried out to address these questions more broadly than the published literature allows, (2) a review of the literature examining the short-term impacts of tillage on soil C, (3) a review of published studies on the physical impacts of tillage and (4) a synthesis of these components to assess how infrequent tillage impacts soil C stocks and how changes in tillage frequency could impact soil C stocks and C sequestration. Results indicate that soil C declines significantly following even one tillage event (1-11 % of soil C lost). Longer-term losses increase as frequency of tillage increases. Model analyses indicate that cultivating and ripping are less disruptive than moldboard plowing, and soil C for those treatments average just 6% less than continuous NT compared to 27% less for CT. Most (80%) of the soil C gains of NT can be realized with NT coupled with biannual cultivating or ripping. (C) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.