999 resultados para BIOLOGIA CELULAR
Resumo:
Dissertao apresentada para obteno do grau de Doutor em Biologia Celular pelo Instituto de Tecnologia Qumica e Biolgica da Universidade Nova de Lisboa
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Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obteno do Grau de Mestre em Engenharia Biomdica. A presente dissertao foi desenvolvida em colaborao com o Instituto Gulbenkian de Cincia
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Resumo A tumorignese um processo de transformao celular que se desenrola tipicamente em vrias etapas. Os diferentes nveis de evoluo tumoral resultam da acumulao sucessiva de mutaes genticas numa clula normal que lhe conferem uma vantagem selectiva no respectivo meio tecidular. As mutaes podem manifestar-se sob a forma de alteraes nucleotdicas pontuais ao nvel da sequncia de DNA, levando a uma desregulao da funo proteca ou formao de protenas no-funcionais, ou atravs de alteraes cromossmicas numricas ou estruturais. Na leucemia, por exemplo, os genes hbridos que resultam de translocaes cromossmicas desempenham um importante papel no processo tumorignico. Estes genes so transcritos sob a forma de um RNA mensageiro de fuso, o qual traduzido numa protena hbrida com funo oncognica. Frequentemente, os subtipos de doena leucmica esto associados com translocaes cromossmicas que envolvem 2 pontos de quebra recorrentes e especficos. disto exemplo a leucemia mielide crnica, em que uma translocao recproca entre os cromossomas 9 e 22 conduz formao de um gene de fuso BCR-ABL1. Em diferentes subtipos de doena, existe tambm uma pequena proporo de casos que apresenta translocaes cromossmicas complexas, que envolvem um ou mais pontos de quebra adicionais em outras localizaes genmicas alm das que esto implicadas na formao dos genes de fuso. Por vezes, os pontos de quebra esto tambm associados a deleces extensas de material gentico que se pensa terem uma funo importante na tumorignese. No entanto, o papel destas regies genmicas no desenvolvimento tumoral no tem sido um motivo recorrente de estudo. Neste contexto, o objectivo desta dissertao foi o de determinar o potencial papel tumorignico de alteraes gnicas adicionais ocorridas nos pontos de quebra de translocaes cromossmicas complexas. Para a prossecuo do objectivo proposto, foram estudados 5 rearranjos cromossmicos distintos associados com diferentes tipos de doena hematolgica maligna, nomeadamente a leucemia linfoblstica aguda de clulas B (2 casos), leucemia mielide aguda, neoplasma mieloproliferativo e sndrome mielodisplsico/neoplasma ieloproliferativo, no classificvel. O mapeamento dos pontos de quebra foi efectuado utilizando a hibridao fluorescente in situ e diferentes metodologias de biologia molecular, tendo como base a informao inicial da anlise citogentica. Em casos seleccionados, o papel dos novos genes candidatos foi avaliado in vitro utilizando modelos de linhas celulares, nomeadamente no que respeita s funes de controlo da proliferao celular e de regulao transcricional. De entre os 5 casos estudados, quatro deles evidenciaram translocaes complexas envolvendo 3 cromossomas, nomeadamente t(12;21;5)(p13;q22;q13), t(12;6;15)(p13;p24~25;q22), t(9;11;19)(p22;q23;p13) e t(X;20;16)(p11;q13;q23). No caso remanescente, foi observada uma translocao dicntrica dic(9;12)(p11;p11) acompanhada de deleces extensas em ambos os pontos de quebra. Nos casos com t(12;21;5) e t(9;11;19) as translocaes estavam associadas com a presena de genes de fuso recorrentes, nomeadamente TV6(12p13)-RUNX1(21q22) e TLL(11q23)-MLLT3(9p22), indicando que se tratavam de rearranjos complexos das translocaes t(12;21) e t(9;11) associadas com a leucemia linfoblstica aguda de clulas B e a leucemia mielide aguda, respectivamente. O papel dos pontos de quebra adicionais foi estudado em detalhe no caso com t(9;11;19). Atravs da metodologia de long distance inverse-polymerase chain reaction, foram identificados os pontos de quebra na sequncia de DNA dos 3 cromossomas envolvidos na translocao. Alm dos pontos de quebra nos genes MLL e MLLT3, foi observado que o local de quebra no cromossoma 19 interrompeu a sequncia de um novo gene, designado CCDC94,conduzindo sua haplo-insuficincia nas clulas com t(9;11;19). Atravs de ensaios de reverse transcription-polymerase chain reaction verificmos que o gene CCDC94 expresso ubiquitariamente em tecidos humanos normais. A anlise informtica da sequncia prevista da protena CCDC94 indicou uma elevada identidade de aminocidos com a protena cwf16, envolvida na regulao do ciclo celular da levedura Schizosaccharomyces pombe. Atravs da clonagem do DNA complementar de CCDC94 em vectores de expresso, e aps a transfeco destes em culturas de linhas celulares in vitro, observmos que este gene codifica uma protena de localizao exclusivamente nuclear. A expresso ectpica da protena CCDC94 diminuiu a progresso do ciclo celular e a proliferao das clulas em cultura. Inversamente, a supresso do transcrito do gene CCDC94 atravs de interferncia de RNA conduziu a um aumento significativo da proliferao celular, confirmando que CCDC94 regula negativamente a proliferao e a progresso do ciclo celular. Estes resultados mostram que os pontos de quebra adicionais, presentes em translocaes cromossmicas complexas em leucemia, podem resultar na haplo-insuficincia de genes controladores dos mecanismos proliferativos, cooperando desta forma com a aco das protenas de fuso para proporcionar ao clone leucmico uma proliferao celular descontrolada. Nos restantes 3 casos estudados no foram identificados genes de fuso. Ao invs, todos aqueles apresentaram deleces de extenso varivel associadas com os pontos de quebra cromossmicos. No caso com t(12;6;15), identificmos uma deleco de 1.2 megabases de DNA na banda 12p13 que resultou na eliminao de 9 genes incluindo ETV6 e CDKN1B. O gene ETV6 codifica um factor de transcrio que essencial para a formao das diferentes linhagens hematopoiticas na medula ssea, enquanto CDKN1B traduzido numa protena responsvel por bloquear a entrada das clulas na fase G1 do ciclo celular e,consequentemente, por travar a proliferao celular. Neste contexto, os resultados obtidos indicam que a perda simultnea de ETV6 e de CDKN1B, atravs de uma translocao cromossmica complexa, constituiu uma aco cooperativa na leucemognese. A mesma noo pode aplicar-se ao caso com dic(9;12), no qual pelo menos 2 genes que codificam para factores de transcrio importantes na linhagem hematopoitica, PAX5 no cromossoma 9 e ETV6 no cromossoma 12, estavam deleccionados como resultado do rearranjo cromossmico. Dado que o factor de transcrio PAX5 regula negativamente a expresso do gene FLT3, que desempenha uma funo pr-proliferativa, expectvel que a haplo-insuficincia de PAX5 no caso com dic(9;12) ter tido como consequncia uma elevao dos nveis de expresso de FLT3, contribuindo deste modo para uma proliferao celular aumentada. A t(X;20;16) foi identificada num doente com trombocitmia essencial (TE), uma doena que est intimamente relacionada com alteraes de vias intracelulares reguladas por citocinas. Neste caso, atravs da utilizao de um array genmico, identificmos a presena de pequenas deleces associadas com os pontos de quebra nos cromossomas 16 e 20. No cromossoma 16 apenas um gene, MAF, estava deleccionado, enquanto no cromossoma 20 a deleco tinha abrangido 3 genes. Dos genes deleccionados, dois deles, NFATC2 (20q13) e MAF (16q23), codificam protenas que operam como reguladores transcricionais de citocinas hematopoiticas. Dado que NFATC2 se localiza numa regio que constitui um alvo frequente de deleces em neoplasmas ieloproliferativos, incluindo a trombocitmia essencial,efectumos um estudo detalhado do papel deste gene na proliferao megacarioctica e na regulao da expresso de uma citocina hematopoitica (GM-CSF), implicada na maturao das diferentes linhagens mielides. Utilizando um modelo de linha celular de trombocitmia essencial, verificmos que a supresso do transcrito do gene NFATC2 in vitro, por interferncia de RNA, estava associada com um aumento da proliferao celular. Em concordncia, o bloqueio da activao da protena NFATC2 atravs de um inibidor especfico da sua interaco com a calcineurina, conduziu a um aumento da proliferao celular in vitro. Utilizando a PCR quantitativa em tempo real, detectou-se um aumento da produo do RNA de GM-CSF em ambos os ensaios celulares, indicando que o factor de transcrio NFATC2 pode regular negativamente a expresso de GM-CSF em clulas de trombocitmia essencial. No geral, estes resultados mostram que a reduo dos nveis fisiolgicos do transcrito NFATC2, ou a reduo da respectiva actividade proteica, esto relacionados com a proliferao de megacariocitos atravs do aumento da produo de GM-CSF. De acordo com estes resultados, verificmos que as clulas dos doentes com TE apresentam nveis mais baixos do transcrito NFATC2 do que a populao normal. Dado que o factor de transcrio MAF desempenha igualmente um papel como regular transcricional de citocinas, plausvel que a haplo-insuficincia dos genes NFATC2 e MAF, resultante do rearranjo cromossmico complexo t(X;20;16), teve um efeito cooperativo importante na patognese da trombocitmia essencial atravs da alterao do padro normal de expresso das citocinas hematopoiticas. Em sntese, efectumos nesta dissertao um estudo citogentico de 4 translocaes cromossmicas complexas incluindo t(12;21;5), t(12;6;15), t(9;11;19) e t(X;20;16), e de uma translocao dicntrica dic(9;12), associadas com diferentes neoplasmas hematolgicos. Em casos seleccionados efectumos tambm um estudo molecular detalhado das regies dos pontos de quebra. Esta anlise permitiu-nos identificar 2 genes, CCDC94 no cromossoma 19 e NFATC2 no cromossoma 20, cuja haplo-insuficincia pode promover o aumento da proliferao celular das clulas leucmicas. A partir destes estudos podem ser retiradas 2 noes principais: (i) Os pontos de quebra adicionais, que ocorrem em translocaes complexas associadas com a formao de genes de fuso, podem ter como consequncia a desregulao de genes controladores da proliferao celular (e.g., CCDC94); (ii) As translocaes complexas caracterizadas pela ausncia de genes de fuso recorrentes podero estar preferencialmente associadas com a presena de deleces, envolvendo um ou mais genes, nos pontos de quebra; nestas situaes, sero necessrios pelo menos 2 genes com funes celulares semelhantes (e.g., NFATC2 e MAF) ou complementares (e.g., ETV6 e CDKN1B) para, quando deleccionados, promoverem de forma cooperativa a leucemognese. Nestes termos, o modelo de alteraes genticas sequenciais que caracteriza o desenvolvimento do cancro pode ser substitudo por um modelo em que vrios genes-alvo so simultaneamente desregulados pela formao de uma translocao cromossmica complexa, evitando deste modo a necessidade de ocorrncia de alteraes genticas subsequentes.----------------------ABSTRACT: Tumourigenesis is a multistep process which results from the accumulation of successive genetic mutations in a normal cell. In leukemia for instance, recurrent translocations play a part in this process by generating fusion genes which lead to the production of hybrid proteins with an oncogenic role. However, a minor subset of chromosomal translocations referred to as complex or variant involves extra breakpoints at variable genome locations in addition to those implicated in the formation of fusion genes. We aimed to describe in this work the role, if any, of genes located at extra breakpoint locations or which are affected by breakpoint-adjacent deletions through the study of 5 leukemia patients.Two of the patients presented with TV6(12p13)-RUNX1(21q22) and MLL(11q23)- MLLT3(9p22) fusion genes as a result of a t(12;21;5) and a t(9;11;19), respectively. Detailed molecular characterization of the extra breakpoint at chromosome 19 in the latter case revealed that a novel ubiquitously expressed gene, CCDC94, with a potential role in cell cycle regulation, was disrupted by the breakpoint. We demonstrated using in vitro cellular assays that this gene codifies for a nuclear protein which negatively regulates cell cycle progression. These data shows that extra breakpoint locations of complex translocations may result in haplo-insufficiency of critical proliferation genes, thereby cooperating with the generation of hybrid proteins to provide unrestrained cell proliferation. In the other 3 patients there were reakpoint-associated deletions which precluded the formation of putative fusion genes. In a case with a t(12;6;15) we characterized a deletion at 12p13 which eliminated ETV6 and 8 other genes including CDKN1B. These findings indicate that concomitant loss of ETV6 and CDKN1B, which encodes a cyclin-dependent kinase inhibitor responsible for blocking entry of cells into the G1 phase of the cell cycle, acted cooperatively to promote leukemogenic proliferation. The same notion applied to a case with a dic(9;12) in which 2 genes encoding hematopoietic transcription factors - ETV6 and PAX5 (9p13)- were deleted as a result of breakpoint-adjacent deletions. Similarly, we found that 2 transcription factor genes involved in the regulation of cytokine expression, NFATC2 (20q13) and MAF (16q23), were involved in deletions contiguous to the breakpoints in a patient with a t(X;20;16). In vitro suppression of NFATC2 mRNA or inhibiton of NFATC2 protein activity enhanced cell proliferation as a result of an increase in the production of a myeloid-lineage stimulating hematopoietic cytokine, GM-CSF. These results suggest that haplo-insufficiency of NFATC2 and MAF genes had a cooperative effect in inducing cell proliferation as a result of a disregulation of cytokine production. Two main conclusions may be drawn from our studies: (i) In complex translocations associated with the production of fusion genes, additional breakpoints may cooperate in tumourigenesis by targeting genes that control cell proliferation; (ii) In complex translocations associated with small breakpoint-adjacent deletions, at least 2 genes with similar or complementary functions need to be deregulated to promote tumourigenesis.
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RESUMO: A retina composta, entre outras estruturas, pelo epitlio pigmentar da retina (EPR)e pela coride. A regio central da retina denomina-se mcula, e a zona mais afetada na degenerescncia macular relacionada com a idade, a forma mais comum de degenerescncia da retina. Nesta doena, a secreo de fatores de crescimento pelo EPR afetada, nomeadamente a do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), e pouco se sabe ainda sobre os mecanismos moleculares conducentes a esta condio. A famlia de protenas Rab GTPases est envolvida nas vias intracelulares de sinalizao e trfego membranares, essenciais na transduo de sinais extracelulares em respostas biolgicas. A sua crucial importncia nestes mecanismos levou-nos a considerar o seu potencial envolvimento nas vias de secreo do VEGF, e a questionar-nos se teriam algum papel regulador sobre as mesmas. O principal objetivo deste trabalho identificar Rab GTPases importantes para as vias de secreo e endocitose do VEGF no EPR. Essa identificao ajudar a esclarecer a patognese da degenerescncia macular da retina, e poder servir para uma procura mais direcionada de novos agentes teraputicos. A caracterizao de dois modelos in vitro do EPR, clulas primrias isoladas de murganho e a linha celular B6-RPE07,levou-nos a concluir que so ambos semelhantes. Contudo, a linha celular foi escolhida como prottipo do EPR por permitir o acesso a um nmero ilimitado de clulas. No decurso deste trabalho, desenvolvemos e caracterizmos uma biblioteca de ferramentas moleculares que nos permitiram reduzir os nveis proteicos das protenas Rab GTPases, com base na tecnologia de cido ribonucleico (ARN) de interferncia. O papel das protenas Rab GTPases na secreo do VEGF no EPR foi estudado com base no silenciamento de apenas uma protena, ou combinando vrias, segundo a sua localizao e funes intracelulares descritas. Este trabalho permitiu-nos concluir que as protenas Rab GTPases so importantes intervenientes no processo de secreo de VEGF pelo EPR, e confirmar dados anteriores que relatam o envolvimento de algumas Rab GTPases endocticas no processo. Propomos ainda um novo modelo para a interao destas protenas no EPR, e sugerimos que a Rab10 e a Rab14 atuam negativamente sobre a Rab8, controlando o seu funcionamento. Os nossos resultados evidenciam a importncia das protenas Rab GTPases na secreo do VEGF pelas clulas do EPR, e servem de base a futuros estudos que melhor procurem compreender este mecanismo e de que modo a sua alterao se relaciona com a degenerescncia da retina.--------ABSTRACT: Retinal pigment epithelium (RPE) and choroid are components of the mammalian retina, of which the central region is called macula. The most common form of retinaldegeneration, age-related macular degeneration (AMD), involves primarily deregulation of growth factors secretion by the RPE. Very little is known about the molecular mechanisms that lead to impairment of RPEs homeostatic intracellular processes, namely the secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF). Rab GTPases family regulates membrane targeting and traffic, being essential in the transduction of signal pathways. Given Rab proteins role in intracellular trafficking, we propose to identify key regulatory Rab proteins involved in either the secretory or the recycling pathways of VEGF in RPE. Understanding how Rab proteins function disruption could lead to retinal and choroidal pathology would ultimately contribute to find new therapeutic agents. Here, we characterized two mouse RPE in vitro cell models, primary cells and B6-RPE07 cell line, and concluded that both display important epithelial features as the RPE presents in vivo. Considering unlimited cell number and results reproducibility, we chose B6-RPE07 cells to further study Rab proteins function. To scrutinize the consequences of Rab proteins absence or diminished levels, we have developed novel molecular tools to achieve silencing of these key proteins using miRNA technology. We further addressed the effect of Rab proteins absence on VEGF secretion by performing an extensive screening where different Rab proteins were silenced, both individually and in multiple combinations considering their cellular/ compartment location. We conclude that Rab GTPases are important intervenients in VEGF secretion by RPE cells, confirming endocytic Rab proteins role in regulation of VEGF biology. We also propose a novel model for Rab proteins interaction in RPE. Our results suggest that Rab10 and Rab14 might influence Rab8 in a negative feedback mechanism, important for controlling VEGF secretion. Our achievements unravel Rab proteins role in VEGF secretion by RPE cells and are the basis for future studies to better understand RPE molecular secretory machinery.
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RESUMO: A Malria causada por parasitas do gnero Plasmodium, sendo a doena parasitria mais fatal para o ser humano. Apesar de, durante o sculo passado, o desenvolvimento econmico e a implementao de diversas medidas de controlo, tenham permitido erradicar a doena em muitos pases, a Malria continua a ser um problema de sade grave, em particular nos pases em desenvolvimento. A Malria transmitida atravs da picada de uma fmea de mosquito do gnero Anopheles. Durante a picada, os esporozotos so injetados na pele do hospedeiro, seguindo-se a fase heptica e obrigatria do ciclo de vida. No fgado, os esporozotos infetam os hepatcitos onde se replicam, dentro de um vacolo parasitrio (VP) e de uma forma imunitria silenciosa, em centenas de merozoitos. Estas novas formas do parasita so as responsveis por infetar os eritrcitos, iniciando a fase sangunea da doena, onde se os primeiros sintomas se manifestam, tais como a caracterstica febre cclica. A fase heptica da doena a menos estudada e compreendida. Mais ainda, as interaes entre o VP e os organelos da clulas hospedeira esto ainda pouco caracterizados. Assim, neste estudo, as interaes entre os organelos endocticos e autofgicos da clula hospedeira e o VP foram dissecados, observando-se que os anfisomas, que so organelos resultantes da interseco do dois processos de trfego intracelular, interagem com o parasita. Descobrimos que a autofagia tem tambm uma importante funo imunitria durante a fase heptica inicial, ao passo, que durante o desenvolvimento do parasita, j numa fase mais tardia, o parasita depende da interao com os endossomas tardios e anfisomas para crescer. Vesiculas de BSA, EGF e LC3, foram, tambm, observadas dentro do VP, sugerindo que os parasitas so capazes de internalizar material endoctico e autofgico do hospedeiro. Mais ainda, mostramos que esta interao depende da cinase PIKfyve, responsvel pela converso do fosfoinositidio-3-fosfato no fosfoinositidio-3,5-bifosfato, uma vez que inibindo esta cinase o parasita no capaz de crescer normalmente. Finalmente, mostramos que a protena TRPML1, uma protena efetora do fosfoinositidio-3,5-bifosfato, e envolvida no processo de fuso das membranas dos organelos endocticos e autofgicos, tambm necessria para o crescimento do parasita. Desta forma, o nosso estudo sugere que a membrana do VP funde com vesiculas endocticas e autofgicas tardias, de uma forma dependente do fositidio-3,5-bifosfato e do seu effetor TRPML1, permitindo a troca de material com a clula hospedeira. Concluindo, os nossos resultados evidenciam que o processo autofgico que ocorre na clula hospedeira tem um papel duplo durante a fase heptica da malaria. Enquanto numa fase inicial os hepatcitos usam o processo autofgico como forma de defesa contra o parasita, j durante a fase de replicao o VP funde com vesiculas autofgicas e endocticas de forma a obter os nutrientes necessrios ao seu desenvolvimento.--------- ABSTRACT: Malaria, which is caused by parasites of the genus Plasmodium, is the most deadly parasitic infection in humans. Although economic development and the implementation of control measures during the last century have erradicated the disease from many areas of the world, it remains a serious human health issue, particularly in developing countries. Malaria is transmitted by female mosquitoes of the genus Anopheles. During the mosquito blood meal, Plasmodium spp. sporozoites are injected into the skin dermis of the vertebrate host, followed by an obligatory liver stage. Upon entering the liver, Plasmodium parasites infect hepatocytes and silently replicate inside a host cell-derived parasitophorous vacuole (PV) into thousands of merozoites. These new parasite forms can infect red blood cells initiating the the blood stage of the disease which shows the characteristic febrile malaria episodes. The liver stage is the least characterized step of the malaria infection. Moreover, the interactions between the Plasmodium spp. PV and the host cell trafficking pathways are poorly understood. We dissected the interaction between Plasmodium parasites and the host cell endocytic and autophagic pathways and we found that both pathways intersect and interconnect in the close vicinity of the parasite PV, where amphisomes are formed and accumulate. Interestingly, we observed a clearance function for autophagy in hepatocytes infected with Plasmodium berghei parasites at early infection times, whereas during late liver stage development late endosomes and amphisomes are required for parasite growth. Moreover, we found the presence of internalized BSA, EGF and LC3 inside parasite vacuoles, suggesting that the parasites uptake endocytic and autophagic cargo. Furthermore, we showed that the interaction between the PV and host traffic pathways is dependent on the kinase PIKfyve, which converts the phosphoinositide PI(3)P into PI(3,5)P2, since PIKfyve inhibition caused a reduction in parasite growth. Finally, we showed that the PI(3,5)P2 effector protein TRPML1, which is involved in late endocytic and autophagic membrane fusion, is also required for parasite development. Thus, our studies suggest that the parasite parasitophorous vacuole membrane (PVM) is able to fuse with late endocytic and autophagic vesicles in a PI(3,5)P2- and TRPML1-dependent manner, allowing the exchange of material between the host cell and the parasites, necessary for the rapid development of the latter that is seen during the liver stage of infection. In conclusion, we present evidence supporting a specific and essential dual role of host autophagy during the course of Plasmodium liver infection. Whereas in the initial hours of infection the host cell uses autophagy as a cell survival mechanism to fight the infection, during the replicative phase the PV fuses with host autophagic and endocytic vesicles to obtain nutrients required for parasite growth.
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RESUMO: A pele o maior rgo do corpo humano e a sua pigmentao essencial para a sua colorao e proteo contra os efeitos nocivos da radiao ultravioleta (UV). A pigmentao da pele resulta essencialmente de trs processos: a sntese e o armazenamento de melanina pelos melancitos, em organelos especializados denominados melanossomas; o transporte dos melanossomas dentro dos melancitos; e finalmente, a transferncia dos melanossomas para os queratincitos adjacentes. Nos queratincitos, a melanina migra para a regio perinuclear apical da clula para formar um escudo protetor,responsvel pela proteo do DNA dos danos causados pela radiao UV. Os melancitos esto localizados na camada basal da epiderme e contactam com 30-40 queratincitos. Em conjunto, estas clulas formam a unidade melano-epidrmica. Apesar dos processos de sntese e transporte de melanina nos melancitos estarem bastante bem caracterizados, os mecanismos moleculares subjacentes transferncia inter-celular de melanina so menos conhecidos e ainda controversos. Dados preliminares obtidos pelo nosso grupo, que se basearam na observao de amostras de pele humana por microscopia electrnica, indicam que a forma predominante de transferncia de melanina na epiderme consiste na exocitose dos melanossomas pelos melancitos e subsequente endocitose da melanina por queratincitos. Para alm disso sabe-se que as protenas Rab, que controlam o trfego membranar, esto envolvidas em vrias etapas de pigmentao da pele, nomeadamente na biognese e no transporte de melanina. Assim, dado o seu papel fundamental nestes processos, questionmo-nos sobre o seu envolvimento na transferncia de melanina. Com este trabalho, propomo-nos a expandir o conhecimento atual sobre a transferncia de melanina na pele, atravs do estudo detalhado dos seus mecanismos moleculares, identificando as protenas Rab que regulam o processo. Pretendemos tambm confirmar o modelo de exo/endocitose como sendo o mecanismo principal de transferncia de melanina. Primeiro, explormos a regulao da secreo de melanina pelos melancitos e analismos o papel de protenas Rab neste processo. Os resultados foram obtidos recorrendo a um mtodo in vitro, desenvolvido previamente no laboratrio, que avalia a quantidade de melanina segregada para o meio de cultura por espectrofotometria, e ainda por microscopia, contando o nmero de melanossomas transferidos para os queratincitos. Atravs de co-culturas de melancitos e queratincitos, verificou-se que os queratincitos estimulam a libertao de melanina dos melancitos para o meio extra-celular, bem como a sua transferncia para os queratincitos. Alm disso, a protena Rab11b foi identificada como um regulador da exocitose de melanina e da sua transferncia para os queratincitos. De facto, a diminuio da expresso de Rab11b em melancitos provocou a reduo da secreo de melanina estimulada por queratincitos, bem como da transferncia desta. Em segundo lugar, para complementar o nosso estudo, centrmos a nossa investigao na internalizao de melanina por queratincitos. Especificamente, usando uma biblioteca de siRNA, explormos o envolvimento de protenas Rab na captao de melanina por queratincitos. Como primeira abordagem, usmos esferas fluorescentes como substituto de melanina, avaliando os resultados por citometria de fluxo. No entanto, este mtodo revelou-se ineficaz uma vez que a internalizao destas esferas independente do recetor PAR-2 (recetor 2 ativado por protease), que foi previamente descrito como essencial na captao de melanina por queratincitos Posteriormente, foi desenvolvido um novo protocolo de endocitose baseado em microscopia, usando melanossomas sem a membrana envolvente (melanocores) purificados do meio de cultura de melancitos, incluindo um programa informtico especialmente desenhado para realizar uma anlise semi-automatizada. Aps internalizao, os melanocores acumulam-se na regio perinuclear dos queratincitos, em estruturas que se assemelham ao escudo supranuclear observado na pele humana. Seguidamente, o envolvimento do recetor PAR-2 na captao de melanocores por queratincitos foi confirmado, utilizando o novo protocolo de endocitose desenvolvido. Para alm disso, a necessidade de quatro protenas Rab foi identificada na internalizao de melanocores por queratincitos. A reduo da expresso de Rab1a ou Rab5b em queratincitos diminuiu significativamente o nvel de internalizao de melanocores, enquanto o silenciamento da expresso de Rab2a ou Rab14 aumentou a quantidade de melanocores internalizados por estas clulas. Em concluso, os resultados apresentados corroboram as observaes anteriores, obtidas em amostras de pele humana, e sugerem que o mecanismo de transferncia predominante a exocitose de melanina pelos melancitos, induzida por queratincitos, seguida por endocitose pelos queratincitos. A pigmentao da pele tem implicaes tanto ao nvel da cosmtica, como ao nvel mdico, relacionadas com foto-envelhecimento e com doenas pigmentares. Assim sendo, ao esclarecer quais os mecanismos moleculares que regulam a transferncia de melanina na pele, este trabalho pode conduzir ao desenvolvimento de novas estratgias para modular a pigmentao da pele.----------------ABSTRACT: Skin pigmentation is achieved through the highly regulated production of the pigment melanin in specialized organelles, termed melanosomes within melanocytes. These are transported from their site of synthesis to the melanocyte periphery before being transferred to keratinocytes where melanin forms a supra-nuclear cap to protect the DNA from UVinduced damage. Together, melanocytes and keratinocytes form a functional complex, termed epidermal-melanin unit, that confers color and photoprotective properties to the skin. Skin pigmentation requires three processes: the biogenesis of melanin; its intracelular transport within the melanocyte to the cell periphery; and the melanin transfer to keratinocytes. The first two processes have been extensively characterized. However, despite significant advances that have been made over the past few years, the mechanisms underlying inter-cellular transfer of pigment from melanocytes to keratinocytes remain controversial.Preliminary studies from our group using electron microscopy and human skin samples found evidence for a mechanism of coupled exocytosis-endocytosis. Rab GTPases are master regulators of intracellular trafficking and have already been implicated in several steps of skin pigmentation. Thus, we proposed to explore and characterize the molecular mechanisms of melanin transfer and the role of Rab GTPases in this process. Moreover, we investigated whether the exo/endocytosis model is the main mechanism of melanin transfer. We first focused on melanin exocytosis by melanocytes. Then, we started to investigate the key regulatory Rab proteins involved in this step by establishing an in vitro tissue culture model of melanin secretion. Using co-cultures of melanocytes and keratinocytes, we found that keratinocytes stimulate melanin release and transfer. Moreover, depletion of Rab11b decreases keratinocyte-induced melanin exocytosis by melanocytes. In order to determine whether melanin exocytosis is a predominant mechanism of melanin transfer, the amount of melanin transferred to keratinocytes was then assayed in conditions where melanin exocytosis was inhibited. Indeed, Rab11b depletion resulted in a significant decrease in melanin uptake by keratinocytes. Taken together, these observations suggest that Rab11b mediates melanosome exocytosis from melanocytes and transfer to keratinocytes. To complement and extend our study, we of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptakecentred our attention in the internalization of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptake.Therefore, we concluded that microspheres were uptaken by keratinocytes through a different pathway than melanin. Subsequently, we developed a microscopy-based endocytosis assay using purified melanocores (melanosomes lacking the limiting membrane) from melanocytes, including a program to perform a semi-automated analysis. Melanocores are taken up by keratinocytes and accumulate in structures in the perinuclear area that resemble the physiological supranuclear cap observed in human skin. We then confirmed the involvement of PAR-2 receptor in the uptake of melanocores by keratinocytes, using the newly developed assay. Furthermore, we identified the role of four Rab GTPases on the uptake of melanocores by keratinocytes. Depletion of Rab1a and Rab5b from keratinocytes significantly reduced the uptake of melanocores, whereas Rab2a, and Rab14 silencing increased the amount the melanocores internalized by XB2 keratinocytes. In conclusion, we present evidence supporting keratinocyte-inducedmelanosome exocytosis from melanocytes, followed by endocytosis of the melanin core by keratinocytes as the predominant mechanism of melanin transfer in skin. Although advances have been made, there is a need for more effective and safer therapies directed at pigmentation disorders and also treatments for cosmetic applications. Hence, the understanding of the above mechanisms of skin pigmentation will lead to a greater appreciation of the molecular machinery underlying human skin pigmentation and could interest the pharmaceutical and cosmetic industries.
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RESUMO:O glicosilfosfatidilinositol (GPI) um complexo glicolipdico utlizado por dezenas de protenas, o qual medeia a sua ancoragem superfcie da clula. Protenas de superfcie celular ancoradas a GPI apresentam vrias funes essenciais para a manuteno celular. A deficincia na sntese de GPI o que caracteriza principalmente a deficincia hereditria em GPI, um grupo de doenas autossmicas raras que resultam de mutaes nos genes PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO e PIGT, os quais sao indispensveis para a biossntese do GPI. Uma mutao pontual no motivo rico em GC -270 no promotor de PIGM impede a ligao do factor de transcrio (FT) Sp1 sua sequncia de reconhecimento, impondo a compactao da cromatina, associada hipoacetilao de histonas, e consequentemente, impedindo a transcrio de PIGM. Desta forma, a adio da primeira manose ao GPI comprometida, a sntese de GPI diminui assim como as protenas ligadas a GPI superficie das clulas. Pacientes com Deficincia Hereditria em GPI-associada a PIGM apresentam trombose e epilesia, e ausncia de hemlise intravascular e anemia, sendo que estas duas ltimas caractersticas definem a Hemoglobinria Paroxstica Nocturna (HPN), uma doena rara causada por mutaes no gene PIGA. Embora a mutao que causa IGD seja constitutiva e esteja presente em todos os tecidos, o grau de deficincia em GPI varia entre clulas do mesmo tecido e entre clulas de tecidos diferentes. Por exemplo nos granulcitos e linfcitos B a deficincia em GPI muito acentuada mas nos linfcitos T, fibroblastos, plaquetas e eritrcitos aproximadamente normal, da a ausncia de hemlise intravascular. Os eventos transcricionais que esto na base da expresso diferencial da ncora GPI nas clulas hematopoiticas so desconhecidos e constituem o objectivo geral desta tese. Em primeiro lugar, os resultados demonstraram que os nveis de PIGM mRNA variam entre clulas primrias hematopoiticas normais. Adicionalmente, a configurao dos nucleossomas no promotor de PIGM mais compacta em clulas B do que em clulas eritrides e tal est correlacionado com os nveis de expresso de PIGM, isto , inferior nas clulas B. A presena de vrios motivos de ligao para o FT especfico da linhagem megacarioctica-eritride GATA-1 no promotor de PIGM sugeriu que GATA-1 desempenha um papel regulador na sua transcrio. Os resultados mostraram que muito possivelmente GATA-1 desempenha um papel repressor em vez de activador da expresso de PIGM. Resultados preliminares sugerem que KLF1, um factor de transcrio restritamente eritride, regula a transcrio de PIGM independentemente do motivo -270GC. Em segundo lugar, a investigao do papel dos FTs Sp demonstrou que Sp1 medeia directamente a transcrio de PIGM em ambas as clulas B e eritride. Curiosamente, ao contrrio do que acontece nas clulas B, em que a transcrio de PIGM requer a ligao do FT geral Sp1 ao motivo -270GC, nas clulas eritrides Sp1 regula a transcrio de PIGM ao ligar-se a montante e no ao motivo -270GC. Para alm disso, demonstrou-se que Sp2 no um regulador directo da transcrio de PIGM quer nas clulas B quer nas clulas eritrides. Estes resultados explicam a ausncia de hemlise intravascular nos doentes com IGD associada a PIGM, uma das principais caractersticas que define a HPN. Por ltimo, resultados preliminares mostraram que a represso da transcrio de PIGM devida mutao patognica -270C>G est associada com a diminuio da frequncia de interaces genmicas em cis entre PIGM e os seus genes vizinhos, sugerindo adicionalmente que a regulao de PIGM e desses genes partilhada. No seu conjunto, os resultados apresentados nesta tese contribuem para o conhecimento do controlo transcricional de um gene housekeeping, especfico-detecido, por meio de FTs genricos e especficos de linhagem.-------------ABSTRACTC: Glycosylphosphatidylinositol (GPI) is a complex glycolipid used by dozens of proteins for cell surface anchoring. GPI-anchored proteins have various functions that are essential for the cellular maintenance. Defective GPI biosynthesis is the hallmark of inherited GPI deficiency (IGD), a group of rare autosomal diseases caused by mutations in PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO and PIGT, all genes indispensable for GPI biosynthesis. A point mutation in the -270GC-rich box in the core promoter of PIGM disrupts binding of the transcription factor (TF) Sp1 to it, imposing nucleosome compaction associated with histone hypoacetylation, thus abrogating transcription of PIGM. As a consequence of PIGM transcriptional repression, addition of the first mannose residue onto the GPI core and thus GPI production are impaired; and expression of GPI-anchored proteins on the surface of cells is severely impaired. Patients with PIGM-associated IGD suffer from life-threatening thrombosis and epilepsy but not intravascular haemolysis and anaemia, two defining features of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH), a rare disease caused by somatic mutations in PIGA. Although the disease-causing mutation in IGD is constitutional and present in all tissues, the degree of GPI deficiency is variable and differs between cells of the same and of different tissues. Accordingly, GPI deficiency is severe in granulocytes and B cells but mild in T cells, fibroblasts, platelets and erythrocytes, hence the lack of intravascular haemolysis.The transcriptional events underlying differential expression of GPI in the haematopoietic cells of PIG-M-associated IGD are not known and constitute the general aim of this thesis. Firstly, I found that PIGM mRNA levels are variable amongst normal primary haematopoietic cells. In addition, the nucleosome configuration in the promoter of PIGM is more compacted in B cells than in erythroid cells and this correlated with the levels of PIGM mRNA expression, i.e., lower in B cells. The presence of several binding sites for GATA-1, a mega-erythroid lineage-specific transcription factor (TF), at the PIGM promoter suggested that GATA-1 has a role on PIGM transcription. My results showed that GATA-1 in erythroid cells is most likely a repressor rather than an activator of PIGM expression. Preliminary data suggested that KLF1, an erythroid-specific TF, regulates PIGM transcription but independently of the -270GC motif. Secondly, investigation of the role of the Sp TFs showed that Sp1 directly mediates PIGM transcriptional regulation in both B and erythroid cells. However, unlike in B cells in which active PIGM transcription requires binding of the generic TF Sp1 to the -270GC-rich box, in erythroid cells, Sp1 regulates PIGM transcription by binding upstream of but not to the -270GC-rich motif. Additionally, I showed that Sp2 is not a direct regulator of PIGM transcription in B and erythroid cells. These findings explain lack of intravascular haemolysis in PIGM-associated IGD, a defining feature of PNH. Lastly, preliminary work shows that transcriptional repression of PIG-M by the pathogenic -270C>G mutation is associated with reduced frequency of in cis genomic interactions between PIGM and its neighbouring genes, suggesting a shared regulatory link between these genes and PIGM. Altogether, the results presented in this thesis provide novel insights into tissuespecific transcriptional control of a housekeeping gene by lineage-specific and generic TFs.
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Tese de Doutoramento Biologia Molecular e Ambiental - Especialidade em Biologia Celular e Sade
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Tese de Doutoramento em Biologia Molecular e Ambiental (rea de especializao em Biologia Celular e Sade).
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Tese de Doutoramento em Biologia Molecular e Ambiental (rea de especializao em Biologia Celular e Sade).
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Tese de Doutoramento em Biologia Molecular e Ambiental - Especialidade em Biologia Celular e Sade
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A colaborao docente on-line permite a criao de comunidades virtuais. As ferramentas virtuais de uma equipe em rede permitem criar aulas virtuais em diferentes localizaes geogrficas. Estes ambientes permitem na educao a transferncia do conhecimento entre alunos e docentes, incluindo atividades sncronas e assncronas. Neste trabalho descrevemos nossa experincia em colaborao docente on-line, utilizando ferramentas virtuais na educao universitria. Os softwares utilizados foram 1-Skype: Software de aplicao para chamadas na Internet (VoIP). 2- LAN: Aula virtual digital disponibilizado em http://www.cevap.unesp.br/abertura.htm. Estas mdias foram utilizadas em dias e locais de transmisso e recepo diferentes. Os temas foram: 1-"Como preparar uma videoconferncia", 2-"Importncia das TICs na docncia Universitria", 3-"Plataformas virtuais com bases de dados automatizadas na busca bibliogrfica", 4-"Uso do laboratrio virtual no ensino de Biologia Celular, Histologia e Embriologia". As ferramentas virtuais permitem a colaborao on-line de docentes localizados em diferentes localizaes geogrficas, alm de formar recursos humanos que as usaro para melhorar o desempenho da educao universitria.
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OBJETIVO: Analisar os achados citológicos de mulheres detectadas com adenocarcinoma do colo do útero, levando em conta o histórico da paciente no ano que antecedeu ao diagnóstico e a histopatologia das lesões. MÉTODOS: Este é um estudo comparativo, retrospectivo conduzido com dados de mulheres com adenocarcinoma ou com carcinoma escamoso do colo do útero detectados entre 2002 e 2008. Os laudos da citologia foram sintetizados de acordo com a terminologia Bethesda revisada em 2001 e foram comparados com a histopatologia de adenocarcinoma e de carcinoma escamoso. Foram verificadas as distribuições dos achados citológicos, a concordância global e corrigida pelo acaso com o uso do coeficiente Kappa de Cohen. Para isso, as alterações citológicas foram agregadas de acordo com a origem epitelial, formando os grupos de células glandulares e de células escamosas, tendo como padrão ouro os grupos de tumor histopatologicamente confirmados (adenocarcinoma versus carcinoma escamoso). RESULTADOS: No período, 284 casos de câncer do colo uterino foram diagnosticados. Os casos efetivamente estudados compreenderam 27 e 54 pacientes com adenocarcinoma e com carcinoma escamoso, respectivamente. O grupo de adenocarcinoma representou 9,5% do total diagnosticado, com 56% das mulheres com idade inferior a 50 anos. A coleta da citologia foi feita em média 92 dias antes do diagnóstico do câncer (variação: 19 dias a 310 dias). Em 41,6% dos casos, a citologia que precedeu o diagnóstico do adenocarcinoma foi indicativa de alterações glandulares do tipo adenocarcinoma e atipias de células glandulares. A concordância simples foi de 73,7% e o coeficiente Kappa de 48,7%, sugerindo moderada concordância. CONCLUSÃO: Nesta população, a citologia teve um importante papel no rastreio de mulheres com adenocarcinoma, embora algumas delas tenham sido referidas para esclarecer sintomas clínicos. A concordância entre os achados da citologia e da histopatologia foi moderada.
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OBJETIVOS: Estimar a prevalência da vaginose bacteriana (VB), candidíase e tricomoníase e comparar os achados do exame físico da secreção vaginal com o diagnóstico microbiológico, obtido pelo estudo citológico do esfregaço vaginal, pelo do método de Papanicolaou. MÉTODOS: Estudo de corte transversal que incluiu 302 mulheres com idade entre 20 a 87 anos, submetidas à entrevista e exame ginecológico para avaliação da secreção vaginal e coleta de esfregaço citológico, no período de junho de 2012 a maio de 2013. Para avaliar a acurácia das características da secreção vaginal em relação ao diagnóstico microbiológico do esfregaço citológico foi empregado as análises de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN), com seus respectivos IC95%. Para avaliar o grau de concordância entre as características clínicas da secreção vaginal e os achados microbiológicos no exame citológico, foi aplicado o índice kappa (k). RESULTADOS: A prevalência da VB, candidíase e tricomoníase foi de 25,5, 9,3 e 2,0%, respectivamente. A sensibilidade, especificidade, valor o VPP e o VPN das características clínicas da secreção vaginal para o diagnóstico citológico de VB foram de 74, 78,6, 54,3, e 89,9%, respectivamente. A sensibilidade, a especificidade, o VPP e o VPN das características clínicas da secreção vaginal para o diagnóstico citológico de candidíase foram de 46,4, 86,2, 25,5 e de 94%, respectivamente. O grau de concordância entre a avaliação clínica da secreção vaginal e o diagnóstico microbiológico de VB, candidíase e tricomoníase, avaliados pelo índice kappa foi de 0,47, 0,23 e 0,28, respectivamente. CONCLUSÃO: A causa mais frequente de secreção vaginal anormal foi VB. A avaliação clínica da secreção vaginal apresentou sensibilidade, VPP e grau de concordância moderado a fraco, comparado ao diagnóstico microbiológico, o que indica a necessidade de avaliação complementar do achado clínico de secreção vaginal anormal.
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Devido a importncia ecolgica dos Procyon cancrivorus, o objetivo deste trabalho foi caracterizar morfologicamente e ultra estruturalmente a glndula salivar mandibular desta espcie. Foram utilizadas 10 pares (direita e esquerda) de glndulas salivares mandibulares de cinco animais adultos. As glndulas salivares mandibulares foram dissecadas e mensuradas com paqumetro de preciso e posteriormente processadas por tcnica rotineira de histologia e coradas por HE (hematoxilina e eosina) e Picrossrius. Fragmentos das glndulas foram processados para anlise em microscopia eletrnica de varredura (MEV). As glndulas salivares mandibulares direitas e esquerdas de P. cancrivorus apresentaram-se lobuladas, formato ovalado, e posicionadas entre a fossa atlantis e o osso basihyoideum do crnio. Microscopicamente, estas glndulas estavam revestidas por uma cpsula de tecido conjuntivo denso no modelado, a qual adentra a glndula atravs de septos, dividindo-a em lbulos. Nos septos de tecido conjuntivo esto presentes vasos sanguneos e nervos, alm de ductos interlobulares excretores. Dentro dos lbulos das glndulas salivares mandibulares, so encontrados ductos do tipo estriado e intercalar, alm de predomnio de cinos do tipo mucoso. Os resultados permitem concluir que as glndulas salivares mandibulares dos Procyon cancrivorus, seguem o padro estrutural descrito em outras espcies de mamferos. No entanto os tipos de cinos podem variar entre as espcies, sendo, portanto, necessrios futuros estudos histoqumicos e de biologia celular para desvendar a importncia dessa variao para a espcie aqui estudada, comparando com seu hbito alimentar.
