Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA���glycosylase

Oxidative DNA damage is generated by reactive oxygen species. The mutagenic base, 8-oxoguanine, formed by this process, is removed from oxidatively damaged DNA by base excision repair. Genes coding for DNA repair enzymes that recognize 8-oxoguanine have been reported in bacteria and yeast. We have identified and characterized mouse and human cDNAs encoding homologs of the 8-oxoguanine DNA glycosylase (ogg1) gene of Saccharomyces cerevisiae. Escherichia coli doubly mutant for mutM and mutY have a mutator phenotype and are deficient in 8-oxoguanine repair. The recombinant mouse gene (mOgg1) suppresses the mutator phenotype of mutY/mutM E. coli. Extracts prepared from mutY/mutM E. coli expressing mOgg1 contain an activity that excises 8-oxoguanine from DNA and a ��-lyase activity that nicks DNA 3��� to the lesion. The mouse ogg1 gene product acts efficiently on DNA duplexes in which 7,8-dihydroxy-8-oxo-2���-deoxyguanosine (8-oxodG) is paired with dC, acts weakly on duplexes in which 8-oxodG is paired with dT or dG, and is inactive against duplexes in which 8-oxodG is paired with dA. Mouse and human ogg1 genes contain a helix���hairpin���helix structural motif with conserved residues characteristic of a recently defined family of DNA glycosylases. Ogg1 mRNA is expressed in several mouse tissues; highest levels were detected in testes. Isolation of the mouse ogg1 gene makes it possible to modulate its expression in mice and to explore the involvement of oxidative DNA damage and associated repair processes in aging and cancer.

Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair

8-Oxoguanine-DNA glycosylase 1 (OGG1), with intrinsic AP lyase activity, is the major enzyme for repairing 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG), a critical mutagenic DNA lesion induced by reactive oxygen species. Human OGG1 excised the damaged base from an 8-oxoG��C-containing duplex oligo with a very low apparent kcat of 0.1 min���1 at 37��C and cleaved abasic (AP) sites at half the rate, thus leaving abasic sites as the major product. Excision of 8-oxoG by OGG1 alone did not follow Michaelis���Menten kinetics. However, in the presence of a comparable amount of human AP endonuclease (APE1) the specific activity of OGG1 was increased ���5-fold and Michaelis���Menten kinetics were observed. Inactive APE1, at a higher molar ratio, and a bacterial APE (Nfo) similarly enhanced OGG1 activity. The affinity of OGG1 for its product AP��C pair (Kd ��� 2.8 nM) was substantially higher than for its substrate 8-oxoG��C pair (Kd ��� 23.4 nM) and the affinity for its final ��-elimination product was much lower (Kd ��� 233 nM). These data, as well as single burst kinetics studies, indicate that the enzyme remains tightly bound to its AP product following base excision and that APE1 prevents its reassociation with its product, thus enhancing OGG1 turnover. These results suggest coordinated functions of OGG1 and APE1, and possibly other enzymes, in the DNA base excision repair pathway.

Expression and Differential Intracellular Localization of Two Major Forms of Human 8-Oxoguanine DNA Glycosylase Encoded by Alternatively Spliced OGG1 mRNAs

We identified seven alternatively spliced forms of human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) mRNAs, classified into two types based on their last exons (type 1 with exon 7: 1a and 1b; type 2 with exon 8: 2a to 2e). Types 1a and 2a mRNAs are major in human tissues. Seven mRNAs are expected to encode different polypeptides (OGG1���1a to 2e) that share their N terminus with the common mitochondrial targeting signal, and each possesses a unique C terminus. A 36-kDa polypeptide, corresponding to OGG1���1a recognized only by antibodies against the region containing helix-hairpin-helix-PVD motif, was copurified from the nuclear extract with an activity introducing a nick into DNA containing 8-oxoguanine. A 40-kDa polypeptide corresponding to a processed form of OGG1���2a was detected in their mitochondria using antibodies against its C terminus. Electron microscopic immunocytochemistry and subfractionation of the mitochondria revealed that OGG1���2a locates on the inner membrane of mitochondria. Deletion mutant analyses revealed that the unique C terminus of OGG1���2a and its mitochondrial targeting signal are essential for mitochondrial localization and that nuclear localization of OGG1���1a depends on the NLS at its C terminus.

Einflu�� von Ern��hrung und Umweltfaktoren auf oxidative DNA-Sch��den

Nach heutigen Erkenntnissen sind f��r die Krebsentstehung Mutationen in Genen somatischer Zellen verantwortlich, die vor allem durch chemische Modifikationen der DNA (DNA-Sch��den) hervorgerufen werden. Als DNA-sch��digende Agentien sind besonders reaktive Sauerstoffspezies (ROS) von Bedeutung, die sowohl endogen, z.B. in der Lipidperoxidation und der mitochondrialen Atmungskette, als auch exogen, z.B. durch Xenobiotika und Strahlung, entstehen k��nnen. Der stets in jeder Zelle vorhandene Untergrundspiegel an DNA-Modifikationen ergibt sich aus dem Gleichgewicht zwischen Schadensbildung und den zellul��ren antioxidativen Schutz- und den Reparaturmechanismen. Ziel dieser Arbeit war, die Beeinflussung oxidativer DNA-Sch��den durch verschiedene, vom Menschen zumeist oral aufgenommene Stoffe (Ascorbins��ure, Derivat des Carazostatin (MMPDCD), Eicosapentaens��ure (EPA) und Ethanol) unter Bedingungen ohne weitere exogene Sch��digung und unter zus��tzlich induziertem oxidativem Stress zu untersuchen. Zur Induktion von oxidativen Stress wurden AS52-Zellen (CHO-Zellen) mit UVB, sichtbarem Licht oder sichtbarem Licht und Photosensibilisator bestrahlt. Die Bestimmung der oxidativen DNA-Sch��den in den Zellen (AS52 oder humane Lymphozyten) erfolgte mit Hilfe der Alkalischen Elution, wobei als Sonde das Fpg-Protein, eine DNA-Reparaturendonuklease, die vor allem 8-Hydroxyguanin erkennt, verwendet wurde. Dar��berhinaus wurde der Einflu�� der jeweiligen Vorbehandlung auf die Bildung von Mikrokernen und auch deren Zytotoxizit��t untersucht. Au��erdem lag ein besonderes Augenmerk auch auf Untersuchungen von Effekten in humanen Lymphozyten in vivo.Bei den Untersuchungen an kultivierten S��ugerzellen zeigte sich bei keiner Substanz in dem untersuchten Konzentrationsbereich ein Einflu�� auf oxidative DNA-Sch��den. Lediglich bei MMPDCD war ein geringer, protektiver Effekt zu erkennen, der abh��ngig von der eingesetzten Konzentration war. Dagegen konnte die Induktion von Mikrokernen sowohl durch Pr��inkubation mit Vitamin C, EPA als auch mit MMPDCD effektiv verhindert werden, obwohl sie z.T. die spontane Mikrokernrate erh��hten. In den in vivo Studien hatte weder eine akute Gabe von Vitamin C noch eine dreimonatige Supplementation mit EPA einen Einflu�� auf die Untergrundspiegel oxidativer DNA-Sch��den in humanen Lymphozyten. Bei der Studie zum Einflu�� von chronischem Alkoholmi��brauch auf oxidative DNA-Sch��den in Lymphozyten fand sich in der Patientengruppe ein signifikant erh��hter Spiegel an Sch��den. Dieser erniedrigte sich nach erfolgter Entgiftung nicht auf das Niveau der Kontrollgruppe sondern erh��hte sich noch weiter.Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, da�� Vitamin C und EPA zwar in vitro einen teilweise protektiven Effekt haben, sich dieser aber nicht in vivo finden l����t. Au��erdem hat Ethanol eine sch��digende Wirkung auf den DNA-Schaden in vivo, was dem vielfach propagierten protektiven Effekt alkoholischer Getr��nke widerspricht.

Generierung und Prozessierung oxidativer DNA-Sch��den

Generierung und Prozessierung oxidativer DNA Sch��den --- Ziel dieser Arbeit war es, adaptive Antworten der Zellen auf einen DNA Sch��digung zu untersuchen. Hierzu wurden Experimente zur Reparatur oxidierter Basen (Substrate der Basen Exzisions Reparatur (BER)) oder von Pyrimidindimeren (Substrate der Nukleotid Exzisions Reparatur (NER)) nach einer Vorbehandlung mit DNA-sch��digender Agenzien durchgef��hrt. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl eine Vorbehandlung mit einer alkylierenden als auch mit einer oxidierenden Substanz zu einer adaptiven Erh��hung des zellul��ren Glutathionspiegels f��hrte, die 16 h nach der Sch��digung ihr Maximum erreichte. Jedoch waren die 8-oxoG Glykosylaseaktivit��ten ��ber einen Zeitraum von 18 h konstant. Diese Effekte waren unabh��ngig davon, ob Maus Embryofibroblasten, prim��re oder p53 profiziente menschliche Zellen verwendet wurden. Die BER war ebenfalls in keiner der verschiedenen Zelllinien signifikant verbessert. Die adaptive Antwort bez��glich der Glutathionspiegel war also nicht mit einer entsprechenden Ver��nderung bei der DNA-Reparatur verbunden. Folglich ist die Reparatur von oxidativen DNA-Sch��den durch eine vorausgehende Sch��digung nicht induzierbar. Der zweite Teil der Untersuchungen zu der Reparatur besch��ftigte sich mit der NER. Hierzu wurde die Reaktivierung eines mit UVB-Strahlung gesch��digten Plasmids untersucht. Als Wirtszellen fungierten prim��re menschliche Fibroblasten und Keratinozyten, die entweder mit UVB vorbehandelt oder ungesch��digt waren. Auch f��r die NER konnte keine signifikante Beschleunigung der Reparatur von Pyrimidindimeren durch eine Vorbehandlung festgestellt werden. Die Reaktivierung erfolgte ferner unabh��ngig vom p53-Status der Zellen, wie Versuche mit p53-siRNA zeigten. Neben der Prozessierung war die Generierung oxidativer DNA Sch��den Gegenstand der Arbeit. Die verwendete Substanz Tirapazamin (TPZ) ist ein f��r hypoxische Zellen selektives, neues Zytostatikum und befindet sich momentan in Phase 2/3 der klinischen Pr��fung. Ziel war es die von TPZ verursachten DNA Modifikationen zu charakterisieren, sowie die Toxizit��t und Genotoxizit��t zu untersuchen. Da es Hinweise auf eine Aktivierung von TPZ ��ber eine Oxidoreduktase (OR) gab, wurden die Experimente in Wildtyp und hOR ��berexprimierenden Zellen durchgef��hrt. Die Quantifizierung der verursachten DNA-Modifikationen zeigte, dass der von TPZ verursachte Schaden in Zellen mit hOR erh��ht war. Das erhaltene Schadensprofil der durch TPZ verursachten DNA-Modifikationen war dem Schadensprofil von durch Gamma-Strahlung intrazellul��r verursachten Hydroxylradikalen sehr ��hnlich. Da es nach der Aktivierung von TPZ durch eine OR zu einer Abspaltung von Hydroxylradikalen kommt, best��tigte dies den vermuteten Mechanismus. Weitere Untersuchungen mit t-Butanol, einem Hydroxylradikal F��nger, ergaben eine verminderte DNA-Sch��digung, was ebenfalls f��r eine DNA-Sch��digung durch Hydroxylradikale spricht. Untersuchungen zur Mutagenit��t zeigten das die Mutationsrate in Zellen mit hOR um das 4 fache erh��ht ist. Erstaunlich war jedoch, dass der im gleichen Ausma�� von Gamma-Strahlung verursachte DNA-Schaden f��r die beobachtete Toxizit��t dieser verantwortlich war, w��hrend bei TPZ unter den gleichen Bedingungen keine Toxizit��t vorlag. Erkl��rt werden k��nnte die erh��hte Toxizit��t und Mutagenit��t durch so genannte geclusterte DNA-Sch��den, die von Gamma-Strahlen, nicht jedoch von TPZ gebildet werden. Nach einer verl��ngerten Inkubation wurde sowohl f��r die Toxizit��t als auch f��r die Genotoxizit��t erneut ein verst��rkender Effekt durch die OR best��tigt. ��berraschend war weiterhin die von der OR unabh��ngige Generierung von Doppelstrangbr��chen, f��r die demnach ein grunds��tzlich anderer Mechanismus, wie zum Beispiel eine direkte Interaktion mit der Topoisomerase II, angenommen werden muss.

Einfluss von Chromatin-Modulatoren auf Bildung, Reparatur und Mutagenit��t von DNA-Sch��den

Die Entstehung von Mutationen, und somit der erste Schritt der Kanzerogenese, steht in engem Zusammenhang mit der Effektivit��t der DNA-Reparatur. Werden zur Fehlpaarung neigende (pr��mutagene) DNA-Sch��den, wie z.B. die oxidative L��sion 8-oxoG, zu langsam oder auch fehlerhaft repariert, so f��hrt dies zwangsl��ufig zu einer Erh��hung der Mutationsrate. Das Zusammenspiel zwischen Schadensentstehung und dessen Reparatur ist somit von gro��em Interesse. Ein wichtiger Faktor, der dieses Gleichgewicht beeinflussen k��nnte, ist die Chromatinstruktur, die entscheidend ist f��r die DNA-Zug��nglichkeit.rnrnDie Frage, ob und in welchem Ausma�� der globale Kondensationsgrad des Chromatins die Entstehung und Reparatur von DNA-Sch��den und damit die Entstehung von Mutationen beeinflusst, war der Ausgangspunkt f��r die vorliegende Arbeit. Um die Chromatinstruktur zu modulieren, wurden zum einen Resveratrol, zum anderen die HDAC-Inhibitoren Natriumbutyrat und Trichostatin A eingesetzt. Resveratrol f��hrt, m��glicherweise ��ber eine SIRT1-Aktivierung, zu einem kondensierten und schlecht zug��nglichen Chromatin. Die HDAC-Inhibitoren hingegen resultieren durch verst��rkte Acetylierung von Histonen in einer global dekondensierten, offenen Chromatinstruktur. Mit Hilfe des Photosensibilisators Ro19-8022 in Kombination mit sichtbarem Licht, UV-B-Strahlung und Wasserstoffperoxid wurden in so ver��nderten Zellen verschiedene Arten von DNA-Sch��den induziert, welche jeweils spezifisch sind f��r unterschiedliche Reparaturwege. Das Ausma�� induzierter L��sionen sowie deren Reparatur wurde mittels Alkalischer Elution und entsprechenden Reparaturendonukleasen bestimmt. rnrnDie Ergebnisse zeigen eine durch Resveratrol unbeeinflusste Schadensinduktion, andererseits jedoch eine deutliche Verlangsamung der Reparatur verschiedener Arten von DNA-L��sionen (oxidative L��sionen, Cyclobutanpyrimidindimere, Einzelstrangbr��che) und somit auch verschiedener Reparaturwege in AS52-Zellen. Die HDAC-Inhibitoren hingegen verursachen ein erh��htes Ausma�� induzierter L��sionen, jedoch keine ��nderung der Reparaturgeschwindigkeit. Die Entstehung spontaner und induzierter Mutationen zeigt sich durch Resveratrol unbeeinflusst, HDAC-Inhibitoren resultieren in signifikant erniedrigten Mutationsraten in AS52-Zellen. Letzterer Effekt ist durch die beobachteten Einfl��sse auf Reparatur und Suszeptibilit��t in den Zellen nicht erkl��rbar und bedarf einer mechanistischen Aufkl��rung. Die durch Resveratrol beobachtete Reparatur-Retardierung wurde mechanistisch weiter untersucht. Durch Inhibierung von SIRT1, einer durch Resveratrol aktivierten Deacetylase, konnte dessen Beteiligung an der Reparaturverlangsamung ausgeschlossen werden. Auch eine Beteiligung von oxidativem Stress, dem MAPK-Signalweg (ERK 1/2, p38) oder p53 konnte ausgeschlossen werden. Die Durchf��hrung der Reparaturversuche mit menschlichen HeLa-Zellen zeigten, dass die durch Resveratrol verursachten Effekte quantitativ stark zelltypabh��ngig sind. W��hrend die Reparatur in HeLa-Zellen deutlich weniger beeinflusst wird, sind dennoch andere Parameter wie Proliferation und Glutathionspiegel eher st��rker ver��ndert wie in AS52-Zellen. Der Mechanismus der durch Resveratrol verursachten Reparaturhemmung bedarf somit weiterer Untersuchungen.rn

Rolle der FOS-Proteine und des MAPK-Signallings in der Regulation der zellul��ren Antwort auf genotoxischen Stress

Die mittlere ��berlebenszeit nach Erkennung eines Glioblastoms ohne Behandlung liegt bei 3 Monaten und kann durch die Behandlung mit Temozolomid (TMZ) auf etwa 15 Monate gesteigert werden. Neben TMZ sind die chlorethylierenden Nitrosoharnstoffe die meistversprechendsten und am h��ufigsten eingesetzten Chemotherapeutika in der Gliomtherapie. Hier liegt die mittlere ��berlebenszeit bei 17,3 Monaten. Um die Therapie des Glioblastoms noch effektiver zu gestalten und Resistenzen zu begegnen, werden unterschiedlichste Ans��tze untersucht. Eine zentrale Rolle spielen hierbei das activator protein 1 (AP-1) und die mitogen aktivierten Proteinkinasen (MAPK), deren Funktion in bisherigen Arbeiten noch unzureichend beleuchtet wurde.rnBesonders mit der Rolle des AP-1-bildenden Proteins FRA-1 in der Therapie des Glioblastoms haben sich bisher nur wenige Arbeiten besch��ftigt, weshalb im ersten Teil der vorliegenden Arbeit dessen Funktion in der Regulation der Chemosensitivit��t gegen��ber dem chlorethylierenden Agenz ACNU genauer untersucht wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die FRA 1-Expression durch Behandlung mit ACNU induziert wird. Die Induktion erfolgte ��ber die beiden MAPKs ERK1/2 und p38K. JNK hatte keinen Einfluss auf die Induktion. Durch die Herunterregulation der FRA-1-Expression mit Hilfe von siRNA und eines shRNA exprimierenden Plasmids kam es zu einer signifikanten Sensitivierung gegen��ber ACNU. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Herunterregulation der FRA-1-Expression in einer verminderten AP 1-Bildung, bedingt durch eine reduzierte Menge an FRA-1 im AP-1-Komplex resultiert. Die Sensitivierung gegen��ber ACNU ist weder durch eine Ver��nderung in der DNA-Reparatur, noch in der Modulation der FAS-Ligand- bzw. FAS-Rezeptor-Expression bedingt. Auch die hier untersuchten BCL 2-Familienmitglieder wiesen keine Unterschiede in der Expression durch Modulation der FRA 1-Expression auf. Allerdings kam es durch die verminderte FRA-1-Expression zu einer Reduktion der Zellzahl in der G2/M-Phase nach Behandlung mit ACNU. Diese ging einher mit einer reduzierten Menge an phosphoryliertem und unphosphoryliertem CHK1, weshalb davon auszugehen ist, dass FRA 1 nach ACNU-Behandlung in Gliomzellen vor der Apoptose sch��tzt, indem es modulierend auf die Zellzykluskontrolle einwirkt.rnIm zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Regulation der apoptotischen Antwort nach Behandlung mit ACNU und TMZ genauer beleuchtet, wobei ein spezielles Augen��merk auf AP 1 und die MAPKs gelegt wurde. Hier konnte gezeigt werden, dass die Apoptose nach Behandlung mit ACNU bzw. TMZ sowohl durch Spaltung von Pro-Caspase 8, als auch Pro-Caspase 9 eingeleitet wird. Dabei akkumulierte in beiden F��llen p53 vermehrt im Zellkern. Eine Inhibierung der transkriptionellen Aktivit��t von p53 f��hrte nach ACNU-Behandlung zu einer Sensitivierung der Zellen, nach TMZ-Behandlung kam es zu einem leichten Anstieg in der Vit��lit��t. Der FAS-Rezeptor wurde nach ACNU- und nach TMZ-Behandlung aktiviert und auch die DNA-Reparaturproteine DDB2 und XPC wurden in beiden F��llen vermehrt exprimiert. F��r die MAPKs JNK und ERK1/2 konnte gezeigt werden, dass diese pro-apoptotisch wirken. Die AP-1-Bildung nach ACNU-Behandlung erfolgte bereits nach 24 h und war von langer Dauer, wohingegen nach TMZ-Behandlung nur eine transiente AP 1-Bildung zu relativ sp��ten Zeitpunkten detektiert werden konnte. Ebenso konnte f��r das AP-1-Zielgen FAS-Ligand nach ACNU-Behandlung eine relativ schnelle, lang anhaltende Aktivierung detektiert werden, wohingegen nach TMZ-Behandlung zu einem sp��ten Zeitpunkt ein kurzer Anstieg im Signal zu verzeichnen war. In sp��teren Experimenten konnte gezeigt werden, dass das BCL-2-Familienmitglied BIM eine zentrale Rolle in der Regulation des intrinsischen Apoptosesignalweges nach Behandlung mit ACNU und TMZ spielt. Die hier entstanden Ergebnisse tragen entscheidend zum Verst��ndnis der durch diese beiden Agenzien gesteuerten, apoptotischen Signalwege bei und bieten eine fundierte Grundlage f��r weitere Untersuchungen.rn

Effects of physical exercise training in DNA damage and repair - could the difference be in hOGG1 Ser326Cys polymorphism?

Acute physical exercise is associated with increased oxygen consumption, which could result in an increased formation of reactive oxygen species (ROS). ROS can react with several organic structures, namely DNA, causing strand breaks and a variety of modified bases in DNA. Physical exercise training seems to decrease the incidence of oxidative stress-associated diseases, and is considered as a key component of a healthy lifestyle. This is a result of exercise-induced adaptation, which has been associated with the possible increase in antioxidant activity and in oxidative damage repair enzymes, leading to an improved physiological function and enhanced resistance to oxidative stress (Radak et al. 2008). Human 8-oxoguanine DNA glycosylase 1 (hOGG1) is involved in the base excision repair (BER) pathway and encodes an enzyme responsible for removing the most common product of oxidative damage in DNA, 8-hydroxyguanine (8-OH-G). The genetic polymorphism of hOGG1 at codon 326 results in a serine (Ser) to cysteine (Cys) amino acid substitution (Ser326Cys). It has been suggested that the carriers of at least one hOGG1Cys variant allele exhibit lower 8-OH-G excision activity than the wild-type (Wilson et al. 2011). The aim of this study was to investigate the possible influence of hOGG1 Ser326Cys polymorphism on DNA damage and repair activity in response to 16 weeks of combined physical exercise training, in thirty healthy Caucasian men. Comet assay was carried out using peripheral blood lymphocytes and enabled the evaluation of DNA damage, both strand breaks and FPG-sensitive sites, and DNA repair activity. Genotypes were determined by PCR-RFLP analysis. The subjects with Ser/Ser genotype were considered as wild-type group (n=20), Ser/Cys and Cys/Cys genotype were analyzed together as mutant group (n=10). Regarding differences between pre and post-training in the wild-type group, the results showed a significant decrease in DNA strand breaks (DNA SBs) (p=0.002) and also in FPG-sensitive sites (p=0.017). No significant differences were observed in weight (p=0.389) and in lipid peroxidation (MDA) (p=0.102). A significant increase in total antioxidant capacity (evaluated by ABTS) was observed (p=0.010). Regarding mutant group, the results showed a significant decrease in DNA SBs (p=0.008) and in weight (p=0.028). No significant differences were observed in FPG-sensitive sites (p=0.916), in ABTS (p=0.074) and in MDA (p=0.086). No significant changes in DNA repair activity were observed in both genotype groups. This preliminary study suggests the possibility of different responses in DNA damage to physical exercise training, considering the hOGG1 Ser326Cys polymorphism.

Le r��le du stress oxydant dans les changements ��pig��n��tiques contribuant aux complications du syndrome m��tabolique.

La m��thylation de l'ADN est l'une des modifications ��pig��n��tiques au niveau des ��lots CpG. Cette modification ��pig��n��tique catalys��e par les ADN m��thyltransf��rases (DNMTs) consiste en la m��thylation du carbone 5' d���une cytosine ce qui aboutit �� la formation de 5-m��thylcytosine. La m��thylation de l'ADN est clairement impliqu��e dans l'inactivation des g��nes et dans l'empreinte g��n��tique. Elle est modul��e par la nutrition, en particulier par les donneurs de m��thyle et par une restriction prot��ique. Ces modifications ��pig��n��tiques persistent plus tard dans la vie et conduisent au d��veloppement de nombreuses pathologies telles que le syndrome m��tabolique et le diab��te de type 2. En fait, de nombreux g��nes cl��s subissent une modification de leur ��tat de m��thylation en pr��sence des composants du syndrome m��tabolique. Cela montre que la m��thylation de l'ADN est un processus important dans l'��tiologie du syndrome m��tabolique. Le premier travail de ce doctorat a port�� sur la r��daction d���un article de revue qui a examin�� le cadre central du syndrome m��tabolique et analyser le r��le des modifications ��pig��n��tiques susceptibles d'influer sur l'apparition du stress oxydant et des complications cardiom��taboliques. D���autre part, les cellules intestinales Caco-2/15, qui ont la capacit�� de se diff��rencier et d���acqu��rir les caract��ristiques physiologiques de l'intestin gr��le, ont ��t�� utilis��es et trait��es avec du Fer-Ascorbate pour induire un stress oxydant. Le Fer-Ascorbate a induit une augmentation significative de l���inflammation et de la peroxydation des lipides (malondialdehyde) ainsi que des alt��rations de de la d��fense antioxydante (SOD2 et GPx) accompagn��es de modifications ��pig��n��tiques. De plus, la pr��-incubation des cellules avec de la 5-aza-2'-d��soxycytidine, un agent de d��m��thylation et/ou l���antioxydant Trolox a normalis�� la d��fense antioxydante, r��duit la peroxydation des lipides et pr��venu l'inflammation. Ce premier travail a d��montr�� que les modifications du redox et l���inflammation induites par le Fer-Ascorbate peuvent impliquer des changements ��pig��n��tiques, plus particuli��rement des changements dans la m��thylation de l���ADN. Pour mieux d��finir l���impact du stress oxydant au niveau nutritionnel, des cochons d���Inde ��g��s de trois jours ont ��t�� s��par��s en trois groupes : 1) T��moins: alimentation r��guli��re; 2) Nutrition parent��rale (NP) 3) H2O2 : T��moins + 350 uM H2O2. Apr��s quatre jours, pour un groupe, les perfusions ont ��t�� stopp��es et les animaux sacrifi��s pour la collecte des foies. Pour l���autre groupe d���animaux, les perfusions ont ��t�� arr��t��es et les animaux ont eu un acc��s libre �� une alimentation r��guli��re jusqu'�� la fin de l�����tude, huit semaines plus tard o�� ils ont ��t�� sacrifi��s pour la collecte des foies. Ceci a d��montr�� qu����� une semaine de vie, l'activit�� DNMT et les niveaux de 5'-m��thyl-2'-d��soxycytidine ��taient inf��rieurs pour les groupes NP et H2O2 par rapport aux t��moins. A neuf semaines de vie, l���activit�� DNMT est rest��e basse pour le groupe NP alors que les niveaux de 5'-m��thyl-2'-d��soxycytidine ��taient plus faibles pour les groupes NP et H2O2 par rapport aux t��moins. Ce travail a d��montr�� que l'administration de NP ou de H2O2, t��t dans la vie, induit une hypom��thylation de l'ADN persistante en raison d'une inhibition de l'activit�� DNMT. Finalement, des souris ayant re��u une di��te riche en gras et en sucre (HFHS) ont ��t�� utilis��es comme mod��le in vivo de syndrome m��tabolique. Les souris ont ��t�� nourris soit avec un r��gime standard chow (t��moins), soit avec une di��te riche en gras et en sucre (HFHS) ou avec une di��te HFHS en combinaison avec du GFT505 (30 mg/kg), un double agoniste de PPAR�� et de PPAR��, pendant 12 semaines. La di��te HFHS ��tait efficace �� induire un syndrome m��tabolique ��tant donn��e l���augmentation du poids corporel, du poids h��patique, des adiposit��s visc��rales et sous-cutan��es, de l���insensibilit�� �� l���insuline, des lipides plasmatiques et h��patiques, du stress oxydant et de l���inflammation au niveau du foie. Ces perturbations ��taient accompagn��es d���une d��ficience dans l���expression des g��nes h��patiques PPAR�� et PPAR�� concomitant avec une hyperm��thylation de leurs promoteurs respectifs. L���ajout de GFT505 �� la di��te HFHS a emp��ch�� la plupart des effets cardiom��taboliques induits par la di��te HFHS via la modulation n��gative de l���hyperm��thylation des promoteurs, r��sultant en l���augmentation de l���expression des g��nes h��patiques PPAR�� et PPAR��. En conclusion, GFT505 exerce des effets m��taboliques positifs en am��liorant le syndrome m��tabolique induit par l'alimentation HFHS via des modifications ��pig��n��tiques des g��nes PPARs. Ensemble, les travaux de cette th��se ont d��montr�� que le stress oxydant provenant de la nutrition induit d���importants changements ��pig��n��tiques pouvant conduire au d��veloppement du syndrome m��tabolique. La nutrition apparait donc comme un facteur crucial dans la pr��vention de la reprogrammation f��tale et du d��veloppement du syndrome m��tabolique. Puisque les m��canismes sugg��rent que le stress oxydant agit principalement sur les m��tabolites du cycle de la m��thionine pour alt��rer l�����pig��n��tique, une suppl��mentation en ces mol��cules ainsi qu���en antioxydants permettrait de restaurer l�����quilibre redox et ��pig��n��tique.

Evidence that OGG1 glycosylase protects neurons against oxidative DNA damage and cell death under ischemic conditions

7,8-Dihydro-8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) is a major DNA glycosylase involved in base-excision repair (BER) of oxidative DNA damage to nuclear and mitochondrial DNA (mtDNA). We used OGG1-deficient (OGG1(-/-)) mice to examine the possible roles of OGG1 in the vulnerability of neurons to ischemic and oxidative stress. After exposure of cultured neurons to oxidative and metabolic stress levels of OGG1 in the nucleus were elevated and mitochondria exhibited fragmentation and increased levels of the mitochondrial fission protein dynamin-related protein 1 (Drp1) and reduced membrane potential. Cortical neurons isolated from OGG1(-/-) mice were more vulnerable to oxidative insults than were OGG1(+/+) neurons, and OGG1(-/-) mice developed larger cortical infarcts and behavioral deficits after permanent middle cerebral artery occlusion compared with OGG1(+/+) mice. Accumulations of oxidative DNA base lesions (8-oxoG, FapyAde, and FapyGua) were elevated in response to ischemia in both the ipsilateral and contralateral hemispheres, and to a greater extent in the contralateral cortex of OGG1(-/-) mice compared with OGG1(+/+) mice. Ischemia-induced elevation of 8-oxoG incision activity involved increased levels of a nuclear isoform OGG1, suggesting an adaptive response to oxidative nuclear DNA damage. Thus, OGG1 has a pivotal role in repairing oxidative damage to nuclear DNA under ischemic conditions, thereby reducing brain damage and improving functional outcome. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism (2011) 31, 680-692; doi:10.1038/jcbfm.2010.147; published online 25 August 2010

Expression of 8-oxoguanine Glycosylase in Human Fetal Membranes

Problem The most common DNA lesion generated by oxidative stress (OS) is 7, 8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG) whose excision repair is performed by 8-oxoguanine glycosylase (OGG1). We investigated OGG1 expression changes in fetal membranes from spontaneous preterm birth (PTB) and preterm premature rupture of the membranes (pPROM) and its changes in vitro in normal fetal membranes exposed to OS inducer water-soluble cigarette smoke extract (CSE). Method of study DNA damage was determined in amnion cells treated with CSE by comet and FLARE assays. OGG1 mRNA expression and localization in fetal membranes from clinical specimens and in normal term membranes exposed to CSE were examined by QRT-PCR and by immunohistochemistry. Results DNA strand and base damage was seen in amnion cells exposed to CSE. OGG1 expression was 2.5-fold higher in PTB samples compared with pPROM (P=0.045). No significant difference was seen between term and pPROM or PTB and term. CSE treatment showed a nonsignificant decrease in OGG1. OGG1 was localized to both amnion and chorion with less intense staining in pPROM and CSE-treated membranes. Conclusion Increased OS-induced DNA damage predominated by 8-oxoG is likely to persist in fetal cells due to reduced availability of base excision repair enzyme OGG1. This can likely lead to fetal cell senescence associated with some adverse pregnancy outcome.

Effects of metal-induced oxidative stress on endothelial cells in vitro

Aseptic loosening of metal implants is mainly attributed to the formation of metal degradation products. These include particulate debris and corrosion products, such as metal ions (anodic half-reaction) and ROS (cathodic half-reaction). While numerous clinical studies describe various adverse effects of metal degradation products, detailed knowledge of metal-induced cellular reactions, which might be important for possible therapeutic intervention, is not comprehensive. Since endothelial cells are involved in inflammation and angiogenesis, two processes which are critical for wound healing and integration of metal implants, the effects of different metal alloys and their degradation products on these cells were investigated. Endothelial cells on Ti6Al4V alloy showed signs of oxidative stress, which was similar to the response of endothelial cells to cathodic partial reaction of corrosion induced directly on Ti6Al4V surfaces. Furthermore, oxidative stress on Ti6Al4V alloy reduced the pro-inflammatory stimulation of endothelial cells by TNF-�� and LPS. Oxidative stress and other stress-related responses were observed in endothelial cells in contact with Co28Cr6Mo alloy. Importantly, these features could be reduced by coating Co28Cr6Mo with a TiO2 layer, thus favouring the use of such surface modification in the development of medical devices for orthopaedic surgery. The reaction of endothelial cells to Co28Cr6Mo alloy was partially similar to the effects exerted by Co2+, which is known to be released from metal implants. Co2+ also induced ROS formation and DNA damage in endothelial cells. This correlated with p53 and p21 up-regulation, indicating the possibility of cell cycle arrest. Since CoCl2 is used as an hypoxia-mimicking agent, HIF-1��-dependence of cellular responses to Co2+ was studied in comparison to anoxia-induced effects. Although important HIF-1��-dependent genes were identified, a more detailed analysis of microarray data will be required to provide additional information about the mechanisms of Co2+ action. All these reactions of endothelial cells to metal degradation products might play their role in the complex processes taking place in the body following metal device implantation. In the worst case this can lead to aseptic loosening of the implant and requirement for revision surgery. Knowledge of molecular mechanisms of metal-induced responses will hopefully provide the possibility to interfere with undesirable processes at the implant/tissue interface, thus extending the life-time of the implant and the overall success of metal implant applications.

Mechanistic study of the effects of 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) on reporter gene expression in mammalian cells

DNA damage causes replication errors, leading to genetic instability or cell death. Besides that, many types of DNA base modifications have been shown to interfere with transcriptional elongation if they are located in the transcribed DNA strand of active genes, acting as roadblocks for RNA polymerases. It is widely assumed that transcription blockage by endogenous DNA damage is responsible for the early cell senescence in organs and accelerated ageing observed in individuals with compromised nucleotide excision repair.rnThe aims of this work were to design new experimental systems for testing transcription blocking potentials of DNA base modifications in an individual gene and to apply these test systems to the investigation of the effects of a frequent endogenously generated base modification, namely 8-oxo-7,8-hydroxyguanine (8-oxoG), on the gene transcription in cells. Several experimental strategies were employed for this purpose. First, I constructed an episomal vector encoding for a short-lived EGFP-ODC fusion protein and measured expression of the reporter gene in permanently transfected clonal cell lines exposed to DNA damaging agents. Second, the expression of plasmid-borne EGFP gene damaged with photosensitisers to obtain one or several oxidative purine modifications per plasmid molecule was determined in transiently transfected human and mouse host cells in an approach known as ���host cell reactivation���. As a prerequisite for these experiments, a robust method of precise quantitative measurement of the EGFP gene expression in transiently transfected cells by flow cytometry was developed and validated. Third, I elaborated a very efficient procedure for insertion of synthetic oligonucleotides carrying 8-oxoG into plasmid DNA, avoiding any unwanted base damage and strand breaks. The consequences of 8-oxoG placed in defined positions in opposing DNA strands of the EGFP gene for transcription were measured by host cell reactivation in cells with functional 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) gene and in OGG1 null cells.rnThe results obtained in Ogg1-/- cells demonstrated that unrepaired 8-oxoG, even if situated in the transcribed DNA strand, does not have any negative effect on the reporter gene transcription. On the other hand, as few as one 8-oxoG was sufficient to cause a significant decrease of the gene expression in OGG1-proficient cell lines, i.e. in the presence of base excision repair. For two analysed positions of 8-oxoG in the plasmid DNA, the inhibition of gene transcription by the base modification correlated with the efficiency of its excision by purified OGG1 protein under cell-free conditions. Based on these findings, it has to be concluded that the observed decrease of transcription is mediated by excision of the base modification by OGG1 and probably caused by the repair-induced single-strand breaks. The mechanism of transcription inhibition by 8-oxoG is therefore clearly distinct from stalling of elongating RNA polymerase II complexes at the modified base.

Synthese und pr��klinische Evaluation von neuen antioxidativen Substanzen zur Neuroprotektion

Oxidativer Stress ist seit ��ber 25 Jahren als ein Charakteristikum vieler pathologischer Prozesse bekannt. Helmut Sies beschrieb bereits in den 1980er Jahren oxidativen Stress als St��rung in der prooxidativ ��� antioxidativen Balance zugunsten der prooxidativen Seite, wodurch es potentiell zu Sch��den in verschiedenen Geweben kommt. Oxidativer Stress tritt sowohl bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und zerebraler Isch��mie, bei peripheren Erkrankungen wie Arteriosklerose, als auch beim Alterungsprozess per se auf und wird als Ursache oder zumindest als ein krankheitsf��rdernder Faktor diskutiert. Die in in vitro-Experimenten als vielversprechend antioxidativ getesteten Substanzen (meist phenolhaltig) ergaben in mehreren klinischen Studien keinen signifikanten Vorteil. Um die Ursachen dieser Ergebnisse n��her zu analysieren, wurde in der vorliegenden Arbeit auf Basis des cytoprotektiven Phenothiazins, einem aromatischen trizyklischen Amin, der Einfluss von verschiedenen Substituenten im Hinblick auf Lipophilie, Radikalstabilisierung und L��slichkeit des Molek��ls chemisch vorhergesagt. Anhand dieser in silicio Struktur-Wirkungs-Beziehung wurden anschlie��end neue Modellsubstanzen synthetisiert, welche sich systematisch in den drei zuvor genannten Parametern unterschieden. Dies wurde durch Substitution von unterschiedlich langen Fetts��ureketten, von l��slichkeitsbeeinflussenden funktionellen Gruppen, oder durch Anellierung zus��tzlicher aromatischer Ringe erreicht. In den folgenden Versuchen zu antioxidativer Kapazit��t, zellul��rem ��berleben, Lipidperoxidation und Proteinoxidation zeigte sich, dass mit gesteigerter Stabilit��t der korrespondierenden Radikale und mit wachsender Lipophilie die antioxidativ cytoprotektive Aktivit��t der neuen Derivate bis zu einer gewissen Grenze (logP ��� 7) signifikant zunahm; ��ber diesen Wert hinaus sank die Effektivit��t wieder ab. Benzanellierte Phenothiazine entwickelten mit EC50-Werten von ungef��hr 8-10 nM die h��chste mittlere effektive Wirkkonzentration in oxidativ gesch��digten, klonalen hippocampalen Neuronen (HT-22 Zellen). Dies entspricht einer etwa 20-fachen Verbesserung gegen��ber ��-Tocopherol, welches bisher als bestes nat��rliches lipophiles Antioxidans angesehen wurde. Im Vergleich zu Phenothiazin erreichen die neuen Antioxidantien immerhin eine h��here Effektivit��t um den Faktor 4. Folglich sind es sowohl Aspekte der L��slichkeit und der Distribution, welche die Potenz der gegenw��rtigen Antioxidantien limitieren als auch Aspekte der Radikalstabilisierung, die Einfluss auf die prim��re Wirksamkeit nehmen. Dieses Wissen sollte beim zuk��nftigen Design neuer, antioxidativ potenter Molek��le im Hinblick auf ihren langfristigen Einsatz bei neurodegenerativen Erkrankungen von Nutzen sein.

Mechanismen der Resistenz und Sensitivierung von menschlichen malignen Melanomzellen gegen��ber DNA-alkylierenden Zytostatika

Das metastasierende maligne Melanom ist durch eine geringe p53-Mutations-Rate und eine hohe Resistenz gegen��ber Chemotherapie mit alkylierenden Agenzien wie Fotemustin (FM) und Temozolomid (TMZ) gekennzeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von p53 in der Resistenz von malignen Melanomzellen gegen��ber FM untersucht und M��glichkeiten zur Sensitivierung von Melanomzellen gegen��ber TMZ und FM aufgezeigt.rnAusgangspunkt war die Beobachtung, dass p53 Wildtyp (p53wt) Melanomzellen resistenter gegen��ber FM sind als p53 mutierte (p53mt) Zellen. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass eine FM-Behandlung in p53wt Zellen eine Stabilisierung von p53 und eine Induktion des p53-Zielproteins p21 bewirkte. Mithilfe einer p53wt Zelllinie, welche einen p53 Knockdown tr��gt, konnte gezeigt werden, dass p53 f��r die geringe Apoptose-Rate nach FM-Behandlung verantwortlich ist. Eine Untersuchung der Interstrang-Crosslink (ICL)-Reparaturkapazit��t zeigte, dass p53mt Zellen im Gegensatz zu p53wt Zellen nicht in der Lage sind, FM-induzierte ICL zu reparieren. Dies ging mit einer im Vergleich zu p53wt Zellen starken DNA-Schadensantwort einher. Die Gene f��r die Proteine DDB2 und XPC wurden als durch FM regulierte DNA-Reparatur-Gene identifiziert, deren Induktion p53-abh��ngig und lang anhaltend (bis zu 144 h) erfolgt. Da XPC Knockdown-Zellen sensitiver als ihre Kontrollzellen gegen��ber FM reagierten, konnte die biologische Relevanz von XPC bei der ICL-Reparatur best��tigt werden. Anhand von Xenograft-Tumoren wurde gezeigt, dass FM auch in situ eine Induktion von DDB2 und XPC ausl��st. Die Beobachtung, dass DNA-Reparatur-Gene nach FM-Behandlung hochreguliert werden, liefert eine Erkl��rung f��r das schlechte Ansprechen von Melanomen auf eine Therapie mit ICL-induzierenden Chemotherapeutika.rnDes Weiteren befasste sich die vorliegende Arbeit mit M��glichkeiten zur Sensitivierung von Melanomzellen gegen��ber den Chemotherapeutika TMZ und FM. In diesem Zusammenhang wurde Valproins��ure (VPA), ein in der Epilepsie-Therapie verwendetes Medikament und Histondesacetylase (HDAC)-Hemmer, bez��glich der chemosensitivierenden Wirkung untersucht. Zun��chst konnte der in der Literatur h��ufig beschriebene stabilisierende Effekt von VPA auf ���wildtypisches��� p53-Protein und destabilisierende Effekt auf mutiertes p53-Protein best��tigt werden. Zwei der vier untersuchten Zelllinien konnten mithilfe von VPA gegen��ber TMZ sensitiviert werden, w��hrend nur eine der vier untersuchten Zelllinien gegen��ber FM sensitiviert werden konnte. VPA beg��nstigt die Induktion von Apoptose, w��hrend der Effekt auf die Induktion von Nekrose nur gering ausfiel. Eine Wirkung von VPA auf die Aktivit��t des Resistenz-vermittelnden Enzyms O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) wurde nicht beobachtet. Zudem wurde ausgeschlossen, dass die Sensitivierung gegen��ber TMZ und FM, welche S-Phase abh��ngige Gentoxine sind, auf einer VPA-induzierten Erh��hung der Proliferation beruht. Mithilfe einer Zelllinie, welche stabil dominant-negatives FADD (Fas-associated death domain) exprimiert, konnten keine Hinweise auf eine Beteiligung des extrinsischen Apoptose-Signalwegs an der VPA-vermittelten Sensitivierung gewonnen werden. Gleichzeitig wurde gezeigt, dass VPA keine Induktion der niedrig exprimierten Procaspase-8 verursachte. Mithilfe eines PCR-Arrays wurden transaktivierende und ���reprimierende Effekte von VPA auf die Genexpression gezeigt, wobei das proapoptotische Protein BAX (Breakpoint cluster-2-associated x protein) als ein in der Sensitivierung involviertes Kandidatengen identifiziert wurde. Obwohl eine vollst��ndige Aufkl��rung der dem Sensitivierungseffekt von VPA zu Grunde liegenden Mechanismen nicht erbracht werden konnte, zeigen die in dieser Arbeit erlangten Beobachtungen einen vielversprechenden Weg zur ��berwindung der Resistenz von Melanomzellen gegen��ber DNA-alkylierenden Zytostatika auf.rn